反义RhoC基因对胆管癌QBC939细胞株基质金属蛋白酶-9的抑制作用

目的 探讨反义RhoC基因对胆管癌QBC939细胞株的金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响.方法 通过质粒转染的方法向QBC939细胞中转染反义RhoC cDNA真核表达载体pcDNA 3.1Hyp(+)质粒,RT-PCR和Western-Blot检测MMP-9在QBC939细胞、转染空载体的QBC939细胞(QBC939-V)、转染反义RhoC的QBC939细胞(QBC939-AS)的mRNA和蛋白相对表达量.结果 对照组细胞QBC939中MMP-9 mRNA和蛋白的平均光密度值分别为(0.265±0.059)和(0.242±0.063),QBC939-V细胞中MMP-9 mRNA和蛋白的平均光密度值分别为(0.257±0.039)和(0.303±0.031),而反义RhoC cDNA质粒转染组细胞中MMP-9 mRNA和蛋白的平均光密度值分别为(0.125±0.062)和(0.095±0.043);对照组中MMP-9 mRNA和蛋白的平均光密度值均高于反义RhoC转染组,统计学分析表明在QBC939-AS组和对照组之间,MMP-9的平均光密度值差异有统计学意义(P<0.05).结论 反义RhoC基因在QBC939细胞株中可以抑制MMP-9表达.     

反义RhoC基因对胆管癌QBC939细胞株基质金属蛋白酶－2的抑制作用

目的 观察反义RhoC基因对胆管癌QBC939细胞株的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达的影响.方法 将反义RhoC真核表达载体转染人胆管癌细胞株QBC939,逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测MMP-2在QBC939细胞、转染空载体的QBC939细胞(QBC939-V)、转染反义RhoC的QBC939细胞(QBC939-AS)的mRNA和蛋白相对表达量.结果 QBC939细胞MMP－2 mRNA吸光度相对值为0.588±0.074,QBC939-V细胞为0.629±0.061,两者差异无统计学意义(P＞0.05),QBC939-AS细胞MMP-2 mRNA吸光度相对值为0.286±0.097;与QBC939及QBC939－V比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 反义RhoC基因能够抑制QBC939细胞株的MMP-2表达.     

神经生长因子对人胆管癌细胞体外侵袭力影响的研究

目的 探讨神经生长因子对人胆管癌细胞株QBC939体外侵袭力的影响。方法 构建β-NGF的真核表达载体pcDNA3．0-NGF,经酶切鉴定后,采用脂质体Lipofectamine转染人胆管癌细胞株QBC939,Western blot检测蛋白的表达情况,Transwell小室检测转染前后细胞侵袭力的变化情况。结果 成功构建β-NGF的真核表达载体pcDNA3．0-NGF,转染QBC939细胞后,能够稳定表达β-NGF蛋白,且表达强度随转染质粒浓度增强而增强,与对照组相比,差异有统计学意义（P〈0．01）,Transwell小室检测转染后胆管癌细胞侵袭力增强,与空白对照组和转染空质粒组相比,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论 NGF具有增强胆管癌细胞株QBC939体外侵袭力的作用,可能导致胆管癌的神经浸润与转移。     

突变型ⅠkBα转染对肝门部胆管癌多药耐药基因的调控作用

目的 探讨阻断核转录因子-kB(NF-kB)活性对肝门部胆管癌细胞多药耐药基因(MDR-1)表达的影响。方法用突变核转录因子-kB抑制蛋白αⅠkBα质粒(mⅠ-kBa)转染肝门部胆管癌细胞株(QBC939)及稳定表达丙型肝炎病毒核心蛋白(HCVC)的QBC939(QBC939HCVC )，凝胶迁移率电泳(EMSA)检测mⅠkBa质粒转染的QBC939和QBC939HCVC 细胞中NF-kB DNA结合活性；逆转录-多聚酶链反应(RT—PCR)检测转染m-Ⅰ kBa质粒对肝门部胆管癌细胞中MDR-1基因及其表达产物(P—GP)表达的影响。结果 转染mⅠkBa质粒组的QBC939和QBC939HCVC 细胞放射性浓聚影明显淡于非转染组，密度计成对扫描显示，转染组和非转染组相对信号密度有明显差异；转染突变型ⅠkBa质粒的QBC939和QBC939HCVC 细胞中MDR-1mRNA和蛋白的表达水平明显低于非转染组。结论 转染mⅠkBa能明显逆转肝门部胆管癌细胞多药耐药性。阻断NF—kB活性有望成为肝门部胆管癌基因治疗新策略的“靶位”。     

癌胚抗原相关细胞黏附分子-6在人肝门部胆管癌细胞株QBC939中的表达及其在侵袭转移中的作用

目的 观察癌胚抗原相关细胞黏附分子-6(CEACAM6)在人肝门部胆管癌细胞株QBC939中的表达,探讨其在侵袭转移中的作用.方法 实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测CEACAM6在QBC939细胞中的表达;构建CEACAM6的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,并感染QBC939细胞,Real-time PCR验证RNAi效果;Transwell侵袭试验检测QBC939细胞体外侵袭力的改变.结果 CEACAM6在QBC939细胞中高表达.成功构建CEACAM6基因RNAi慢病毒载体并转染QBC939细胞.和对照组比较,RNAi组CEACAM6 mRNA表达抑制率为93.1％ (P ＜0.05);Tran-swell实验提示RNAi后,侵袭细胞OD570 RNAi组(0.09 ±0.01)明显少于对照组(0.13 ±0.02),侵袭抑制率为69.2％ (P ＜0.05).结论 CEACAM6在QBC939细胞中高表达,其表达程度与肝门部胆管癌细胞侵袭转移能力呈正相关.     

人RhoC基因正、反义真核表达载体的构建及对肿瘤增殖的影响

目的构建人RhoC基因正、反义真核表达载体，研究RhoC基因对胆管癌QBC939细胞株增殖的影响。方法应用分子克隆技术，用KpnⅠ和BamHⅠ双限制性内切酶从RhoC基因切下所需目的片段，然后将该片段正、反向定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1／Hyg（＋）上，构建正、反义RhoC cDNA真核表达载体，以脂质体转染人胆管癌QBC939细胞，检测细胞生长曲线。结果经测序鉴定，将正、反义目的片段成功的连接到pcDNA3.1／Hyg（＋）载体上。结果序列测定证实RhoC基因正、反义.真核表达载体成功构建，反义RhoC基因抑制QBC939细胞增殖，正义RhoC基因促进QBC939细胞增殖。结论成功地将RhoC目的片段正、反向插入到pcDNA3．1／Hyg（＋）中，构建了人RhoC正、反义表达真核载体，RhoC基因调控QBC939细胞增殖。     

HCV核心基因转染的胆管癌细胞中p53的表达及意义

目的：探讨丙肝病毒感染在胆管癌中的致癌机理。方法：通过分子克隆技术构建HCV－C基因重组质粒（PBK－HCVc)，经酶切鉴定后，将其转染到胆管癌细胞（QBC939）中，经G418选择培养，免疫细胞学，Western blotting鉴定其表达，透射电镜观察细胞形态学改变。并用免疫细胞学检测p53的表达。结果：构建的PBK－HCVc质粒在QBC939细胞中有稳定表达，透射电镜见胞质空泡内球型病毒颗粒，病毒颗粒直径50－80nm，有外膜结构。HCV核心基因转染后QBC939细胞的p53表达比转染前明显增多（P＜0．01）。结论：本实验为进一步探讨丙肝病毒感染与肝门部胆管癌中的致癌机理提供了理想的细胞株模型，HCV核心基因可诱发p53突变，可能与丙肝病毒感染的胆管细胞癌变有关。     

反义DNMT3b基因真核表达载体转染对人胆管癌细胞DNMT3b基因表达的影响

目的观察反义DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)基因真核表达载体转染对人胆管癌QBC939细胞中DNMT3b基因表达的影响。方法构建反义DNMT3b基因真核表达载体,通过脂质体转染到人胆管癌细胞株QBC939中,G418筛选得到稳定转染细胞株,PCR鉴定外源性neoR基因在转染细胞中的表达以确定转染是否成功。半定量RTPCR观察转染前后DNMT3b基因mRNA水平的变化,流式细胞术检测转染前后DNMT3b蛋白的变化。结果反义DNMT3b基因真核表达载体转染能使人胆管癌QBC939细胞中DNMT3b基因的mRNA水平从0.956±0.053降低至0.209±0.023,差异有统计学意义(P<0.01);流式细胞术检测结果显示,DNMT3b蛋白水平从(75.38±3.22)%降低到(29.87±3.46)%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论反义DNMT3b基因转染能降低人胆管癌QBC939细胞中DNMT3b基因的表达水平,为研究DNMT3b基因功能及其在胆管癌细胞中的作用提供了方法和实验依据。     

RNA干扰诱导型一氧化氮合酶基因表达对人胆管癌细胞生长的影响

目的:探讨RNA干扰诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的表达对人胆管癌细胞生长的影响。方法:针对iNOS设计并合成3种iNOS-siRNA序列(siRNA1、siRNA2、siRNA3)及阴性对照siRNA序列后,分别转染人胆管癌细胞QBC939细胞,用荧光显微镜下观察转染效率,通过iNOS mRNA与蛋白的变化分析干扰效果,选择干扰效果最为明显的iNOS-siRNA序列,观察其干扰后QBC939细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的变化。实验以无处理的QBC939细胞为空白对照。结果:合成的3种iNOS-siRNA序列均可有效转染人胆管癌QBC939细胞,且转染后均能明显降低QBC939细胞中iNOS mRNA与蛋白的表达(均P0.05),其中siRNA2对iNOS的抑制作用最为明显,阴性对照siRNA序列对QBC939细胞中iNOS mRNA与蛋白的表达无明显影响(均P0.05)。转染siRNA2后,QBC939细胞增值明显降低、出现明显的G0/G1期阻滞、凋亡率明显增加(均P0.05);转染阴性对照siRNA序列的QBC939细胞无上述改变(均P0.05)。结论:RNA干扰能有效降低iNOS基因在胆管癌细胞中的表达,从而抑制胆管癌细胞的增殖,并促进其凋亡。     

反义抑制PTTG对胆管癌细胞株QBC939中VEGF表达的影响

目的：探讨抑制垂体瘤转化基因（PTTG）表达后对血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法：将已构建好的反义PTTG真核表达载体pcDNA3.1-PTTGas按浓度梯度转染至胆管癌细胞株QBC939中，培养48h后利用RT-PCR和Western Blot方法检测PTTG和VEGF表达量的变化，并将两者的变化行直线相关分析。结果：成功转染反义PTTG至QBC939中;转染后PTTG和VEGF在mRNA水平最大抑制率分别为40.62%和34.14%;在蛋白质水平分别为55.55%和38.46%。在mRNA和蛋白质两个层面上均下降，呈线性正关系(r=0.970,0.985,P<0.05)。结论：反义阻断胆管癌细胞株中的PTTG表达能使VEGF的表达下降，下降程度呈正相关。     

胆管癌细胞系QBC939裸鼠肝门部胆管原位种植瘤模型的建立

目的建立胆管癌细胞系QBC939裸鼠肝门部胆管原位种植瘤模型并观察淋巴引流情况。方法应用我们前期建立的肝门部胆管癌细胞系QBC939,行裸鼠背部皮下接种,建立高转移特性胆管癌裸鼠皮下种植瘤模型,然后将高转移性种植瘤组织接种于裸鼠肝门部胆管与门静脉间组织间隙紧贴胆管处,4周及6周后行种植瘤瘤组织解剖学和病理学检查,并观察淋巴管引流情况。结果模型建立过程中,胆管癌细胞系QBC939细胞裸鼠皮下接种成瘤率为100%(10/10);原位种植4周后,肝门部胆管原位种植瘤成瘤率为100%(10/10),原位种植6周后,合并发生肝脏转移及腹腔淋巴结转移为80%(8/10)。结论成功建立了胆管癌细胞系QBC939裸鼠肝门部胆管原位种植瘤模型。     

反义MBD1基因真核表达载体转染对人胆管癌细胞MBD1基因表达的影响

目的：探讨反义MBD1基因真核表达载体转染对人胆管癌QBC 939细胞中MBD1基因表达的影响，为进一步研究该基因的作用提供依据。方法：构建反义MBD1基因真核表达载体，通过脂质体转染入人胆管癌细胞株QBC 939中，以G418进行筛选得到稳定转染细胞株，用PCR鉴定外源性neoR基因在转染细胞中的表达以确定转染成功。半定量RT PCR观察转染前后MBD1基因mRNA水平的变化，流式细胞术检测转染前后MBD1蛋白的变化。 结果：人胆管癌QBC 939细胞中MBD1基因的mRNA水平从0.912±0.022降低至0.215±0.017，转染前后的差异有显著性(P＜0.01)；MBD1蛋白水平从(80.19±5.05)％降低到(35.11±4.05)％，转染前后的差异有显著性(P＜0.01)。 结论：反义MBD1基因转染能降低人胆管癌QBC 939细胞中MBD1基因的表达水平，提示MBD1基因在胆管癌的发生发展中具有重要作用，反义MBD1基因转染有可能成为胆管癌治疗的一种新方法。     

靶向survivin的shRNA对人胆管癌细胞体外增殖及凋亡的影响

目的：探讨靶向survivin的shRNA对人胆管癌细胞体外增殖及凋亡的影响。方法：合成具有互补序列的能够编码短发卡RNA（shRNA）的双链寡核苷酸并构建pSilencer2．1真核表达质粒,经稳定转染QBC939细胞后对转基因后胆管癌细胞的生物学行为进行观察。结果：neo基因稳定表达于转染阳性质粒及阴性对照质粒的QBC939细胞中。通过RT—PCR及westernblot检测证实shRNA在mRNA及蛋白质水平抑制survivin表达率分别达68固％和613％。细胞计数及平板克隆形成实验显示转染细胞生长速度及细胞克隆明显减缓（P〈O．01）。流式细胞术测定细胞周期显示转染细胞G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少。DNAladder、透射电镜观察及流式细胞定量研究显示转染细胞凋亡明显增多。结论：靶向survivin的shRNA能有效抑制目的基因的表达,通过增加细胞凋亡在体外抑制人胆管癌细胞的生长,为胆管癌的基因治疗提供一定的实验基础。     

p15、p16对人胆管癌细胞增殖影响的实验研究

目的 研究抑癌基因p15、p16对人胆管癌细胞的生长抑制作用。方法 将抑癌基因p15、p16的cDNA构建到真核表达的质粒载体pcDNA3-neo中形成p15真核表达质粒pcDNA3 p15及p16真核表达质粒pcDNA3 p16。通过脂质体法将重组质粒pcDNA3 p15,pcDNA3 p16质粒分别转染人胆管癌细胞系QBC939，获得稳定高表达p15或p16的人胆管癌细胞模型。用MTT法测定细胞生长曲线，流式细胞光度术测定细胞生长周期。结果 p15、p16高表达的人胆管癌细胞QBC939的增殖受到抑制，p15、p16均明显阻遏细胞由G1期向S期的转换。结论 抑癌基因p15、p16均参与了细胞周期的阻抑作用。     

α1-肾上腺素受体对胆管癌细胞增殖的影响

目的 探讨α1-肾上腺素受体对胆管癌细胞增殖的影响.方法 应用SABC免疫组织化学法检测2002年8月至2008年3月于西南医院行手术切除的36例人胆管癌组织和4例正常胆管组织中α1-肾上腺素受体的表达,并用去甲肾上腺素(NE)以及受体阻滞剂酚妥拉明、哌唑嗪处理胆管癌细胞,观察细胞的增殖变化.采用χ2检验分析结果.结果 发生胆管癌淋巴结转移的患者中α1-肾上腺素受体强阳性表达率为68%(17/25),明显高于未转移患者的9%(1/11),两者比较差异有统计学意义(χ2=10.604,P<0.05),且胆总管中、下段癌的α1-肾上腺素受体强阳性表达率为85%(11/13),高于肝门部胆管癌的30%(7/23),两者比较差异有统计学意义(χ2=9.753,P<0.05).NE促进胆管癌细胞的增殖,此作用呈浓度依赖性,随着时间的延长,促增殖作用逐渐减弱.该作用由α1-肾上腺素受体介导,在非选择性α-肾上腺素受体阻滞剂酚妥拉明及选择性α1-肾上腺素受体阻滞剂(哌唑嗪)存在的情况下可消除NE对胆管癌细胞的促增殖作用.结论 α1-肾上腺素受体的表达受淋巴结转移以及胆管癌部位影响,呈强阳性表达的α1-肾上腺素受体参与了胆管癌细胞增殖及转移过程.     

γ-氨基丁酸对人胆管癌细胞株QBC939增殖和侵袭的影响

目的 观察抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)对人胆管癌细胞株QBC939生物学行为的影响.方法 采用MTF比色法观察GABA对人系胆管癌细胞QBC939增殖的作用,PCR-ELISA法观察其对QBC939细胞端粒酶活性的影响,Transwell小室分析GABA对胆管癌细胞侵袭能力的影响,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、明胶酶谱法分析GABA对QBC939细胞分泌的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)mRNA和酶活性的影响,数据采用单因素方差分析和Dunnett法处理.结果 GABA对人胆管癌细胞QBC939的增殖有抑制作用(抑制率由2.6%增至26.8%,P＜0.05);抑制癌细胞中端粒酶的活性(0.82±0.05)vs.(0.56±0.05)(P＜0.05);抑制胆管癌细胞穿透Matrigel胶的能力(在100 μmol/L浓度的GABA作用下,穿透细胞数由(60±10)个降至(43±4)个(P＜0.05),同时胆管癌细胞分泌的基质蛋白酶MMP-2和MMP-9的mRNA和活性下降,这三种效应均成浓度依赖性.结论 GABA抑制胆管癌细胞QBC939的生长并减弱侵袭转移能力,其机制可能与其抑制端粒酶活性和基质蛋白酶MMP-2和MMP-9的分泌和活性有关.     

反义CD147分子对人胆管癌细胞株侵袭性影响的实验研究

目的探讨反义CD147分子对人胆管癌细胞株QBC939侵袭性的影响。方法构建含反义CD147分子片段的重组真核表达质粒,将人胆管癌细胞株QBC939分为三组:(1)反义CD147组,运用重组真核表达质粒as CD147-pc DNA3.1(-)转染QBC939细胞;(2)空质粒组,运用pc DNA3.1(-)空质粒转染QBC939细胞;(3)对照组,运用DMEM常规处理细胞。采用MTT法检测各组QBC939细胞的生长情况,RT-PCR和Western blotting法分别对三组QBC939细胞中的CD147、MMP-2、MMP-9、TIMP-2的m RNA表达水平及其对应蛋白的表达水平进行检测。结果成功构建了携带反义CD147分子片段的重组真核表达质粒。MTT法检测显示:三组QBC939细胞的生长曲线及对数生长期情况无统计学差异(P0.05)。RT-PCR法检测显示:反义CD147组QBC939细胞中CD147和MMP-2分子的m RNA表达均低于空质粒组和对照组(P0.05),且空质粒组与对照组相比无统计学差异(P0.05);反义CD147组QBC939细胞中MMP-9和TIMP-2分子的m RNA表达与空质粒组和对照组相比无统计学差异(P0.05)。Western blotting检测发现:与空质粒组和对照组相比,反义CD147组QBC939细胞中CD147和MMP-2分子的蛋白表达明显降低(P0.05),空质粒组与对照组相比无统计学差异(P0.05);与空质粒组和对照组相比,反义CD147组QBC939细胞株中MMP-9和TIMP-2分子的蛋白表达无统计学差异(P0.05)。结论 (1)反义CD147对胆管癌细胞株QBC939的生长无影响;(2)反义CD147对胆管癌细胞株QBC939中MMP-9和TIMP-2的m RNA表达及对应蛋白表达无影响;(3)反义CD147降低胆管癌细胞株QBC939中CD147和MMP-2的m RNA表达及对应蛋白表达,可能会降低胆管癌细胞株的侵袭性。