小鼠CD45-/CD31+肺侧缘细胞诱导分化为血管平滑肌细胞的体外培养

目的探讨在体外诱导分化CD45-/CD31+肺侧缘细胞的特性。方法取小鼠肺组织,流式细胞术分选小鼠CD45-/CD31+肺侧缘细胞;免疫荧光检测其侧缘细胞表型标记物ATP结合盒转运蛋白G2(ABCG2)和干细胞表面标记物干细胞抗原1(stem cell antigen 1,Sca1)的表达,逆转录PCR检测其ABCG2、平滑肌细胞标志物平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin, SMA)及血管平滑肌细胞标志物α-血管平滑肌原肌球蛋白（α-SMT）表达。分选的CD45-/CD31+肺侧缘细胞体外培养14 d后,细胞克隆形成实验和流式细胞术对其进行鉴定。分选的CD45-/CD31+肺侧缘细胞体外诱导14 d后,免疫荧光检测细胞α-SMT的表达,逆转录-PCR检测分化诱导前后细胞中的ABCG2、SMA及α-SMT基因表达。结果成功分选出目的细胞群CD45-/CD31+肺侧缘细胞,其表达ABCG2 和Sca1蛋白,ABCG2和SMA基因,不表达α-SMT基因。细胞体外培养14 d后,出现的细胞克隆鉴定为CD45-/CD31+肺侧缘细胞。CD45-/CD31+肺侧缘细胞分化诱导前表达ABCG2,少量表达SMA,不表达α-SMT,分化诱导14 d后表达α-SMT基因和蛋白、SMA基因,不表达ABCG2基因。结论CD45-/CD31+肺侧缘细胞是血管平滑肌细胞的祖细胞,具有干细胞分化特性。在体外培养可分化为血管平滑肌细胞。     

内毒素对人外周血单个核细胞向血管内皮细胞分化的影响

目的  观察不同浓度脂多糖（LPS）对外周血单个核细胞（PBMCs）体外向血管内皮细胞分化的影响。方法  取健康成人PBMCs,以血管内皮生长因子（VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）进行诱导,加入不同浓度的LPS干预处理,倒置相差显微镜下观察PBMCs的形态改变,流式细胞术检测细胞表达CD31和血管假性血友病相关因子（vWF）。结果  体外培养的PBMCs呈贴壁生长,诱导培养后,经历小圆形→梭形→扁平细胞的演变过程。与对照组比较,0.01μg/ml LPS组最后形成的梭形细胞数增加,随着LPS浓度进一步增加,细胞数呈递减趋势。流式细胞术检测结果显示,与对照组比较,0.01μg/ml LPS组,CD31/vWF双阳性细胞数明显增加,差异有统计学意义（P <0.05）;0.10μg/ml LPS组CD31/vWF双阳性细胞数无明显改变（P >0.05）;随着LPS浓度进一步增加,CD31/vWF双阳性细胞数呈减少趋势,差异有统计学意义（P <0.05）。结论  0.01μg/ml LPS能最大限度地促进PBMCs向内皮细胞分化,随着LPS浓度增加,PBMCs分化呈抑制作用,这可能与LPS激活核转录因子-κB（NF-κB）的数量及亚单位不同有关。

     

EBERs对鼻咽癌转移的作用及其机制研究

目的  探讨EBERs对鼻咽癌转移的作用及其机制。方法  在鼻咽癌细胞中转染EBERs,荧光定量PCR（RT-PCR）检测细胞中转移相关指标（如MMP）的相对表达量,同时 Transwell检测EBERs对鼻咽癌细胞迁移能力的影响。构建敲除EBERs的BAC-EBV（p2089）质粒,转染鼻咽癌细胞,检测细胞的转移能力。转染EBERs后Western blot检测上皮间质转化（EMT）相关指标,免疫荧光检测ZO-1的表达。结果  鼻咽癌细胞转染EBERs质粒或p2089质粒后,RT-PCR检测发现转移相关指标表达升高,Transwell检测结果显示细胞迁移能力增强,而在干扰EBERs或转染敲除EBERs的p2089质粒后,转移能力减弱。转染EBERs后E-cadherin表达降低,Vimentin升高,同时免疫荧光检测发现ZO-1表达降低。结论  EBERs可能通过促进EMT高表达而促进鼻咽癌的转移。

     

乙型肝炎病毒蛋白诱导白细胞介素32表达情况的研究

目的  探讨乙型肝炎病毒蛋白诱导白细胞介素32（IL-32）的表达以及临床意义。方法  用Lipofectamine 2000 TM介导转染HepG2细胞。转染48 h后,采用聚合酶链反应（RT-PCR）,蛋白免疫印迹法（Western blot）分别检测HepG2细胞中IL-32的mRNA及蛋白的表达量。结果  RT-PCR结果显示转染HBV的HepG2细胞中IL-32 mRNA的表达量比转染空载体（未转染）的细胞中IL-32 mRNA高2.3倍;Western blot结果显示与空载体转染的HepG2细胞比较,转染pIRES2-HBV-EGFP的HepG2细胞中IL-32蛋白质表达增高,且差异有统计学意义（P <0.05）。结论  HBV促进IL-32蛋白的表达,从而证实乙型肝炎的严重程度与IL-32的表达有关。

     

ABCG1在肿瘤坏死因子α诱导的氧化应激中的机制研究

目的  探讨三磷酸腺苷结合盒转运体G1（ABCG1）在肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导的氧化应激中的作用及可能的机制。方法  人脐静脉内皮细胞被特异性ABCG1 siRNA或ABCG1过表达质粒转染或使用LXR（肝X受体）激活剂T0901317预处理,随后给予肿瘤坏死因子（TNF-α）干预12 h。采用DCFHDA- AM（2’7’-二氯荧光双乙酸盐）荧光探针检测细胞内活性氧簇（ROS）的水平,分光光度仪测量还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷（NADPH）氧化酶活性,实时荧光定量聚合酶链反应法（qRT-PCR）和Western blot检测内皮细胞NADPH氧化酶亚型非吞噬细胞氧化酶4（NOX4）表达及超氧化物歧化酶（SOD）的表达。结果  ABCG1表达上调抑制TNF-α诱导的氧化应激,同时抑制促氧化应激的NADPH氧化酶的活性和NOX4的表达,促进抗氧化的SOD表达。相反,ABCG1表达下调进一步诱导ROS的产生,诱导NADPH氧化酶的活性和NOX4的表达,抑制SOD1表达。结论  ABCG1通过调节NADPH氧化酶/SOD抑制TNF-α诱导的氧化应激。

     

核因子E2相关因子2在肺腺癌中的表达及临床意义

目的  研究核因子E2相关因子2（以下简称转录因子Nrf2）在肺腺癌组织中的表达及临床意义。方法  收集本院胸外科手术治疗的肺腺癌组织标本88例,正常肺组织标本20例,应用免疫组织化学法,检测组织标本中Nrf2的表达水平。结果  Nrf2在正常肺组织中阳性表达率低于10%,在肺腺癌组织中的阳性表达率为69.3%,在有淋巴结转移的肺腺癌组织中Nrf2的阳性表达率为73.3%。低分化组腺癌组Nrf2阳性表达率（84.6%）明显高于中分化组（76.4%）和高分化组（70.7%）。结论  转录因子Nrf2在肺腺癌组织中表达上调,与肺腺癌的组织分化程度、淋巴转移具有一定的相关性。

     

结肠癌患者肿瘤微环境中T细胞亚群与肿瘤细胞转移的关系

 摘要：目的  探讨结肠癌患者肿瘤微环境中T细胞亚群与肿瘤细胞转移的关系。方法  前瞻性收集该院收治的结肠癌患者89例,所有患者行结肠癌切除术,收集术中肿瘤标本,检测肿瘤组织中CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和调节性T细胞。分析CD4+ T细胞、CD8+ T细胞及调节性T细胞与患者临床特征关系。结果  随着TNM分期的增加,CD4+ T细胞和调节性T细胞增加,CD8+ T细胞降低（P <0.05）。高分化、中分化及低分化患者调节性T细胞分别为（6.59±1.87）%、（7.27±1.81）%和（8.12±1.92）%,差异有统计学意义（P <0.05）。合并淋巴结转移患者CD4+ T细胞增高,CD8+ T细胞降低,调节性T细胞升高（P <0.05）。腺癌、黏液癌期未分化癌调节性T细胞分别为（6.82±1.88）%、（7.28±1.82）%和（8.22±1.91）%,差异有统计学意义（P <0.05）。结论  肿瘤微环境中T细胞亚群失衡与肿瘤细胞的转移相关,调节微环境中T细胞水平或可改善患者临床预后。

     

循环型microRNA-92a在先天性巨结肠中的表达及上调CDX2基因的研究

目的  探讨循环型microRNA-92a（miR-92a）在先天性巨结肠（HD）中的表达，以及通过上调尾侧型同源转录因子-2（CDX2）基因抑制肠神经干细胞（ENSCs）增殖的可能机制。方法  选取2013年1月-2015年12月在山东省临沂市沂水中心医院行先天性巨结肠根治术16例HD患儿的术前血清标本。实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测血清miR-92a mRNA的表达。提取孕15 d胎鼠肠管ENSCs，通过免疫学方法鉴定ENSCs；免疫磁珠法分选Nestin+ENSCs，脂质体转染使Nestin+ENSCs内过表达miR-92a，噻唑蓝法检测细胞的增殖活性，qRT-PCR、Western blot检测CDX2基因的表达。结果  HD患儿血清中miR-92a mRNA的相对表达量为（23.5±4.66），高于对照组（t =12.661，P =0.000）；ENSCs细胞培养早期Nestin染色阳性，具有向Tuj-1阳性、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞分化的潜能；ENSCs过表达miR-92a后，CDX2 mRNA的相对表达为（13.024±3.882），高于对照组（F =47.212，P =0.000），CDX2蛋白表达为（0.436±0.0828），高于对照组（F =48.793，P =0.000），细胞的增殖活性在转染后24、48和72 h明显受抑制。结论  miR-92a通过上调CDX2基因的表达，抑制ENSCs的增殖，可能促进HD发生、发展。

     

VEGF-165/ANG-1双基因共转染血管内皮祖细胞复合多孔生物活性玻璃的生物相容性研究

目的  制备一种具有诱导血管再生活性的新型复合骨组织工程材料,并评价其生物相容性。方法  将血管内皮生长因子-165（VEGF-165）/血管生成素-1（ANG-1）双基因共转染的血管内皮祖细胞（EPCs）复合多孔生物活性玻璃,制成复合人工骨材料。采用Western blot、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测已转染EPCs中VEGF-165及ANG-1的表达。噻唑蓝（MTT）细胞毒性试验、骨植入试验及扫描电镜观察细胞在材料表面黏附情况等综合评价材料的生物相容性;CD31免疫组织化学法染色观察材料中血管再生的情况。结果  Western blot检测、RT-PCR反应显示,实验组VEGF-165、ANG-1的表达较对照组升高。MTT细胞毒性试验、骨植入试验均显示,材料无毒性反应。扫描电镜显示,材料表面有较多血管内皮祖细胞黏附,并有较多伪足伸出。苏木精-伊红染色法（HE）染色显示,材料周围组织生长良好,未见明显的炎症细胞浸润,材料与周围组织交界处有大量的新骨生成。CD31免疫组织化学法染色显示,材料中有较多新生的毛细血管。结论  VEGF- 165/ANG-1双基因共转染EPCs复合多孔生物活性玻璃的骨组织工程材料生物相容性良好,具备一定的诱导血管再生活性。

     

不同剂量肝素对高糖诱导后的人腹膜间皮细胞水通道蛋白1表达的影响

目的  研究不同剂量肝素对高糖诱导后的人腹膜间皮细胞水通道蛋白1（AQP1）mRNA和蛋白表达水平的影响。方法  分离并培养人腹膜间皮细胞,并用高糖（2.5%葡萄糖溶液）诱导4、8、12和24 h;采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测AQP1 mRNA的表达水平,从而确定表达量达峰值的诱导时间。将不同剂量的肝素添加至人腹膜间皮细胞培养液中,并经2.5%高糖溶液诱导后,用RT-PCR及免疫组织化学法检测实验组与对照组AQP1 mRNA和蛋白表达水平。结果  与对照组比较,实验组AQP1 mRNA和蛋白表达明显增加,且mRNA表达呈时间依赖性,且在高糖诱导24 h时表达量达峰值,差异有统计学意义（P <0.05）;RT-PCR与免疫组织化学结果具有一致性,均提示AQP1 mRNA和蛋白表达水平在2.5%葡萄糖+1.5×10-2 mg/ml肝素组呈现明显上调,差异有统计学意义（P <0.05）;免疫组织化学染色提示2.5%葡萄糖+1.5×10-2 mg/ml肝素组细胞可见胞核及胞浆有空泡样改变。结论  肝素在高糖环境中诱导24 h后可显著增加人腹膜间皮细胞水通道蛋白AQP1 mRNA和蛋白的表达,且大剂量的肝素能使胞浆及胞核出现明显的空泡样改变。

     

人外周血来源的血管内皮祖细胞体外诱导分化

目的研究外周血来源内皮祖细胞的分离、培养、分化及鉴定方法。方法采集正常人外周血单个核细胞进行体外培养,通过免疫组化、免疫荧光和流式细胞术测定分化细胞表面特异性抗原的表达及其变化。结果培养7d后多数细胞贴壁生长,逐渐显示内皮细胞的形态特点,传代培养4周后呈典型铺路石样,并可继续稳定传代扩增;免疫组化和免疫荧光染色CD31、CD34、血管内皮细胞生长因子受体．2和vWF均呈阳性;流式细胞显示,经体外诱导培养后CD34^＋／AC133^＋细胞数明显增多。结论外周血来源的单个核细胞中含有能分化成血管内皮细胞的内皮祖细胞,其在一定条件下可稳定分化、扩增。     

人羊水源性间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的 体外分离培养人羊水间充质干细胞(HAFMSCs),观察生物学特性,并鉴定其多向分化能力.方法 采用改良两步法分离培养HAFMSCs,用MTT法观察细胞增殖能力.FACS检测表面抗原CD29,CD34,CD44,CD45,CD73,CD90,HLA-ABC,HLA-DR等的表达.RT-PCR法分析细胞中OCT-4,Nanog mRNA水平的表达.用成脂、成骨、内皮细胞培养基对HAFMSCs进行诱导,并分别采用油红O,Yon Kossa染色及细胞免疫荧光染色检测其分化能力.结果 羊水细胞于2-3d开始贴壁,10-15d形成细胞集落.传至第3代HAFMSCs呈旋涡状排列,生长曲线呈S形.FACS检测显示CD29,CD44,CD73,CD90,HLA-ABC表达阳性,CD34,CD45,HLA-DR表达阴性,RT-PCR法检测显示HAFMSCs中OCT-4、Nanog mRNA的表达阳性.成脂、成骨诱导21d后油红O、Von Kossa染色阳性,成内皮细胞诱导4周后细胞免疫荧光染色检测vWF抗体表达阳性.结论 成功分离培养出HAFMSCs,细胞具有干细胞特征,具有多向分化潜能.     

体外诱导成人外周血干细胞向血管内皮细胞分化

目的研究人外周血干细胞(PBSC)向血管内皮细胞分化。方法以血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对经重组人粒细胞集落刺激因子刺激后采集的PBSC进行诱导培养,观察细胞形态的变化,运用流式细胞术检测诱导后的细胞表达CD31和vWF情况,并用透射电镜观察细胞的超微结构。结果经VEGF和bF-GF诱导后的细胞形态上表现内皮细胞特征,经流式细胞仪测定表达血管内皮细胞特有表面标志CD31和vWF,透射电镜细胞胞浆内可见特征性Weible-Palade小体。结论外周血干细胞在VEGF和bFGF诱导下,可分化为内皮细胞。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞定向血管内皮细胞分化

目的研究人骨髓间充质干细胞(BDMSC)向血管内皮细胞的诱导分化,为复杂器官组织工程血管化及细胞移植修复损伤组织提供理想的细胞来源.方法以血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子对种植于纤维蛋白凝胶及基底膜基质中的BDMSC进行三维立体诱导培养,在培养后不同时间分别进行形态观察、组织切片和CD34、CD31、血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1,Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1)、vWF的免疫组织化学荧光染色.结果诱导后的人BDMSC阳性表达血管内皮细胞特有表面标志CD34、CD31、Flt-1、Flk-1、vWF,并生成内皮样细胞,形成血管样结构.结论血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及诱导后表达的Flt-1、Flk-1等表面分子可能在BDMSC向血管内皮细胞分化、并形成血管样结构的过程中提供适宜的微环境并起重要作用,这为间充质干细胞在组织工程血管化及细胞移植修复损伤中的应用提供了理论与技术上的支持.     

骨髓间充质干细胞体外可定向诱导为内皮细胞

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力。方法:利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,体外扩增,激光共聚焦显微镜检测表面抗原表达,以含VEGF、bFGF的诱导分化培养液定向诱导传代使细胞向血管内皮细胞分化,免疫荧光及免疫组化检测内皮细胞特异性标志物鉴定。结果:MSCs在体外传代扩增后激光共聚焦显微镜检测结果显示CD44、CD90表达阳性,CD31、CD45为阴性,分化后的细胞具有内皮细胞的形态学特征可表达CD31及Ⅷ因子。结论:骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化。     

脑肿瘤干细胞的分布与肿瘤微血管的相关性

目的 探讨脑肿瘤干细胞(BTSC)标记物CD133、Nestin和血管内皮细胞标记物CD31在脑胶质瘤中的表达.方法 (1)按照世界卫生组织(WHO)2000年的神经系统肿瘤分类分级标准所有标本分为Ⅱ级18例,Ⅲ级23例,Ⅳ级24例,采用免疫组织化学SP法检测CD133和Nestin在65例胶质瘤组织中的表达.(2)采用免疫荧光双染法检测CD133/CD31、Nestin/CD31和CD133/Nestin共表达情况.计算CD133~+肿瘤干细胞、CD133~+血管、Nestin~+肿瘤干细胞和Nestin~+血管所占的百分率,并进行统计学分析.结果 CD133~+肿瘤干细胞或Nestin~+肿瘤干细胞在各级别胶质瘤中均有表达,并且均可表达于血管内皮细胞.低级别组中,在CD133~+肿瘤干细胞或Nestin~+肿瘤干细胞分布的区域可见CD133~+血管或Nestin~+血管分布较少.在高级别组中,该区域则有丰富的CD133~+血管或Nestin~+血管分布,同时可见肿瘤干细胞包绕着血管生长.并且,CD133~+细胞或Nestin~+细胞的百分比与CD133~+血管(r=0.945,P<0.01)或Nestin~+血管(r=0.727,P<0.01)的表达呈正相关.免疫荧光双染可见,CD133~+细胞或Nestin~+细胞均聚集于CD31~+血管周围,并且,CD133~+/CD31~+、Nestin~+/CD31~+细胞共表达于血管内皮细胞.结论 在脑胶质瘤组织中,血管内皮细胞可表达肿瘤干细胞的标记物,因此认为,肿瘤内微血管可能来源于肿瘤干细胞的分化,并且肿瘤干细胞聚集于微血管周围生长呈巢状分布.随着肿瘤病理级别的升高,CD133~+肿瘤干细胞或Nestin~+肿瘤干细胞的百分比与CD133~+血管或Nestin~+血管的表达呈正相关.     

小鼠骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞的分离?培养及鉴定

目的:建立一种高效,稳定的从小鼠骨髓中同时分离培养间充质干细胞(MSC)和内皮祖细胞(EPC)的方法.方法:从小鼠骨髓分离单个核细胞,经差速贴壁结合专用血清或特殊培养基分别扩增MSC和EPC.以成骨、成脂诱导分化鉴定MSC,并以流式细胞术(FCM)检测MSC纯度;以Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1荧光双标,结合vWF、CD31免疫组化染色鉴定EPC,并计算其纯度.结果:早期贴壁细胞48 h换液时即可见明显集落形成,1周后即达80%融合,传至第3代后经诱导能够向成骨细胞和脂肪细胞分化,FCM检测CD29、CD34、CD45、CD90阳性率分别为(93.86±1.12)%,(0.48±0.38)%,(1.89±1.49)%,(94.11±3.32)%;2次贴壁细胞经EGM-2 MV专用培养基培养后,第3天开始伸展,第5天可见集落形成,约2周左右可融合近80%,传代后Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1双荧光染色阳性率(75.2±4.5)%,vWF、CD31免疫组化染色阳性率分别为(55.7±4.7)%和(52.5±3.6)%.结论:采用该方法可以同时培养扩增骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞,效率高,稳定性和重复性好.     

大鼠脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞向内皮分化的能力比较

目的研究脂肪干细胞（ASCs）向内皮分化的能力,并与骨髓间充质干细胞（BMSCs）对比。方法从SD大鼠中分离培 养ASCs、BMSCs,选择生长良好的一定代数的细胞,流式细胞仪鉴定细胞表面标志物;用CCK-8 法绘制细胞生长曲线;进行 标准内皮诱导3 周,用qPCR 检测内皮细胞特异性标志物CD31、KDR、vWF mRNA的表达;免疫荧光染色观察表面抗原 CD31 的表达;用Dil 标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-Ac-LDL）检测诱导组细胞的摄取功能;在Matrigel 上验证诱导组细胞 的成管能力。结果成功分离培养大鼠ASCs和BMSCs,形态上,ASCs与BMSCs类似,均呈长梭形、纺锤状,类成纤维细胞样 形态;流式检测结果显示BMSCs 与ASCs 均高表达间充质干细胞表面标志物CD29（100%与96.9%）、CD90（96.5%与 99.2%）,低表达造血系细胞表面标志物CD45（3.9%与0.8%）,证实所提取的是间充质干细胞;CCK-8 增殖实验结果表明, ASCs的增殖速度比BMSCs的增殖速度快（P<0.05）。标准内皮诱导后,qPCR显示诱导组BMSCs和ASCs表达CD31、KDR、 vWF mRNA水平均高于未诱导组（P<0.05）;免疫荧光染色显示CD31 抗原表达在诱导组的细胞膜表面;荧光显微镜下诱导 组细胞摄取Dil-Ac-LDL（未诱导组不摄取）;诱导组细胞在Matrigel 上均具备成管能力,证实诱导后的细胞为内皮细胞。结 论表明BMSCs和ASCs 均可诱导向内皮细胞分化,ASCs 广泛分化为内皮细胞的时间更短且增殖能力更强,提示ASCs 比 BMSCs更具有应用前景。