TGF-βRⅡ/Fc融合蛋白在杆状病毒系统中的表达

目的：构建TGF－βRⅡ／Fc融合蛋白的杆状病毒表达系统，并使之成功表达。为将来TGF－βRⅡ／Fc融合蛋白在肺间质纤维化基因治疗中的应用奠定基础。方法：采用分子克隆技术构建Bac-TRⅡ杆状病毒表达系统；采用DNA脂质体转染技术和昆明细胞培养技术培养和扩增Bac-TRⅡ重组病毒颗粒；采用免疫荧光技术和免疫印迹法检测目的蛋白的表达。结果：在重组的Bac-TRⅡ杆状病毒感染的sf9细胞中可以检测到目的蛋白的表达。结论：重组的Bac-TRⅡ杆状病毒表达系统可以用于正确表达TGF－βRⅡ／Fc融合蛋白。由于杆状病毒表达系统效率较高，因此，今后可利用该系统进行目的蛋白的纯化及进一步的实验研究。     

TGF-βRⅡ/Fc融合基因真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 构建TGF-βRⅡ/FC融合基因的真核表达载体pIg-TRⅡ，使其在中国仓鼠肾细胞（CHO）中呈分泌性表达，为肺间质纤维化基因治疗的研究奠定基础。方法 采用RT-PCR方法从正常人肺组织中扩增出目的基因TGF-βRⅡcDNA的胞膜外部分，再将TGF-βRⅡcDNA片段亚克隆到pIg真核表达载体，该载体在其多克隆位点下游含有人IgG1Fc基因组片段，由此可形成TGF-βRⅡ/FC融合基因；采用脂质体转染技术转染CHO细胞使其瞬时表达融合蛋白；应用细胞免疫荧光技术检测融合蛋白的表达；采用免疫沉淀的方法检测CHO细胞培养上清内融合蛋白的表达。结果 DNA测序结果在Blast上作同源性比较证明插入片段就是TGF-βRⅡcDNA的胞膜外部分，细胞免疫荧光染色呈阳性反应，CHO细胞培养上清内检测到融合蛋白的表达。结论 pIg-TRⅡ真核表达载体构建成功，并能够在CHO细胞中分泌性表达有活性的融合蛋白TGF-βRⅡ/FC。     

上皮细胞间质转化在肺纤维化发生发展中的作用

肺纤维化的机制至今仍然不清,一度认为是慢性炎症所致,现在已经明白炎症和慢性纤维化常常是可以分离的。炎症对于诱导纤维化而言不是必需的,也不是充分的。近年来发现肺纤维化初级效应细胞,肌纤维母细胞可能来源于肺泡上皮细胞发生的一个叫做上皮细胞-间质转化的过程,这一观点颇受重视,被认为是肺纤维化发生发展的新模式。     

转化生长因子β1及相关细胞因子在肺纤维化发生中的作用

肺纤维化是一大组弥漫性肺实质疾病群．以大量的成纤维细胞（fibroblast,FB）聚集、细胞外基质（extracellular matrix,ECM）沉积并伴有炎症和损伤所致的肺组织结构破坏为特征。近年来随着分子生物学技术和免疫学技术的发展．肺纤维化的细胞因子机制得到进一步的阐明。越来越多的研究表明有多种细胞因子参与肺纤维化的发病机制,它们既相互促进又彼此拈抗,形成复杂的细胞因子网络,共同促使肺纤维化的形成发展。     

转化生长因子β及受体在增生和癌变的细支气管肺泡细胞中的分布

用免疫组织化学方法检测转化生长因子三型及其受体在细支气管肺泡细胞增生和细支气管肺泡细胞癌中的分布情况。     

转化生长因子β-Smad信号转导通路在肿瘤发生中的作用

转化生长因子β(TGF-β)-Smad信号转导途径在肿瘤发生机制中发挥重要作用。近年来，大量研究已经揭示了。TGF-β超家族配体、受体、Smad蛋白、上游和下游调节因子及多种信号通路间的交互对话在消化系统恶性肿瘤、肺癌及其他肿瘤中的作用机制。作者比较和整理近年关于TGF-β-Smad信号通路及Smad4在肿瘤领域的体内外研究报道，并就此作一综述。     

γ干扰素对博来霉素诱导的大鼠肺纤维化的干预作用

目的探讨γ干扰素（IFN-γ）对博来霉素诱导的大鼠肺纤维化的干预作用及其可能的机制。方法75只SD雄性大鼠随机分为健康对照组、肺纤维化模型组、地塞米松干预组、高剂量IFN-γ干预组和低剂量IFN-γ干预组，每组15只。各组随机分别于7，14和28d各处死5只，收集肺组织作切片行HE及Masson染色判断肺组织肺泡炎及肺纤维化程度，行免疫组化染色测定肺组织转化生长因子岛（TGF-β1）、结缔组织生长因子（CTGF）、Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达水平。结果与模型组比较，3个干预组的肺泡炎及肺纤维化程度均明显减轻（P均〈0．05），肺组织TGF-β1、CTGF、Ⅰ型及Ⅲ型胶原的蛋白表达水平明显降低（P均〈0．05），其中高剂量IFN-γ干预组肺组织TGF-β1、Ⅰ型及Ⅲ型胶原的蛋白表达水平较低剂量干预组更为显著（P均〈0．05）。结论IFN-γ具有与地塞米松相似的较强的抗纤维化效应，且不良反应更少。机制可能为通过抑制细胞因子TGF-β1、CTGF的表达而减少肺组织中Ⅰ型及Ⅲ型胶原的生成，最终抑制肺纤维化。     

替米沙坦对博来霉素诱导的大鼠肺纤维化模型的干预作用

目的研究替米沙坦对博来霉素诱导的大鼠肺纤维化模型的干预作用，并探讨其机制。方法雌性SD大鼠45只随机等分为三组：生理盐水对照组、博来霉素组（气管内注入博来霉素）及替米沙坦组（气管内注入博来霉素，并给予替米沙坦灌胃）。采用HE染色了解肺泡炎和肺纤维化的情况，酸解法测羟脯氨酸含量，ELISA检支气管肺泡灌洗液（BALF）中转化生长因子-β1（TGF—β1）水平的变化，并观察BALF中的细胞总数变化。结果替米沙坦组与博来霉素组比较，灌注后第7和14天肺泡炎轻；第28天肺纤维化减轻。博来霉素组肺羟脯氨酸含量增高，替米沙组减少。替米沙坦组BALF中的细胞总数第7和14天较博来霉素组少。替米沙坦组BALF中TGF—β1水平于各时间点低于博来霉素组。结论替米沙坦对博来霉素诱导的大鼠肺纤维化模型有抑制作用，其机制可能与抑制TGF-β1水平有关。     

骨髓间质干细胞移植对博莱霉素诱导大鼠肺纤维化的治疗作用

目的 研究骨髓间质干细胞(BMSCs)对博莱霉素A5(BLMA5)所致的大鼠肺间质纤维化的治疗作用.方法 收集、培养雄性SD幼鼠(鼠龄10 d)的BMSCs,并进行DAPI标记.将70只雌性SD大鼠随机分为4组,A组(n=21):生理盐水对照组;B组(n=21):BLMA5模型组;C组(n=21):气管内注入BLMA5后立即尾静脉注射移植BMSCs;D组(n=7):气管内注入BLMA5 14 d后移植BMSCs.分别于第7、14、28 d(D组于第28 d)处死大鼠,取肺组织病理切片行HE及Masson染色观察肺部炎症和纤维化情况,荧光显微镜下检测DAPI标记细胞;PCR法检测睾丸决定因子(SRY)基因;ELISA法检测肺组织内羟脯氨酸(HYP)、TNF-α和TGF-β1的含量.结果 (1)在C、D组7、14、28 d肺组织冰冻切片中均见到DAPI标记的BMSCs,PCR检测到雄性SD大鼠SRY基因.(2)B组第7 d肺泡炎最明显,到28 d时肺纤维化最严重,与其他三组比较差异均有统计学意义(P(0.05或0.01);C、D两组肺泡炎及肺纤维化程度均较B组显著减轻(P<0.05),但仍较A组严重(P<0.05或0.01),其中D组较C组严重(P<0.05).(3)B组第7 dHYP含量开始升高,28 d最高,显著高于其他三组(P<0.05或0.01),各组变化趋势与肺纤维化变化相一致;B组TNF-α在第7 d最高,此后开始下降,在14 d时仍高于A、C两组(P<0.05).28 d时四组之间无明显差异;B组TGF-β在第28 d达最高,各组之间比较均有显著差异(P<0.05).结论 骨髓间质干细胞可定植于损伤肺组织,并能有效阻止BLMA5诱导的大鼠肺纤维化,且早期治疗效果优于晚期.     

TGF-β3拮抗TGF-β1诱导的FMT 改善小鼠肺纤维化

目的 研究转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β3是否能够抑制TGF-β1诱导的人肺成纤维细胞(human lung fibroblast, HLF)间质转化。方法 在体外培养原代HLF进行细胞实验,分为3组:对照组:给予等体积超纯水;TGF-β1组:细胞给予TGF-β1(4ng/ml)处理HLF 24h;TGF-β3组:细胞给予20ng/ml的TGF-β3预处理24h后加入TGF-β1(4ng/ml)处理24h。Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)和纤连蛋白(Fibronectin)蛋白的表达水平。在体内构建小鼠肺纤维化模型,分为3组:对照组:给予等体积0.9%氯化钠溶液气管滴注;模型组:博来霉素溶于0.9%氯化钠溶液,按2.0U/kg的浓度给予小鼠气管内滴注;TGF-β3干预组:于造模前1天,将TGF-β3(100μg/kg)给予小鼠尾静脉注射。HE和Masson染色法观察肺组织病理学变化,免疫荧光法检测α-SMA和Fibronectin蛋白的变化。结果 在体外,与TGF-β1组比较,TGF-β3组细胞迁移和侵袭能力降低,α-SMA和Fibronectin蛋白表达下调。在体内,与模型组比较,TGF-β3组小鼠肺组织病理变化改善,胶原沉积减少,α-SMA和Fibronectin蛋白荧光强度降低。结论 TGF-β3抑制TGF-β1引起的HLF间质转化,并改善博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。     

虾青素对小鼠放射性肺纤维化的防治作用

目的 探讨虾青素对小鼠放射性肺纤维化的防治作用及其机制.方法 60只雌性C57BL/6小鼠随机分为正常组、照射组、照射+虾青素组(25mg/kg),每组20只.除正常组外,其余各组均以60Co γ射线单次16 Gy全胸照射,照射+虾青素组在照射前后每天1次灌胃各7d.照射后1、4、8、16周处死小鼠,取肺组织进行Masson染色,检测肺组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量,测定血清中转化生长因子β1(transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)含量.结果 小鼠受照射后肺纤维化严重程度随照后时间延长而加重,用虾青素处理后可明显减轻小鼠肺纤维化严重程度,提高肺组织SOD活力(P＜0.05或P＜0.01)并减少脂质过氧化产物MDA含量(P＜0.05或P＜0.01);抑制小鼠肺组织Hyp和血清中TGF-β1含量的升高(P＜0.05或P＜0.01).结论 虾青素能够有效地减轻放射性肺纤维化,其机制可能与虾青素能够提高机体的抗氧化能力、下调促纤维化因子TGF-β1表达有关.     

吸入环孢菌素A对肺纤维化及其气道高反应性的干预作用

目的 检测博莱霉素致肺纤维化大鼠气道高反应性的形成，观察吸入环孢菌素A对肺纤维化及其气道高反应性的治疗作用。方法 雄性Wistar大鼠36只，按随机数字表法分为对照组（A）、模型组（B）、药物组（C）3组，每组12只。检测博莱霉素致肺纤维化大鼠模型吸入环孢菌素A治疗前后转化生长因子β（TGF-β）和肺匀浆羟脯氨酸（HYP）的含量，并使用大鼠呼吸机及气道压力监测仪测量各组大鼠气道压力峰值-时间指数（APTI）的差异。结果A组肺泡结构正常，B组28d时广泛的肺纤维化为主。C组病理改变与B组相似，但程度较轻。28dB组血清中TGF-β及肺匀浆中HYP的含量显著高于A组（P〈0．01），而且与C组血清中的含量相比有差别（P〈0.05）；B组APTI与A组、C组比较（mACh为0.05mg／kg时，三者分别为0.508，0．841，0．671mmHg／s），差异有显著性（P〈0．05）。结论博莱霉素致肺纤维化大鼠模型存在气道高反应性，吸入环孢菌素A可减轻肺纤维化程度，降低气道高反应性。     

野菊花总黄酮对大鼠肺纤维化的干预作用

目的 研究野菊花总黄酮(TFC)对大鼠肺纤维化(PF)的预防作用.方法 30只Wistar大鼠,随机均分为假手术对照组、模型组、TFC(168、336 mg/kg)组、强的松组.除假手术对照组外其余各组大鼠气管内一次性滴注盐酸平阳霉素诱导PF模型.次日TFC两组和强的松组分别给予TFC 168、336 mg/kg及强的...     

罗格列酮拮抗博莱霉素致大鼠肺纤维化的实验研究

目的探讨罗格列酮抑制肺纤维化的作用及其机制。方法将24只大鼠分为生理盐水对照组、罗格列酮对照组、博莱霉素组、罗格列酮干预组,予博莱霉素诱导大鼠肺纤维化。HE染色和Masson染色行病理学检查;试剂盒检测肺组织中羟脯氨酸含量;应用Westen blot及荧光定量实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和转化生长因子β1(TGF-β1)的表达;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中TGF-β1浓度。结果博莱霉素气管内注入后,Ashcroft评分,肺组织胶原沉积、羟脯氨酸含量,BALF中TGF-β1水平及肺组织中TGF-β1、PPARγ、MMP-9表达较生理盐水对照组增加;给予罗格列酮干预后,除PPARγ表达进一步增加外,上述指标均下降。博莱霉素组PPARγ蛋白表达水平与TGF-β1mRNA、MMP-9mRNA表达水平分别呈负相关。结论罗格列酮对博莱霉素诱导的肺纤维化进程有拮抗作用,其具体机制可能与上调PPARγ蛋白表达,抑制TGFβ1、MMP-9mRNA转录有关。     

Simvastatin attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice

Background Bleomycin-induced fibrosis is extensively used to model aspects of the pathogenesis of interstitial pulmonary fibrosis. This study aimed to determine the benefic effects and mechanisms of simvastatin on bleomycininduced pulmonary fibrosis in mice. Methods Bleomycin-induced pulmonary fibrosis mice were administered with simvastatin in different doses for 28 days. We measured inflammatory response, fibrogenic cytokines and profibrogenic markers in both bleomycin-stimulated and control lungs, and correlated these parameters with pulmonary fibrosis. Results Simvastatin attenuated the histopathological change of bleomycin-induced pulmonary fibrosis and prevented the increase of lung hydroxyproline content and collagen （Ⅰ and Ⅲ） mRNA expression induced by bleomycin. Moreover, simvastatin down-regulated the increased expression of transforming growth factor-β1 （TGF-β1） and connective tissue growth factor （CTGF） induced by bleomycin at both gene and protein levels. Simultaneously, the accumulation of neutrophils and lymphocytes and the increased production of tumor necrosis factor-a （TNF-α） in bronchial alveolar lavage fluid were inhibited by simvastatin in early inflammatory phase after bleomycin infusion. The higher dose of simvastatin was associated with a more significant reduction in these inflammatory and fibrotic parameters. Furthermore, the inactivation of p38, RhoA and Smad2/3 signaling pathways was observed during simvastatin administration. Conclusions Simvastatin attenuated bleomycin-induced pulmonary fibrosis, as indicated by decreases in Ashcroft score and lung collagen accumulation. The inhibitory effect of simvastatin on the progression of pulmonary fibrosis may be demonstrated by reducing inflammatory response and production of TGF-β1 and CTGR These findings indicate that simvastatin may be used in the treatment of pulmonary fibrosis.     

结缔组织生长因子与大鼠移植肺纤维化的关系

检测结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)在大鼠移植肺内的表达,并探讨其与移植肺纤维化的关系.方法:检测结缔组织生长因子(CTGF)在大鼠移植肺内的表达,并探讨其与移植肺纤维化的关系.方法:取20只Wister大鼠作为供体,20只SD大鼠作为受体,进行原位左肺移植.急性排斥反应组(AR)大鼠于术后1周处死,慢性排斥反应组(CR)大鼠于术后6周处死,均取其移植肺作标本,取正常Wister大鼠肺标本作对照组(NH),每组10只.测取并计算肺组织的湿/干重比值(W/T);采用HE及Van Gieson染色观察肺组织病理形态,并进行纤维化的半定量评分;采用免疫组织化学方法检测CTGF在肺组织中的表达.结果:肺的W/T比值逐步减小(AR vs.NH:3.48±0.47 vs.4.67±0.51,P＜0.05;CR vs.AR:2.85±0.52 vs.3.48±0.47,P＜0.05);移植肺组织显示:大量炎性细胞浸润、肺间质纤维化、肺泡结构破坏、阻塞性肺炎、肺实变,CR组较AR组更明显;纤维化评分,AR组明显高于NH组(0.98±0.47 vs.0.00±0.00),CR组(2.35±0.52)明显高于AR组,(均P＜0.01).CTGF在移植肺组织中有明显表达,且CR组较AR组更高(P＜0.01),而正常肺无表达.结论:CTGF表达与移植肺纤维化密切相关,且参与了移植肺纤维化的病理过程.     

卡托普利对博莱霉素致小鼠肺纤维化的防治作用及其机制探讨

目的 研究血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利对博莱霉素致小鼠肺纤维化的防治作用.方法 7～10周龄雄性ICR小鼠45只分3组,分别为模型组、卡托普利组与正常对照组.模型组与卡托普利组经尾静脉注射博莱霉素10mg/(kg·d)14 d建立稳定的肺问质纤维化模型,卡托普利治疗组于注射博莱霉素前24 h予卡托普利(12.5 mg/kg·d)灌胃,并与正常ICR小鼠进行对照.第28天收获肺组织,左肺行HE和Masson染色,右肺组织应用Real-time PCR检测Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGFβ1及结缔组织生长因子CTGF mRNA表达,行Western-blot检测CTGF蛋白表达.结果 卡托普利治疗组与模型组比较,小鼠肺泡炎、纤维化程度有所改善,但无统计学意义.卡托普利能显著下调模型组肺组织中升高的Collagen Ⅰ、TGFβ1的mRNA水平及CTGF的mRNA与蛋白水平.但Collagen Ⅲ的mRNA水平并无明显改变.结论 卡托普利有减轻BLM诱导的肺泡炎及肺纤维化程度的趋势,提示卡托普利有一定的抗肺间质纤雏化作用;抑制TGF-β1及CTGF在肺组织中的表达,可能是其作用机制之一.     

特发性肺纤维化患者支气管肺泡灌洗液中细胞因子研究

目的研究支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中转化生长因子β1(TGF-β1)、血小板衍生生长因子(PDGF)含量变化及细胞改变,探讨其临床应用价值.方法用ELISA方法检测BALF中TGF-β1,PDGF含量.结果特发性肺纤维化(IPF)患者支气管肺泡灌洗液中TGF-β1,PDGF含量与对照组比较明显升高(P＜0.01,P＜0.05).结论TGF-β1,PDGF参与IPF的形成,检测BALF中TGF-β1,PDGF含量可作为IPF的辅助诊断指标及判断疾病活动的标志,对TGF-β1,PDGF的生物活性进行阻断,将是治疗IPF一条有前途的方法.     

肺纤方颗粒对盐酸平阳霉素致肺间质纤维化大鼠血清转化生长因子β1和血小板衍生生长因子的影响

目的：观察肺纤方颗粒抗大鼠肺间质纤维化的作用，及其对大鼠血清转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF—β1）和血小板衍生生长因子（platelet—derived growth factor，PDGF）的影响。方法：72只雄性Wistar大鼠经气管插管灌注盐酸平阳霉素1mg／kg复制大鼠肺间质纤维化模型，随机分入模型组、泼尼松组和肺纤方组，每组24只；15只雄性Wistar大鼠经气管插管灌注等体积生理盐水作为假手术组。造模后24h开始常规灌胃给药．泼尼松组给予醋酸泼尼松5mg／kg．肺纤方组给予肺纤方颗粒1．25g／kg，模型组和假手术组给予等体积生理盐水．1次／d。分别于第14、28、45天取材，假手术组每批5只，其余各组每批8只。检测其肺组织病理改变及血清中TGF-β1和PDGF的水平。结果：与模型组和泼尼松组比较，在第45天时病理检测显示肺纤方组肺间质纤维化的程度较轻；血清TGF—β1和PDGF检测结果显示，模型组大鼠两种因子水平升高。第45天时升高最明显，并高于假手术组（P〈0．05）。肺纤方组与泼尼松组的TGF-β1变化与模型组相似（P〉0．05），两组间TGF—β1变化比较差异无统计学意义（P〉0.05）。肺纤方组PDGF水平在第14天时与其余各组比较显著升高（P〈0．01）。然后持续下降，至第45天与假手术组接近（P=0．792）；而模型组和泼尼松组PDGF水平皆随时间延长逐渐上升，第45天时均显著高于假手术组（P〈0．01）。结论：肺纤方有一定的减轻盐酸平阳霉素致大鼠肺间质纤维化的作用，其作用机制可能与对血清PDGF水平的调节作用有关。     

阿司匹林对博莱霉素致大鼠肺间质纤维化的抑制作用及其机制

 目的  观察阿司匹林对博莱霉素所致大鼠肺间质纤维化的抑制作用,并探讨其作用机制。方法  取体质量250 g左右的健康清洁级雄性SD大鼠60只,随机分为生理盐水对照组、博莱霉素模型组、甲基强的松治疗组、阿司匹林治疗组,每组15只。生理盐水对照组经气管插管注入生理盐水0.2 mL,其他各组注入博莱霉素 5 mg/kg制备成模型。甲基强的松治疗组和阿司匹林治疗组每天灌胃给药分别予甲基泼尼松龙6 mg/kg、阿司匹林10 mg/kg,于第7、14、28天每组各处死5只,取其肺组织作以下测试:HE染色病理学观察;酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测羟脯氨酸、IL-4、TNF-α、转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF β)和角化细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)水平;Real Time PCR检测TGF β的mRNA表达。结果  博莱霉素模型组大鼠肺组织在第7天时出现明显的出血渗出性炎症反应,在第28天时出现明显的肺组织纤维化;其肺组织的羟脯氨酸、IL-4和TNF-α水平较生理盐水对照组有明显升高(P<0.05),TGF-β蛋白和TGF β mRNA的表达也明显高于生理盐水对照组(P<0.01)。阿司匹林治疗组肺组织病理与博莱霉素模型组比较,第7天时大鼠肺组织的炎性渗出有明显减轻,第28天时肺组织纤维化程度较轻。阿司匹林治疗组大鼠肺组织的羟脯氨酸、IL-4、TNF-α含量较博莱霉素模型组有明显下降(P<0.01),其肺组织TGF-β蛋白含量和mRNA表达明显低于博莱霉素模型组(P<0.05)。阿司匹林治疗组与甲基强的松治疗组相比较,在第28天时肺组织羟脯氨酸含量低于甲基强的松治疗组(P<0.01),而IL-4、TNF-α、TGF-β、TGF-β mRNA的差异均无统计学意义(P>0.05)。结论  阿司匹林可抑制炎症细胞分泌TGF-β、IL-4和TNF-α,减轻博莱霉素导致的肺间质纤维化反应,其作用机制可能与下调TGF β mRNA和蛋白的表达有关。