巢式PCR联合焦磷酸测序法在乙型肝炎病毒耐药基因检测中的敏感性与特异性分析

目的评价巢式PCR联合焦磷酸测序法在乙型肝炎病毒(HBV)耐药基因检测中的敏感与特异性。方法选取rtM204I(ATT)突变型和rtM204(ATG)未突变型质粒,按照不同比例混合后,采用巢式PCR联合焦磷酸测序法对突变位点进行检测,并与常规PCR焦磷酸测序法进行比较,对两种方法的线性及一致性进行分析;选取不同病毒载量临床标本,采用巢式PCR焦磷酸测序法检测耐药突变位点,并与巢式PCR Sanger测序法进行比较,对两种方法的敏感性及特异性进行分析。结果常规PCR焦磷酸测序和巢式PCR焦磷酸测序结果拟合曲线R2>0.99,P<0.05,线性模型有显著性意义。分别将常规PCR焦磷酸测序和巢式PCR焦磷酸测序结果与预测值的差值进行分析,巢式PCR能够较常规PCR更好的反映实际值,在90%比例处优于常规PCR。临床75例患者标本巢式PCR Sanger测序与巢式PCR联合焦磷酸测序结果灵敏性比较提示,Sanger测序的灵敏性为92%,巢式PCR联合焦磷酸测序的灵敏性达到100%,差异有统计学意义(P<0.01)。对于不同病毒拷贝数标本的灵敏性不同,其差异主要表现在低浓度组(HBV DNA≤3log10 copies/ml),Sanger测序的灵敏性为78%,而焦磷酸测序的灵敏性可以达到100%,差异有统计学意义(P<0.01)。阴性对照,两种方法均未检出HBV病毒,两种方法的特异性均较好。结论巢式PCR联合焦磷酸测序的方法监测乙肝病毒变异同巢式PCR联合sanger测序相比,有更好的灵敏性,尤其是在低病毒拷贝数时,差异明显,这对于临床提早发现耐药突变株,指导临床及时更换用药有重要意义。     

丙型肝炎核心抗原与HCV-RNA含量的相关性研究

目的:探讨定性检测丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-c Ag)与丙型肝炎RNA(HCV-RNA)载量的相关性。方法:选取收治的75例丙型肝炎患者的资料,所有患者均进行血清HCV-RNA和HCV-c Ag检测,根据患者血清HCV-RNA含量分为A组(8例)、B组(29例)、C组(38例),HCV-RNA含量分别为103~104(IU/ml)、104~106(IU/ml)、106~109(IU/ml),同时记录三组患者血清HCV-c Ag阳性率。结果:三组患者HCV-c Ag阳性例数分别为3例(37.5%)、17例(58.6%)、36例(94.7%),经统计分析,丙型肝(HCV-c Ag阳性率与病毒载量HCV-RNA含量呈正相关。结论:HCV-c Ag检测试剂盒有高度敏感性和特异性,缩短了HCV检测的窗口期,对HCV-RNA含量高的HCV感染患者诊断价值较高。     

焦磷酸测序技术快速测定肾移植受体人群CYP3A5*3基因多态性方法的建立

目的 建立基于焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)肾移植受体CYP3A5*3基因多态性的简单、快速、准确、高通量的检测方法.方法 提取221例肾移植受体和200例健康人外周血基因组DNA,应用PyroMark ID焦磷酸测序仪进行焦磷酸测序,采用Sanger法DNA测序作为标准对照,观察分析焦磷酸测序法的可靠性,并分析肾移植受体人群CYP3A5*3多态性的分布.结果 建立了基于焦磷酸测序技术的CYP3AS*3基因多态性检测新方法,实现了DNA标本的快速、可靠、高通量检测,经重复性检测和Sanger标准法DNA测序可靠性检测,用焦磷酸测序技术检测CYP3A5*3多态性的突变检出率及重复率均达100%.221例肾移植受体CYP3AS*3基因型分布:*1/*1型为23例(10.4%),*1/*3型为89例(40.3%),*3/*3型为109例(49.3%),与正常人群比较等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡.结论 与传统的测序方法相比,焦磷酸测序法能够简单、快速、准确地测定肾移植受体CYP3A5*3基因型,适合临床推广应用.     

基因芯片法和测序法检测乙肝病毒基因分型的耐药突变比较

目的比较基因芯片法和测序法检测乙肝病毒基因分型及耐药突变基因的一致性。方法采用基因芯片法和测序法对120例慢性乙型肝炎患者血清标本(HBV-DNA1×103 IU/ml)进行检测,比较两种方法检测乙肝病毒基因分型和耐药突变基因的情况。结果 120例慢性乙型肝炎患者血清中,测序法检出B型52例(43.33%)、C型68例(56.67%);基因芯片法检出B型48例(40.00%)、C型64例(53.33%)、B+C混合型4例(3.33%),有4例未能分型(3.33%);测序有54例发生耐药位点突变,突变率为45.00%;基因芯片有58例发生耐药位点突变,检出率48.33%;以共有的耐药位点来统计,基因芯片法的变异检出数稍高于直接测序法,两种检测方法间差异无统计学意义。结论基因芯片法和测序法在同时进行乙肝病毒基因分型和耐药突交基因的检测中,可认为检测结果一致。     

核酸检测在血液传染病筛查的应用价值

目的 探讨核酸检测在血液传染病筛查[乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)]的应用价值.方法 选取2018-2019年在该院住院因手术或输血需要检测乙肝五项和抗HCV、HIV抗原抗体的500例患者血清标本.化学发光法检测乙肝五项、抗HCV、HIV抗原抗体,提取核酸定性检测HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA.比较两种方法的检测结果,不一致的标本检测病毒载量确认最终结果.结果 检测出11例HBV化学发光与核酸定性结果不一致标本,未检出HCV和HIV化学发光与核酸定性结果不一致标本.2例HBsAg阳性HBV DNA定性阴性检测标本检测载量均小于20 IU/mL.9例HB-sAg阴性HBV DNA定性阳性样品中2例未检测到HBV DNA载量,6例标本检测到HBV DNA载量小于20 IU/mL,1例标本HBV DNA载量为23.6 IU/mL.结论 HBV、HCV、HIV病原体核酸检测有利于检测出窗口期和免疫状态异常的感染者.     

丙肝病毒核心抗原的检测在诊断丙肝中的意义

目的：通过分别检测丙肝病毒抗体（HCV-Ab）、丙肝病毒核心抗原（HCV-cAg）和定量检测HCV-RNA,探究丙肝病毒核心抗原检测对于丙型肝炎诊断的意义。方法对36例丙肝抗体阳性患者和120例丙肝抗体阴性患者同时检测HCV-Ab、HCV-cAg和HCV-RNA。丙肝抗体检测采用间接ELISA法,丙肝核心抗原检测采用双抗体夹心ELISA法,丙肝HCV-RNA检测采用荧光PCR法定量检测。结果36例丙肝抗体阳性组中,HCV-cAg阳性28例,HCV-RNA阳性25例。120例丙肝抗体阴性的门诊肝炎患者中HCV-cAg阳性有2例,HCV-RNA阳性有1例。结论 HCV-cAg检测可以缩短HCV抗体检测窗口期,特异性高,操作简便,可将二者联合起来,提高丙型肝炎病毒的检出率及准确度。     

PCR-电化学基因芯片法在人乳头瘤病毒感染检测中的价值

目的 对PCR-电化学基因芯片法检测人乳头瘤病毒(HPV)核酸进行方法学评价.方法 收集贵州省某三甲医院309例宫颈脱落细胞有效样本,采用PCR-电化学基因芯片法检测人乳头瘤病毒并分型,以Sanger测序法为金标准,并与临床常用的荧光PCR法作比较,分别统计分析PCR-电化学基因芯片法与Sanger测序法和荧光PCR法检测结果的一致性和差异,并比较PCR-电化学基因芯片法和荧光PCR法的诊断效能.结果 采用3种方法分别对309例有效样本进行HPV检测,均检测到20种不同的HPV基因型;PCR-电化学基因芯片法与Sanger测序法(Kappa=0.955,P<0.001)和荧光PCR法(Kappa=0.944,P<0.001)检测结果均有较高的一致性;与测序法金标准相比,PCR-电化学基因芯片法出现4例假阴性,1例分型结果不一致;PCR-电化学基因芯片法的敏感性为98.44％、特异性为100％、阳性预测值为100％、阴性预测值为92.86％、符合率为98.71％,荧光PCR法敏感性为100％、特异性为98.08％、阳性预测值为99.61％、阴性预测值为92.86％和符合率为99.68％.结论 PCR-电化学基因芯片法与Sanger测序法和荧光PCR法的一致性良好,且具有高特异性和阳性预测值,可作为临床HPV感染检测方法的补充.     

PCR法与ELISA法检测丙型肝炎病毒及乙型肝炎病毒比较

目的:探讨PCR与ELISA 2种方法检测丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒的差异和临床意义.方法:随机抽取无偿献血者标本300份,分为ALT升高组和ALT正常组,用ELISA法检测抗-HCV和HbsAg,用RT-PCR检测HCV-RNA和HBV-DNA.结果:抗-HCV阳性标本26例阳性率为8.7%,经RT-PCR检测,HCV-RNA均为阳性,抗-HCV阴性的标本中有2例HCV-RNA为阳性.HCV-RNA的阳性率为16%,2种方法检测结果差异有统计学意义(P<0.01);300份标本中HBsAg阳性和HBV-DNA阳性比率分别为11.3%和12.7%,两者无明显差异(P>0.05).结论:ELISA方法检测丙型肝炎病毒存在一定的漏检现象,应用RT-PCR检测HCV-DNA利于早期诊断,也是筛选献血员是否携带丙型肝炎病毒的较可靠方法.     

高通量测序检测拉米夫定抗乙肝病毒治疗的耐药突变

目的：建立一种高通量、快速检测拉夫米定耐药突变的新方法,指导临床抗病毒治疗药物的选择。方法：选取 150例慢性乙型肝炎患者血清标本为研究对象,乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）DNA定量结果均阳性（拷贝数≥１03拷贝/ml）,设计针对聚合酶P区的扩增引物,经 PCR扩增及磁珠分离,制备焦磷酸测序单链模板,并在 PyroMark ID遗传分析系统上进行焦磷酸测序,检测拉夫米定耐药突变位点。结果：PCR扩增得到 HBV P区产物,焦磷酸测序检测突变频率具有极高的灵敏性、特异性、稳定性的高通量的特征且与拉夫米定用药时间存在相关性。用药时间越长,突变率越高,易出现耐药。结论：新型、高通量焦磷酸测序法用于拉米夫定耐药突变检测,能满足临床批量用药检测及治疗方案设计的需要。     

异柠檬酸脱氢酶1基因突变焦磷酸测序检测方法的建立

目的建立异柠檬酸脱氢酶1（isocitrate dehydrogenase 1,IDH1）基因突变的焦磷酸测序检测方法,确定该方法的检测灵敏度。分析焦磷酸测序法与直接测序法对于鉴定IDH1突变的差异。方法构建携带野生型和突变型IDH1基因的质粒,使用质粒优化焦磷酸测序方法。使用已知比例的野生型和突变型质粒作为模版,确定突变的检测灵敏度。针对96例胶质瘤患者手术切除标本的基因组DNA,分别使用直接测序法和焦磷酸测序法,鉴定IDH1基因突变类型,并比较。结果使用焦磷酸测序能够检测到低至2%的IDH1突变。直接测序检出突变阳性率为32.3%、焦磷酸测序检出突变阳性率为74.0%。结论焦磷酸测序法检测IDH1基因突变灵敏可靠,适合临床分子诊断。     

应用巢式PCR检测原发性肝癌患者血清中HCV—RNA

为了探讨原发性肝癌的发生是否与丙型肝炎病毒有关,应用巢式PCR技术和ELISA检测40例原发性肝癌患者及50例除外肝病患者血清中HCV—RNA及抗HCV抗体和乙肝二对半。结果:原发性肝癌组中,乙肝二对半阳性37例(92.5％),抗HCV阳性8例(20％),HCV—RNA阳性13例(32.5％),HCV总感染率为35.0％(14例);对照组分别为16例(40.0％),2例(4.0％)及3例(6.0％)。在3例HBV—M阴性PHC患者中,HCV—RNA阳性2例。结论:在我国PHC的发生不仅与乙肝病毒感染有关,还与丙型肝炎病毒有关。     

应用多色探针熔解曲线法检测G6PD缺乏症杂合子的基因突变

目的 应用多色探针熔解曲线法(multicolor melting curve analysis,MMCA),建立一种快速筛查葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD) 缺乏症杂合子的临床方法.方法 收集重庆地区2015年1月至2016年7月共429例(男性342例,女性87例) 疑似G6PD缺乏症的患者外周血,采用G6PD/6PGD定量比值法和MMCA法分别检测男性和女性G6PD酶活性和基因突变,以金标准Sanger测序来评价两种方法.同时收集重庆地区进行G6PD缺乏症新生儿疾病筛查的1 754份女性末梢血滤纸片,采用MMCA法筛查G6PD基因突变.结果 429例疑似病例中,G6PD/6PGD定量比值法诊断男性的灵敏度96. 8％、特异性100％,与Sanger测序法一致性好(Kappa = 0. 917,P＜0. 05);但女性的灵敏度仅10％,特异性100％,与Sanger测序法一致性差(Kappa = 0. 127,P＜0. 05) .MMCA法诊断男性的灵敏度95. 7％,特异性100％,与Sanger测序法一致性较好(Kappa = 0. 891,P＜0. 05);女性的灵敏度100％,特异性100％,与Sanger测序法结果完全吻合(Kappa = 1. 000,P＜0. 05) .1 754例女性中杂合子占1. 14％(20 /1 754), G6PD酶活性均正常.结论与传统的G6PD/6PGD定量比值法比较,MMCA法检测杂合子灵敏度更高,可用于G6PD缺乏症杂合子筛查,为一种简便、准确的诊断新方法.     

丙型肝炎患者5080例Anti-HCV、HCV-RNA及基因分型分析

目的:对5 080例丙型肝炎患者Anti-HCV、HCV-RNA及基因分型三项检验结果进行分析。方法:采用增强发光免疫法检测Anti-HCV;实时荧光定量PCR法检验HCV-RNA;HCV-RNA含量≥103的标本同时进行基因分型检测。结果:5 080例丙型肝炎患者中Anti-HCV检测阳性率为99.8%,HCV-RNA阳性率为49.1%。HCV-RNA阳性患者年龄和抗体含量均明显高于HCV-RNA阴性患者(P<0.01)。在进行基因分型的1 723例HCV-RNA阳性标本中,1b、2a分别占59.49%和36.20%,两型总占比达到95.69%;另外3b和4不常见型以及1b/2a、1b/4混合感染也检测到。结论:Anti-HCV含量与患者的病毒载量之间缺乏相关性,不能作为丙型肝炎治疗过程中的动态观察指标;HCV-RNA定量适于丙型肝炎疗效评价和预后判断指标;临床丙型肝炎患者中主要基因型是1b、2a型,对HCV-RNA阳性患者进行基因分型,可为丙型肝炎的个性化治疗提供决策依据。     

乙肝病毒基因分型检测芯片的构建及初步应用

目的:构建乙肝病毒(HBV)常见基因型的分型芯片,并应用分型芯片调查HBV基因型分布。方法:应用生物信息学软件针对乙肝病毒4种常见基因型的特征区域和保守区域分别设计分型探针和通用探针,在优化条件下通过重复杂交及分型测序检验芯片的重复性与可靠性后应用于临床,对150例不同类型的乙肝患者进行HBV基因分型。结果:分型探针和通用探针检测重现率分别为94.7%及100%,反馈的测序结果与芯片分型结果完全一致;经芯片分型发现辽宁省HBV基因型分别为C型占68.7%,B型占22.7%,B、C混合型占8.7%,未发现A、D型。结论:基因芯片技术为乙肝病毒基因分型提供了快速准确的检测方法,辽宁地区HBV基因型分布以B、C两型为主,C型占主要优势。     

KCTD10基因干扰RNA慢病毒载体的构建

目的:构建KCTD10干扰RNA慢病毒载体.方法:合成KCTD10干扰序列,构建GV248-KCTD10-RNAi慢病毒干扰载体,利用PCR与测序验证阳性克隆.将KCTD10 siRNA干扰病毒载体与质粒pHelper1.0和质粒pHelper2.0三个载体共同转染293T细胞,使细胞合成并分泌释放病毒颗粒.收集病毒颗粒并检测病毒滴度.结果:GV248-KCTD10-RNAi慢病毒载体成功被连接转化,测序结果与设计序列一致;共转后收获KCTD10 siRNA慢病毒颗粒,检测其滴度为5×108TU/mL.结论:成功包装了KCTD10 siRNA慢病毒颗粒,为后续进一步研究KCTD10基因在糖尿病视网膜病变中的作用奠定了基础.     

一种HBV DNA 定量检测试剂的准确性分析

目的 评价一种新型HBV DNA 定量检测试剂的准确性。方法 将第3 代HBV DNA WHO 国 际标准品稀释为6 种不同梯度浓度样本,8.5×105、8.5×104、8.5×103、8.5×102、85 及42.5 IU/ml,用待评价 试剂careHBV PCR Assay V3.0 检测,并对实测值和理论值进行相关性分析;以Cobas Taqman HBV V2.0 为参 比试剂,用careHBV PCR Assay V3.0 检测93 份HBV 感染者标本和30 份健康者标本HBV DNA 含量,并对2 种试剂定量检测结果进行相关性和一致性分析;采用巢式PCR 扩增漏检标本的HBV S 区,直接测序法测定 其基因型。结果 careHBV PCR Assay V3.0 检测WHO 国际标准品的实测值和理论值具有线性相关;2 种定 量试剂检测93 份HBV 感染者标本结果均阳性共68 份,检测结果呈线性相关,差异无统计学意义（P >0.05）, 但careHBV PCR Assay V3.0 检测值相对偏低;careHBV PCR Assay V3.0 检测有14 份标本漏检,其中13 份标 本Cobas Taqman HBV V2.0 检测结果位于30 ～ 2 000 IU/ml 间;对1 份漏检标本的基因型检测结果为C 型。 结论 careHBV PCR Assay V3.0 与Cobas Taqman HBV V2.0 试剂检测结果有较好的相关性,但对基因型C 型 的标本可能存在漏检现象。     

干扰素治疗前后肝组织内HCV—RNA变化分析

目的：探讨干扰素治疗前后,肝组织内丙型肝炎病毒ＲＮＡ（ＨＣＶ－ ＲＮＡ） 的变化与血中ＨＣＶ－ ＲＮＡ 及ＡＬＴ 的关系。方法：对丙型慢性肝炎（ＣＡＨ） 患者２０ 例,经过干扰素（ＩＦＮ） 治疗,使用逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ ＰＣＲ） 和原位杂交方法（ＩＳＨ） ,对肝组织内和血中ＨＣＶ－ ＲＮＡ 及ＡＬＴ 值分析。结果：ＩＦＮ 治疗丙型ＣＡＨ 的有效率为７０ ％ ,停药后６ 个月有效率为３０ ％ 。血中ＨＣＶ－ ＲＮＡ 转阴率为５５ ％ ,停药后６ 个月转阴率为１５ ％ 。肝组织中ＨＣＶ－ ＲＮＡ,经治疗消失的有３ 例,占１５ ％ 。结论：肝组织中ＨＣＶ－ ＲＮＡ 的有无,对ＩＦＮ 疗效的判定非常重要,即使血中ＨＣＶ－ ＲＮＡ 阴性、ＡＬＴ 正常的病例,如果肝组织中有ＨＣＶ－ＲＮＡ 残留,以后血中ＡＬＴ 值上升的可能性很大,应该进行抗病毒的再治疗。     

丙肝患者血清HCV-Ab、HCV-cAg、HCV-RNA检测的比较及肝功能的相关性研究

目的 探讨HCV-Ab、HCV-cAg、HCV-RNA及ALT、AST、γ-GT的相关性及临床应用价值.方法 ELISA方法检测HCV-Ab、HCV-cAg,PCR-荧光探针法检测HCV-RNA,全自动生化分析仪检测ALT、AST、γ-GT.结果 检测HCV感染者186例,其中HCV-Ab、HCV-cAg的阳性率分别为95.7％、25.3％、82.7％.ALT、AST、γ-GT水平与HCV病毒载量呈正相关（P＜0.01）.结论 同时检测HCV-Ab、HCV-cAg、HCV-RNA可充分掌握丙肝患者病毒感染情况,以及检测ALT、AST、γ-GT对抗病毒治疗的疗效评价及治疗时间有重要意义.