目的 探讨microRNA-10b（miR-10b）及其靶基因同源异性盒基因HOXD10在肝癌细胞中的表达及转染miR-10b对肝癌细胞侵袭性能力的影响。方法 分析HOXD10基因在3种肝癌细胞株Huh7、HepG2、SMMC-7721中的基础表达量,筛选出HOXD10基础表达量高的HepG2作为后续研究对象。设计合成外源性miR-10b序列,用脂质体瞬时转染肝癌细胞株,设置miR-10b转染组、无关序列转染组（阴性对照组）和未处理组（对照组）。用RT-PCR及Western blot检测肝癌细胞转染miR-10b后HOXD10基因及蛋白表达量的变化,细胞侵袭实验研究转染miR-10b对肝癌细胞侵袭能力。结果 在基因水平和Western blot分析蛋白水平HOXD10基因表达量2-ΔΔCT分别是（1.24±0.23）、（1.00±0.02）,P >0.05差异无统计学意义。在蛋白分析HepG2细胞灰度计算值是值分别是653.492和1 968.742,蛋白水平表达降低。HOXD10基因在肝癌细胞株HepG2的表达量显著高于Huh7和SMMC-7721;miR-10b成功转染HepG2后,HOXD10基因表达水平与对照组比较无明显变化,但HOXD10蛋白表达量与对照组比较下降及侵袭性也增强。结论 miR-10b可能通过抑制靶基因HOXD10表达发挥作用,促进肝癌细胞的侵袭。
相似文献目的 探讨过氧化物酶1（Prx 1）在肝癌形成和恶性进展中的作用。方法 蛋白质印迹法（Western blot）检测远癌肝组织和近癌肝组织中Prx 1、pAkt及Akt表达差异。肝细胞饥饿培养24 h后,10 ng/ml表皮生长因子（EGF）处理10 min,提取总蛋白,Western blot检测Prx 1、pAkt、不同位点磷酸化表皮生长因子受体（EGFR）和总EGFR。Western blot检测检测未处理组、转染无义shRNA组及转染Prx 1 shRNA组HepG2细胞中Prx 1蛋白的表达。DCFH-DA法检测3种HepG2细胞中活性氧簇总量。转染无义shRNA组及转染Prx 1 shRNA组HepG2细胞皮下注射至SCID小鼠,注射后每周测量1次皮下肿瘤体积。Western blot检测两组小鼠皮下肿瘤组织中Prx 1和pAkt的表达情况。结果 与正常肝细胞比较,Prx 1在肝转化细胞中表达升高。Prx 1增强了EGF介导的EGFR和Akt激活。Prx 1表达沉默抑制了HepG2体内成瘤能力。减少HepG2皮下移植瘤的肝转移。Prx 1表达沉默还抑制了Akt体内激活。结论 Prx 1具有调控人肝细胞中EGFR介导信号通路的潜在作用。Prx 1能够通过EGFR-Akt信号通路介导细胞正常至异常转化、肿瘤形成及转移
相似文献目的 探讨EBERs对鼻咽癌转移的作用及其机制。方法 在鼻咽癌细胞中转染EBERs,荧光定量PCR（RT-PCR）检测细胞中转移相关指标（如MMP）的相对表达量,同时 Transwell检测EBERs对鼻咽癌细胞迁移能力的影响。构建敲除EBERs的BAC-EBV（p2089）质粒,转染鼻咽癌细胞,检测细胞的转移能力。转染EBERs后Western blot检测上皮间质转化（EMT）相关指标,免疫荧光检测ZO-1的表达。结果 鼻咽癌细胞转染EBERs质粒或p2089质粒后,RT-PCR检测发现转移相关指标表达升高,Transwell检测结果显示细胞迁移能力增强,而在干扰EBERs或转染敲除EBERs的p2089质粒后,转移能力减弱。转染EBERs后E-cadherin表达降低,Vimentin升高,同时免疫荧光检测发现ZO-1表达降低。结论 EBERs可能通过促进EMT高表达而促进鼻咽癌的转移。
相似文献目的 构建一种可以实现丁型肝炎病毒（HDV）复制包装的HDV转座子载体。方法 采用分子克隆方法构建含HDV复制子和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）表达框的转座子（PB）载体PB126I3,将构建好的载体转染HuH-7细胞,转染48 h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达,转染48 h后收集细胞上清用酶联免疫吸附法（ELISA）检测HBsAg的表达,质粒转染细胞8.5 d后提取病毒用逆转录荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测HDV核糖核酸（RNA）的含量;同时细胞上清病毒浓缩后感染HBV受体钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白（Na+/NTCP）稳定转染的HepG2.N9细胞系并于感染后第7天用免疫荧光检测细胞内HDVδ抗原的表达。结果 HDV复制包装载体PB126I3瞬时转染HuH-7后细胞上清可检测到HBsAg的表达和较高滴度的HDV颗粒,并且该病毒颗粒感染HepG2.N9细胞7 d后细胞内可检测到HDVδ抗原。结论 HDV复制包装转座子载体构建成功,为未来HDV的大规模复制包装以及尝试建立HDV稳定转染细胞系提供前期基础。
相似文献目的 观察Brahma相关基因1（BRG1）在脂多糖（LPS）诱导的急性肝炎中的表达变化,并观察干预BRG1表达对炎症因子分泌的影响。方法 体内实验,腹腔注射LPS（2.5 mg/kg）构建小鼠肝炎模型,通过免疫组织化学及蛋白免疫印迹法（Western blot）检测BRG1的表达变化;体外实验,在人肝细胞HepG2及HepaRG培养基中加入LPS（100 ng/ml）,Western blot检测BRG1的表达变化,转染BRG1质粒或特异性siRNA,通过ELISA检测白细胞介素1（IL-1）、白细胞介素6（IL-6）及肿瘤坏死因子α（TNF-α）等促炎因子的分泌。结果 体内实验,腹腔注射LPS（2.5 mg/kg）可以显著诱导小鼠的肝细胞坏死,肝细胞核浓聚,肝小叶组织结构破坏及ALT、AST的水平明显升高;同时LPS处理后肝细胞中的BRG1表达上升,BRG1在细胞核中浓聚。体外实验,LPS（100 ng/ml）处理后的HepG2及HepaRG细胞中BRG1的表达升高。同时BRG1过表达可显著促进促炎因子IL-1、IL-6及TNF-α的释放,相反BRG1沉默后可显著抑制促炎因子IL-1、IL-6及TNF-α的释放。结论 LPS可促进小鼠肝脏中及体外培养肝细胞的BRG1蛋白表达,干预BRG1表达可影响细胞释放IL-1、IL-6及TNF-α的能力。
相似文献目的 探讨胶原诱导的大鼠类风湿性关节炎（RA）模型中,Th22和白细胞介素-22（IL-22）的水平及其可能的机制。方法 构建胶原诱导的大鼠RA模型后,流式细胞术检测Th22细胞,Real-time PCR检测IL-22 mRNA表达水平,ELISA检测IL-22蛋白表达水平;用IL-22封闭抗体中和RA大鼠体内IL-22后,CCK-8实验检测RAFLS细胞增殖,Real-time PCR检测IL-22和STAT3 mRNA表达水平,Western blot检测STAT3蛋白表达水平。结果 与对照组比较,RA大鼠全血中的Th22细胞和血清IL-22的表达显著增加（P < 0.01）;用IL-22封闭抗体中和RA大鼠体内IL-22后,与对照组比较,RA大鼠血清IL-22显著下降（P <0.01）,RAFLS细胞增殖能力下降（P <0.01）,RAFLS细胞中STAT3基因和蛋白水平的表达显著较少（P <0.01）。结论 RA大鼠模型中,Th22细胞通过分泌过多的IL-22刺激STAT3信号途径,从而提升RAFLS细胞的增殖能力,参与大鼠RA的发病。
相似文献目的 建立高感染效率、稳定过表达microRNA-29a（miR-29a）的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12）,探索miR-29a对PC12细胞凋亡的影响。方法 将miR-29a前体表达载体、空白对照载体进行慢病毒包装,用病毒上清感染PC12并进行抗性筛选。实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测miR-29a的表达,流式细胞术检测miR-29a稳定过表达组、空质粒对照组以及未感染组PC12细胞的凋亡情况,利用TargetScan 6.0数据库预测miR-29a的关键靶点,RT-qPCR以及Western blot检测预测的miR-29a下游靶基因mRNA以及蛋白表达的变化。结果 经抗性筛选后获得稳定表达miR-29a的PC12细胞系,荧光显微镜下观察各组PC12细胞的感染效率均达80%以上,miR-29a过表达组凋亡率为（5.1±0.92）%,空质粒对照组为（1.832±0.26）%,未感染组为（1.667±0.185）%,miR-29a过表达促进PC12细胞凋亡（P <0.01）,空质粒对照组与未感染组细胞凋亡率比较,差异无统计学意义;RT-qPCR检测miR-29a过表达时锌指蛋白91（ZFP91）的表达量升高,miR-29a过表达组ZFP91 mRNA的表达量是空质粒对照组的1.835倍（P =0.000）,空质粒对照组与未感染组ZFP91 mRNA的表达量比较差异无统计学意义;Western blot检测的ZFP91蛋白表达量与空质粒对照组比较也升高。结论 在PC12中miR-29a过表达促进PC12细胞凋亡,过表达miR-29a也促进ZFP91表达,其机制仍待进一步阐明。
相似文献摘要：目的 构建含人干细胞白血病（SCL）基因的重组慢病毒载体,并转染体外培养的Cajal样间质细胞（ICC）,为进一步利用慢病毒表达载体行体内实验奠定基础。方法 通过聚合酶链反应（PCR）将人SCL基质粒内的遗传物质扩增,与慢病毒载体质粒GV287-EGFP结合,构建重组质粒GV287-EGFP/SCL,通过Western blot检测及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度。体外分离、培养及鉴定ICC,重组慢病毒载体以感染复数（MOI）值为0.5、1.0、5.0、10.0、50.0和100.0时,分别转染ICC,通过激光共聚焦显微镜观察,计算不同MOI值的转染效果,确定最佳MOI值。重组慢病毒载体以最佳MOI值感染ICC作为实验组,以空载体转染的ICC（空载体组）及未转染的ICC（空白组）作为对照,通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测SCL基因在ICC中的表达。结果 经Western blot检测及基因测序鉴定SCL重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染ICC,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光。MOI为10时转染效果最佳,转染效率>85%;RT-PCR结果表明,实验组SCL基因的表达量高于空载体组和空白组。结论 成功制备人SCL基因重组慢病毒载体,并能高效转染ICC,介导SCL基因在ICC中表达。
相似文献目的 研究Twist蛋白在结直肠癌中的表达水平,其对结直肠癌细胞的增殖以及侵袭能力的影响,并探讨其促进癌症发展具体的机制。方法 经结肠镜活检取20例患者组织和20例正常人的标本,采用实时定量PCR的方法检测了Twist的mRNA表达水平。采用脂质转染法对结直肠癌细胞系CT-26细胞进行RNA干扰,采用CCK-8法及transwell法观察干扰Twist后对结直肠癌细胞的增殖以及侵袭能力的影响;采用RT-PCR以及Western blot检测了CT-26细胞中MMP-9的mRNA及蛋白水平。结果 Twist在结直肠癌组织中的mRNA水平显著高于对应癌旁组织以及对照组（P <0.05）;在伴有淋巴结转移的癌组织中Twist mRNA的表达水平显著高于无淋巴结转移的组织（P <0.05）;与转染对照组比较,Twist siRNA转染的CT-26细胞增殖水平及迁徙能力均显著降低（P <0.05）;干扰Twist的CT-26细胞能够显著降低金属蛋白酶MMP-9 mRNA及蛋白的水平。结论 Twist蛋白能够增加结直肠癌癌细胞的增殖及迁徙能力,其影响机制可能与金属蛋白酶MMP-9有关。
相似文献目的 探讨白藜芦醇对前列腺癌细胞株PC-3增殖及转化生长因子β1（TGF-β1）/Smad2信号通路的影响。方法 不同浓度白藜芦醇干预体外培养前列腺癌细胞株PC-3白藜芦醇不同时间。MTT检测白藜芦醇对PC-3细胞生长情况的影响,流式细胞术检测细胞周期的变化情况,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）分别检测细胞内TGF-β1和Smad2 mRNA和蛋白表达水平的变化情况。 结果 MTT结果显示白藜芦醇显著抑制了前列腺癌细胞的生长。流式细胞结果表明白藜芦醇明显降低了前列腺癌细胞S期含量而增加了G0/G1期含量。而TGF-β1和其下游因子Smad2的mRNA和蛋白水平的表达也明显受到白藜芦醇的抑制,且这种抑制作用呈浓度一时间依赖性。结论 白藜芦醇可能够通过阻断TGF-β1/Smad2信号通路抑制前列腺癌细胞生长前列腺癌。
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