MiR-671-5p通过负向调控SMAD3抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭

目的 探讨miR-671-5p影响骨肉瘤的迁移侵袭的相关机制。方法 通过NCBI在线数据库筛选骨肉瘤中差异表达的微小RNA（miRNA）、预测miRNA的靶蛋白并进行功能分析;实时荧光定量PCR（qRT-PCR）用于检测转染过表达miR-671-5p质粒后con组和miR-671-5p组骨肉瘤细胞中miR-671-5p的表达情况;通过Transwell实验检测转染质粒后骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力;Western blot实验检测相关蛋白在骨肉瘤细胞中的表达情况;荧光素酶报告基因检测重组人SMAD家族成员3（SMAD3）的 3’UTR中是否含有miR-671-5p的结合位点。结果 MiR-671-5p在骨肉瘤组织和细胞中表达下调（P<0.05）。qRT-PCR证明转染过表达miR-671-5p质粒后,细胞转染成功（P<0.05）。过表达骨肉瘤细胞中的miR-671-5p后细胞的迁移和侵袭能力明显降低（P<0.05）,并且miR-671-5p能够抑制骨肉瘤细胞的上皮间质转化（EMT）（P<0.05）;Western blot结果显示SMAD3在骨肉瘤细胞中表达上调（P<0.05）;荧光素酶报告基因检测证实miR-671-5p与SMAD3的3’UTR之间存在结合位点（P<0.05）;Western blot结果显示转染过表达SMAD3质粒后,SMAD3表达明显升高（P<0.05）,而miR-671-5p能明显抑制SMAD3的表达（P< 0.05）;Transwell实验证明SMAD3能够促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力（P<0.05）,而miR-671-5p则能够逆转这种促进作用（P<0.05）。结论 MiR-671-5p能够通过负向调控SMAD3抑制骨肉瘤细胞迁移和侵袭能力。     

VIPR1启动子甲基化促进转录因子AP-2α下调VIPR1的表达并促进肝细胞癌的生长

目的 探讨血管活性肠肽受体1（VIPR1）在肝细胞癌（HCC）组织中低表达的转录调控机制和生物学功能。方法 肝癌细胞系Hep3B和Huh7常规培养,实验分为VIPR1启动子野生型组、启动子突变载体1组、启动子突变载体2组和启动子突变载体1+2组。双荧光素酶报告基因实验检测AP-2α表达对VIPR1启动子活性的影响;DNA甲基化转移酶抑制剂（DAC）处理肝癌细胞,焦磷酸测序法检测VIPR1启动子甲基化水平的变化;染色质免疫共沉淀检测AP-2α与VIPR1启动子的结合能力;Western blot检测AP-2α的敲减作用以及VIPR1的表达;Western blot 检测两种细胞株中VIPR1的差异表达;qPCR和Western blot检测VIPR1过表达和敲减效果;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡;CCK8实验检测细胞增殖。建立裸鼠移植瘤模型,检测LV-NC组和LV-VIPR1组中肿瘤的体积和质量。结果 与VIPR1启动子野生型组相比,启动子突变载体1+2与AP-2α表达质粒共转染后,荧光素酶活性明显恢复（P<0.05）;DAC处理后,VIPR1启动子甲基化水平降低,并且随着甲基化程度减弱,与VIPR1启动子结合的AP-2α显著减少（P<0.01）;敲减AP-2α后,VIPR1表达上升;Huh7细胞株中VIPR1表达低于Hep3B细胞株,在两种细胞株中成功构建了VIPR1过表达和敲减模型,VIPR1过表达增加了G2/M期的细胞数量（P<0.01）,凋亡细胞显著增加（P<0.001）,细胞增殖受到抑制（P<0.001）,而VIPR1敲低则相反。体内实验表明VIPR1过表达组的肿瘤体积减小（P<0.001）,肿瘤量降低（P<0.05）。结论 HCC中VIPR1的启动子甲基化促进了转录因子AP-2α的结合,并且抑制了VIPR1表达,而VIPR1过表达可使细胞周期阻滞在G2/M期,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖和肿瘤生长。     

转录因子MZF1对大鼠RGC32基因启动活性的影响及可能的结合部位

目的 :构建大鼠补体应答基因32(response gene to complement,RGC32)启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察人胚肾细胞(HEK293)过表达髓锌指基因1(myeloid zinc finger gene1,MZF1)对大鼠RGC32基因启动活性的影响。同时,筛选其可能的MZF1结合位点。方法:将RGC32基因启动子全长(-686~-1 nt)插入到荧光素酶报告基因载体p GL3-basic中,获得RGC32基因启动子全长荧光素酶报告质粒(p GL3-RGC32-FL)后,再将p GL3-RGC32-FL与本课题组前期构建的大鼠野生型MZF1表达质粒(p IRES2-EGFP-MZF1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,以确定MZF1对RGC32基因的启动作用。另用生物信息学软件预测RGC32基因启动子上转录因子MZF1潜在的结合位点,并据此构建3个RGC32基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3)。将上述RGC32基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒与MZF1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,以筛选MZF1的结合位点。结果:菌液PCR及核酸测序证实,大鼠RGC32基因启动子(全长和各截短)的荧光素酶报告质粒均构建成功。将p GL3-RGC32-FL和p IRES2-EGFPMZF1共转染HEK293细胞发现,RGC32基因启动子活性显著增加。而将p GL3-RGC32-FL、p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3分别与p IRES2-EGFP-MZF1共转染HEK293细胞后显示,p GL3-RGC32-3的启动活性显著低于p GL3-RGC32-FL、p GL3-RGC32-1和p GL3-RGC32-2。提示MZF1可能结合在RGC32基因启动子的-286~-86 nt区域。结论 :成功构建了大鼠RGC32基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,证实过表达MZF1可促进RGC32基因的启动,并初步筛查出转录因子MZF1在RGC32基因启动子上可能的结合区域。     

circ0000781通过吸附miR-21-5p调控BTG2表达抑制骨肉瘤增殖和侵袭的机制

目的 探讨circ0000781通过吸附miR-21-5p调控BTG2表达在骨肉瘤增殖中的作用及机制,为骨肉瘤提供新的治疗靶点。方法 采用qRT-PCR检测骨肉瘤细胞中BTG2的表达,CCK-8法检测细胞增殖能力,Transwell法检测细胞侵袭能力,生物学数据库和双荧光素酶报告基因法证实BTG2与miR-21-5p、miR-21-5p与circ0000781靶向结合。结果 BTG2在骨肉瘤细胞中低表达,过表达BTG2可抑制骨肉瘤细胞的增殖活性及侵袭能力。miR-21-5p可靶向结合BTG2并负调控BTG2表达,circ0000781可靶向结合miR-21-5p并下调miR-21-5p的表达,过表达circ0000781可上调BTG2表达。结论 BTG2在骨肉瘤中作为抑癌基因发挥作用,circ0000781通过吸附miR-21-5p上调BTG2表达抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭。     

vMIP-ⅡN端肽对趋化因子受体CXCR4表达调控的机制研究

目的:探讨病毒巨噬细胞炎性蛋白Ⅱ（vMIP-Ⅱ）对乳腺癌细胞CXCR4表达的影响及分子机制。方法:设计并合成扩增CXCR4核心启动子基因序列,构建荧光素酶报告载体,酶切鉴定;通过检测报告基因荧光素酶活性反映病毒巨噬细胞炎性蛋白N端21肽（NT21MP）对CXCR4启动子的作用;通过荧光定量PCR技术和Western blot检测CXCR4干扰或过表达、HER-2干扰,以及miRNAs抑制剂和类似物转染后相关基因及miRNAs表达;采用磺酰罗丹明B（SRB）染色法检测细胞增殖活性,PI染色法检测细胞周期,Annexin V/PI染色法检测细胞凋亡。结果:NT21MP下调CXCR4的表达,并上调miR-125b、miR-135a和miR-146a的表达（P < 0.05~P < 0.01）;NT21MP降低CXCR4核心启动子的活性;SP1为CXCR4核心启动子高频结合转录因子,miR-135a可下调SP1的表达（P < 0.01）;过表达CXCR4上调HER-2表达（P < 0.01）,而干扰CXCR4表达则下调HER-2表达（P < 0.01）;miR-125b可下调HER-2的表达（P < 0.01）;HER-2表达下调诱导miR-146a的表达;miR-146a抑制CXCR4表达（P < 0.01）;相对于空白对照组,miR-146a和miR-135a均可抑制细胞增殖,阻断细胞周期,并诱导凋亡（P < 0.01）。结论:NT21MP通过诱导miR-125b、miR-135a和miR-146a负调控CXCR4的表达,从而抑制乳腺癌细胞的增殖能力,为NT21MP应用于乳腺癌患者的治疗提供了理论基础。     

高良姜素对人骨肉瘤MG-63细胞增殖的影响及其机制的研究

目的观察高良姜素对人骨肉瘤MG-63细胞增殖的影响并探讨其机制。方法体外培养人骨肉瘤MG-63细胞株,给予不同浓度的高良姜素处理24h,MTT法测定细胞活力,流式细胞仪分析细胞周期,Annexin V-FITC/PI双标记法测定细胞凋亡,Western blot分析Caspase-3、Cytochrome C及Bcl-2蛋白表达。结果高良姜素可导致人骨肉瘤MG-63细胞发生凋亡并抑制其增殖,其作用具有浓度依赖性,在80mM最为显著;同时可改变细胞周期分布。与对照组相比,80mM高良姜素处理24h后MG-63细胞活力降低、凋亡率增加（P〈0.01）;G0/G1期百分比增高,S＋G2＋M期百分比降低（P〈0.01）;Caspase-3、Cytochrome C表达增加,Bcl-2表达降低（P〈0.01）。结论高良姜素可诱导人骨肉瘤MG-63细胞发生凋亡、抑制其增殖,并改变细胞周期分布,其作用与线粒体途径相关。     

MEK／ERK信号通路活性表达与乳腺癌干细胞增殖和凋亡的关系

目的探讨MEK／ERK信号通路在乳腺癌干细胞增殖和凋亡中的作用。方法体外培养乳腺癌干细胞,采用MEK抑制剂PD98059抑制MEK／ERK信号通路表达,Western blot检测PD98059对p—ERK1／2表达的影响,进一步应用MTT法测定PD98059对乳腺癌干细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测细胞周期变化;同时,TUNEL荧光染色分析、Histone／DNAELISA和流式细胞术检测评价细胞凋亡。结果PD98059可有效下调p—ERK1／2表达,抑制乳腺癌干细胞生长,诱导G0／G1期抑制;TUNEL荧光染色,Histone／DNAELISA检测和流式细胞术检测分析显示PD98059可有效诱导乳腺癌干细胞凋亡。结论MEK／ERK信号通路在乳腺癌干细胞增殖和凋亡中发挥重要作用。     

miR-204-5p通过调控IL-11对甲状腺乳头状癌细胞恶性生物学行为的机制研究

目的 探讨miR-204-5p在甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)中的角色和生物学行为。方法qRT-PCR用于检测PTC细胞中miR-204-5p的表达水平,TPC-1细胞分别转染miR-204-5p或miR-neg观察两组生物学功能的变化。MTT用于检测细胞增殖;流式细胞术用于检测细胞凋亡水平和周期分布。生物信息学TargetScanHuaman 7.1用于预测靶点序列,双荧光素酶报告基因用于验证靶向位点。TPC-1细胞分别转染anti-miR-204-5p或anti-miR,qRT-PCR和Western blot法用于检测IL-11的表达水平。结果 miR-204-5p在PTC细胞中低表达(P<0.05)。通过过表达miR-204-5p可抑制TPC-1细胞增殖(P<0.05)并诱导细胞周期停滞(P<0.05)和细胞凋亡(P<0.05)。miR-204-5p可直接结合IL-11 mRNA的3′-UTR并且两者之间存在负性调节关系(P<0.05)。结论 miR-204-5p通过调节IL-11表达在TPC-1...     

β-防御素-2荧光素酶报告基因载体及克罗恩突变体的构建

目的：构建人β-防御素-2（hBD-2）荧光素酶报告基因质粒及其克罗恩病（Crohn’s,CD）相关突变体,并检测其在人胚胎肾T细胞（HEK-293T）中的活化．方法：通过基因重组构建包含hBD-2启动子序列的报告基因质粒hBD-2—780-luc,再通过定点突变技术在启动子区（-233位点）引入变异点（G变为C）,构建突变体hBD-2-mut-luc;经酶切及测序验证后,将报告基因质粒和野生型NOD2／CARD15蛋白真核表达载体共转染到HEK一293T中,TNF—α刺激后测定双荧光素酶的表达．结果：酶切和测序证实,构建了重组体hBD-2-780-luc及其突变体hBD-2-mut—luc,两者均能表达荧光素酶活性,且明显高于空载体．结论：hBD-2报告基因质粒hBD-2-780-luc及其CD相关突变体hBD-2-mut—luc构建成功,并在细胞内活化表达荧光素酶．     

Triad1调节K562细胞增殖、凋亡和耐药研究*

目的：研究Triad1对慢性髓细胞白血病（CML）细胞株K562增殖和凋亡的作用以及与伊马替尼（IM）耐药的关系。方法：将K562细胞进行血清饥饿培养,流式细胞仪检测细胞周期变化,蛋白免疫印迹法检测PCNA等增殖相关蛋白的表达。shRNA干扰K562细胞后细胞周期和凋亡的变化。构建耐药细胞K562R,蛋白免疫印迹法检测K562和K562R细胞中Triad1以及凋亡相关蛋白的表达。结果：（1）血清饥饿培养后K562细胞阻滞在G0/G1期,恢复血清培养后随着K562细胞增殖,Triad1表达减少,而PCNA等蛋白表达增加。（2）干扰Triad1表达后,K562细胞增殖能力增强,G1期细胞减少。（3）K562R细胞Triad1的表达下降,凋亡相关蛋白表达降低。结论：Triad1通过调节细胞周期来调节K562细胞的增殖,干扰Triad1可促进K562细胞增殖,凋亡减少,Triad1表达下降可能与K562细胞耐药相关。     

干扰AURKA基因表达对人骨肉瘤细胞系U2-OS细胞增殖与细胞周期的影响

目的:探讨AURKA基因表达下调对骨肉瘤细胞增殖和细胞周期分布的影响?方法:脂质体瞬时转染法介导AURKA 小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)处理骨肉瘤U2-OS细胞, 采用实时荧光定量PCR及 Western blot方法检测转染前后AURKA mRNA和蛋白表达,CCK8实验检测细胞活力变化,流式细胞术检测细胞周期分布变化,Western blot检测周期相关蛋白的表达,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)细胞增殖实验检测细胞增殖情况?结果:AURKA siRNA作用U2-OS细胞后, AURKA mRNA和蛋白的表达水平较正常对照组及阴性对照组显著降低,且差异有统计学意义 (P < 0.05),两对照组间AURKA表达无明显差异;下调AURKA表达后,细胞活力降低,且作用72 h后抑制率最高,约为(36.63 ± 2.38)%;细胞周期中S期细胞比例下降,G2/M期细胞比例增加,与正常对照组及阴性对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05),提示存在G2/M期阻滞,S期细胞增殖率下降(P < 0.05),周期相关蛋白D1(Cyclin D1)表达水平下降(P < 0.05),周期相关蛋白B1(Cyclin B1)表达水平明显增加(P < 0.05)?结论:下调AURKA表达可抑制骨肉瘤细胞U2-OS的增殖, 同时导致细胞阻滞于G2/M期?     

稳定转染维生素D受体反义cDNA的人骨肉瘤细胞系的建立

目的：建立稳定转染维生素D受体（VDR）反义cDNA的人骨肉瘤细胞系,方法：构建VDR反义cDNA的真核表达载体,用Lipofectamine法转染人骨肉瘤细胞系HOS－8603,经G418筛选后获得稳定转染细胞株,并用免疫组化技术检测内源性VDR蛋白折表达情况,采用瞬时转染报告基因技术从靶基因水平检测VDRas3细胞内VDR的转录激活功能,结果“筛选出6株抗G418细胞克隆（VDRas1-6),其中VDRas3细胞内源性VDR蛋白的表达量低于对照细胞,激素作用72h后,对照组细胞的报告基因氯霉素乙酰转移酶（CAT）转录活性增加约3．5倍,而VDRas3细胞CAT的转录基本不受激素诱导。结论：获得了稳定转染VDR反义cDNA的细胞系,为今后进一步研究1,25（OH）2D3及其类似物调节细胞增殖分化的分子机制提供了一个良的细胞模型。     

去甲二氢愈创木酸抑制骨肉瘤Mg63细胞生长的研究

【目的】 探讨去甲二氢愈创木酸对骨肉瘤细胞Mg63的生长抑制作用及其机制. 【方法】 应用四甲基偶氮唑蓝(MTT法)和克隆形成法测定去甲二氢愈创木酸对Mg63细胞的生长抑制作用,检测其抑制骨肉瘤细胞生长的时间效应和剂量效应;用流式细胞技术进行细胞周期分析;用Western blot法检测药物对Mg63细胞mTORC1信号通路活性的影响.【结果】 去甲二氢愈创木酸对Mg63细胞具有明显的生长抑制作用,且呈时间依赖和剂量依赖关系,72 h IC50值为(48 ± 2)μmol/L?10?20?50 μmol/L可显著抑制Mg63克隆形成数量,且随剂量增加抑制作用明显增强?细胞周期阻滞于G0/ G1 期,mTORC1信号通路蛋白p-S6和p-4E-BP1与对照组相比明显下调. 【结论】 去甲二氢愈创木酸明显抑制骨肉瘤细胞mg63增殖,诱导细胞周期阻滞于G0/ G1 期,这一作用可能是通过对mTORC1信号通路的抑制完成.     

反义细胞周期D1蛋白抑制肾小球系膜细胞增殖研究

目的探讨细胞周期蛋白（Ｃｙｃｌｉｎ）Ｄ１在肾小球系膜细胞增殖机制中的作用。方法应用免疫组织化学方法检测ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白在系膜细胞内表达;建立了表达ＣｙｃｌｉｎＤ１反义ＲＮＡ的逆转录病毒载体基因转移系统;利用ＭＴＴ法、流式细胞术对基因转录的系膜细胞的增殖状况进行观察。结果（１）体外培养的系膜细胞核内存在ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白;（２）外源基因经逆转录病毒载体高效转导系膜细胞,并高效表达反义ＲＮＡ;（３）反义ＣｙｃｌｉｎＤ１转导后的系膜细胞对内皮素１刺激的增殖反应不明显,而正常细胞（１８小时０２５９±００８０,６小时０１００±０００７）和空载体转导细胞（１８小时０２７８±００２０,６小时００９７±０００８）有显著效应（Ｐ＜００１）;（４）反义ＣｙｃｌｉｎＤ１抑制细胞从Ｇ１期进入Ｓ期。结论ＣｙｃｌｉｎＤ１是肾小球系膜细胞周期Ｇ１期进展的关键调控蛋白,反义ＣｙｃｌｉｎＤ１基因转导系膜细胞能明显抑制内皮素１的促增殖作用。     

丙型肝炎病毒核心蛋白对胆管癌细胞NFAT1基因表达的影响

目的探讨丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV C)是否通过调控转录因子NFAT1的表达参与肝内胆管癌的发展及恶性生物学行为。方法构建表达HCV C核心蛋白的真核表达质粒pEGFP-N3-HCV C,通过瞬时转染pEGFP-N3-HCV C质粒,RT-PCR检测肝内胆管癌RBE细胞中NFAT1 mRNA的表达情况,Western blot检测NFAT1蛋白的表达情况,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期变化情况。结果转染HCV C后胆管癌细胞NFAT1基因的mRNA及蛋白表达明显上升,差异具有显著性(P<0.05);HCV C能够促进细胞向G2/M期进展及使细胞增殖能力增加。结论 HCV C可上调胆管癌细胞中NFAT1基因的表达,促进细胞周期进展及胆管癌细胞增殖,可能与肝内胆管癌的发展有关。     

骨髓间充质干细胞对HepG2肝癌细胞增殖的影响

目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞对HepG2肝癌细胞增殖的影响,并初步探讨其机制?方法:全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞术鉴定其分子表面标志,体外扩增培养并收集培养上清?MTT法?平板克隆实验及软琼脂克隆实验检测大鼠间充质干细胞对人肝癌细胞株HepG2增殖的影响,流式细胞术检测肝癌细胞周期的改变,Western blot法检测细胞周期相关蛋白Cyclin D1表达情况?结果:骨髓间充质干细胞CD105和CD90表达阳性,CD34和CD45表达阴性?在骨髓间充质干细胞培养上清作用下,MTT法显示实验组肝癌细胞光密度值增加(P < 0.05),平板克隆法显示实验组肝癌细胞克隆形成率比对照组明显升高(P < 0.05),软琼脂克隆法显示实验组肝癌细胞空间克隆形成率比对照组明显升高(P < 0.05),流式细胞术显示实验组细胞周期G1期比例降低,S期?G2期比例增加?Western blot显示实验组细胞Cyclin D1表达量增加(P < 0.05)?结论:骨髓间充质干细胞可促进HepG2肝癌细胞的增殖及空间克隆形成能力,其促进肝癌细胞体外增殖可能与Cyclin D1表达上调有关?     

表没食子儿茶素没食子酸酯诱导人肝癌细胞HCCLM6凋亡的研究

目的 观察表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)对人高转移肝癌细胞HCCLM6凋亡的作用及探讨其作用机制。方法 甲基噻唑基四唑染色法检测EGCG对人肝癌细胞HCCLM6细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡率和EGCG对HCCLM6细胞周期的影响,免疫荧光技术检测EGCG处理的HCCLM6细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和骨桥蛋白(osteopontin, OPN)表达的变化。结果 EGCG可显著抑制肝癌细胞HCCLM6的增殖,且呈浓度依赖性;EGCG使细胞周期明显阻滞于G0/G1期;EGCG可明显导致HCCLM6细胞凋亡,使VEGF、OPN表达水平显著下降。结论 EGCG可以诱导肝癌HCCLM6细胞凋亡,其作用机制可能与阻滞细胞周期和调控VEGF、OPN表达有关。     

三羟异黄酮对人乳腺癌细胞株MCF-7细胞增殖和细胞周期的影响

目的:研究三羟异黄酮(genistein,Gen)对乳腺癌细胞株MCF鄄7细胞增殖和细胞周期的影响。方法:采用MTT比色法观察Gen对MCF鄄7细胞增殖的影响,流式细胞仪分析细胞周期分布,Westernblot分别检测周期素B(cyclinB)、周期素E(cyclinE)蛋白表达情况。结果:Gen(≥10μmol/L)对MCF鄄7细胞生长有显著抑制作用,细胞生长阻滞于G2/M期,cyclinB蛋白表达增加,且呈剂量-效应关系;但对cyclinE蛋白表达无影响。结论:Gen抑制MCF鄄7细胞增殖、诱导G2/M期阻滞与其导致cyclinB蛋白积累有关,与cyclinE蛋白表达无明显关系。     

在大鼠胶质瘤C6细胞中过表达Pygo2促进其细胞增殖

 目的 通过构建过表达Pygo2的重组体上调Pygo2表达,探讨其在大鼠胶质瘤C6细胞增殖中的作用及机制。方法 重组体经EcoR I和Hind Ⅲ双酶切鉴定和DNA测序后,用脂质体2000将其转染大鼠胶质瘤C6细胞,采用Western blot检测外源Pygo2蛋白表达,应用克隆形成实验和MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期,采用Western blot检测过表达Pygo2对C6细胞中cyclinD1、β-catenin水平的影响,并采用细胞免疫荧光法检测其对C6细胞中cyclinD1、β-catenin亚细胞定位的影响。结果 双酶切和测序鉴定结果证实插入序列正确,重组体能有效上调Pygo2表达。将重组体转染C6细胞上调Pygo2表达后,细胞的生长增殖被显著促进,克隆形成显著增多,细胞周期进程从G1期至S期转变显著增强;且cyclinD1水平随之增高,亚定位无改变,β-catenin水平和亚细胞定位无明显改变。结论 成功构建了过表达Pygo2的重组体,过表达Pygo2通过增高cyclinD1水平,促进细胞从G1期进入S期,从而促进大鼠胶质瘤C6细胞增殖。     

山萘黄素对人白血病细胞系HL-60体外增殖的抑制作用

目的 观察山萘黄素对HL-60细胞体外增殖的抑制作用及其对细胞周期的影响.方法 分别采用台盘蓝拒染法及流式细胞术,在不同条件下测定细胞增殖的抑制率及细胞周期的分布.结果 应用台盘蓝拒染法,山萘黄素能够显著地抑制HL-60细胞的体外增殖并且呈现时效及量效关系.流式细胞术的结果表明:山萘黄素作用2h可使HL-60细胞的细胞周期分别阻滞于G2/M期和G0/G1期.结论 山萘黄素能够明显抑制HL-60细胞体外增殖,影响其细胞周期分布.