17β-雌二醇下调人成骨样MG63细胞结缔组织生长因子表达机制的研究

10-8mol/L雌二醇可明显下调人成骨样MG63细胞结缔组织生长因子(CTGF)mRNA及蛋白的表达;蛋白激酶A(PKA)阻断剂H-89可完全阻断雌二醇对CTGF的降调节作用。PKA活化剂forskolin可模拟雌二醇作用,明显下调人成骨样MG63细胞CTGF mRNA、蛋白的表达。17β-雌二醇下调人成骨样MG63细胞CTGF表达由PKA介导。     

MT01对人成骨样细胞系MG63内Toll样受体7,9表达的影响

目的探讨人成骨样细胞系MG63(简称MG63)内Toll样受体(TLRs)的表达情况及MT01与细胞内TLRs的关联。方法应用RTPCR法检测MG63内TLR1~10 mRNA的表达情况;MT01与MG63作用12、24、48 h后,Real time PCR法检测MG63细胞内TLR7,9 mRNA表达的变化;Western印迹法检测MG63细胞内TLR7,9蛋白表达的变化。结果 MG63细胞表达TLR1~10 mRNA;一定浓度的MT01作用于细胞后,对TLR7,9 mRNA及蛋白表达有显著的抑制作用,这种抑制作用无时间依赖性。结论 MG63细胞表达TLR1-10 mRNA,一定浓度的MT01可影响MG63细胞内TLR7,9 mRNA及蛋白的表达。     

机械应力对MG63成骨样细胞结缔组织生长因子表达的影响

目的 观察力学刺激对MG63成骨样细胞的结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径在这一过程中的作用.方法 应用Western印迹法检测MG63细胞CTGF蛋白表达及细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38磷酸化水平,应用RT-PCR检测CTGF mRNA表达.结果 环状应力刺激可显著上调CFGF蛋白及mRNA表达,3～6 h达高峰,升高2～3倍;并且激活ERK及JNK信号途径,刺激10 min开始活化,ERK在60 min达高峰,而JNK在15～30min达高峰,对p38信号途径没有明显活化作用.JNK信号通路阻断剂SP600125能够阻断应力刺激对CTGF的上调作用,而ERK信号阻断剂PD98059及p38信号阻断剂SB203580却无此作用.结论 环状机械应力通过JNK依赖的途径上调了MG63细胞的CTGF表达.     

尼尔雌醇对人成骨样MG63细胞护骨素和骨钙素基因表达的影响

目的　研究尼尔雌醇对人成骨样MG63细胞护骨素 (OPG)、骨钙素 (BGP)基因表达的影响。方法　MG63细胞以不同浓度的尼尔雌醇及雌激素受体纯拮抗剂ICI 182 780分别干预 2 4h、48h及 72h ,用半定量RT PCR法检测OPG、BGPmRNA的表达量。结果　尼尔雌醇可上调MG63细胞OPGmRNA的表达 ,并存在剂量依赖和饱和效应 ,其中以 10 -8mol/L的作用最强。而且OPGmRNA表达有时间依赖性 ,以 48h表达量为最高。尼尔雌醇未显示对MG63细胞BGPmRNA表达的影响。结论　尼尔雌醇上调MG63细胞OPGmRNA表达是其作为抗骨质疏松药物的重要机制。     

雌二醇与液流外力对MG63细胞内钙离子浓度的影响

外在应力是骨重建的最重要刺激因素之一 ,缺乏应力(或重力 )刺激可导致骨质疏松症 ,而雌激素缺乏可导致快速的骨丢失 ,两者之间是否相互作用尚不清楚。本研究以人成骨肉瘤细胞株ＭＧ63细胞为模型 ,同时加上外力及加入 17β 雌二醇 ,观察细胞内钙离子浓度的变化。一、材料和方法人类成骨细胞株ＭＧ63是从日本引进 ,ＡＴＣＣ号ＣＲＬ 142 7,95 10 1代。细胞在ＭＥＭ培养基 (含 10 %胎牛血清、青霉素 10 0Ｕ/ｍｌ、链霉素 10 0 μｇ/ｍｌ)中 ,在 5 %的ＣＯ2 、95 %空气、饱和湿度的 3 7℃细胞培养箱中培养。 3天换液 ,5天传代、接种。细胞接种…     

RNA干扰抑制雌激素受体α亚基对雌激素诱导人成骨样细胞护骨素表达的影响

目的 探讨RNA干扰抑制人成骨样细胞株MG63中雌激素受体α亚基(estrogen receptor α subunit ERα)后，对17β-雌二醇(E2)诱导护骨素(OPG)表达的影响。方法 利用计算机辅助设计ERα特异性siRNA，体外合成siRNA基因，并将其定向克隆入真核表达载体pSilencer4．1-CMV。以脂质体法转染ERα siRNA载体至人的成骨样细胞株MG63中，鉴定后分别用不同浓度的雌激素或G蛋白抑制剂苏拉明干预经ERα siRNA转染的MG63细胞或未经ERα siRNA转染的MG63细胞，RT-PCR法检测OPG mRNA的表达水平。结果 双酶切法鉴定重组质粒后，RT-PCR法鉴定ERα siRNA载体可特异地抑制MG63细胞中ERα的表达。不同浓度的17β-E2上调MG63细胞OPG mRNA的表达，其中以10^-7mol／L的作用最强。但经ERα siRNA载体抑制MG63细胞ERα亚基后，17β-E2上调MG63细胞OPG mRNA表达的作用消失。结论 17β-E2主要经ERα亚基上调MG63细胞OPG的表达。     

甲状腺激素对成骨样MG-63细胞甲状腺激素受体不同亚型表达的影响

目的 检测人类成骨样细胞MG-63中甲状腺激素受体(TR)的表达情况以及甲状腺激素(T3或T4)对其的影响.方法 用实时荧光定量PCR法对MG-63细胞中TR的主要4个亚型,α1、α1、β1、β2的mRNA表达进行了测定.结果 TRα1 mRNA的表达水平最高,为10.70±0.45;TRβ1仅及其半,为5.75±0.10;TRβ2不低,相当于TRβ1的60%,为3.34±0.08;TRα2的表达极低,仅为(3.66±0.59)×10-2.分别加入不同浓度的T3或T4,仅TRα1和TRα2对T3表现明显的降调节,且TRα1和TRα2的表达与相应T3浓度之间负相关,其他亚型无显著性变化,也无相关关系;同样浓度范围的T4作用各亚型,表达均无显著性变化.结论 在骨细胞发育分化中TRα1起关键作用.

Abstract：

Objective To examine the expression of thyroid hormone receptor isoforms (TR α1, α2, β1, and β2) in human osteoblast-like cell line MG-63 at the mRNA level and the effect of thyroid hormone (T3 or T4 ) on the expression. Methods Realtime quantitative PCR was performed. Results The expression of TRα1 mRNA was the highest, that was 10. 70± 0.45, TRβ1 was 5.75 ± 0. 10, TRβ2 was 3.34 ± 0. 08, and TRα2 was very low, only (3.66 ±0. 59) × 10-2. Only the expression of TRαl and TRα2 mRNA was down regulated significantly by the treatment of 10-10 ～ 10-6 mol/L T3, and there was a negative correlation between the expression of TRα1 or TRα2 mRNA and the concentration of T3. Conclusion TRα1 plays a primary role in mediating the effects of thyroid hormones in skeletal development.     

雌激素膜快速效应对人成骨样细胞MG63 OPG mRNA快速表达水平的影响

目的 探讨17β-雌二醇(E2)膜快速效应对人成骨样细胞MG63的OPG mRNA快速表达水平影响.方法 采用RT-PCR法分析经E2快速作用后的MG63细胞中OPG mRNA的表达水平.结果 E2膜快速效应能诱导人成骨细胞MG63 OPG mRNA表达水平出现一个快速增高现象,其表达高峰时间为E2作用后的10 min左右,而且这一现象能被G蛋白藕联抑制苏拉明所抑制.结论 而E2诱导的人成骨样细胞MG63中OPG mRNA表达水平的快速增高,可能与雌激素启动了雌激素膜受体介导的G蛋白藕联受体调节的磷脂酶C/腺苷酸环化酶通路有关.     

雌二醇对人成骨肉瘤MG63细胞株护骨素、护骨素配体及其相关因子的调节

目的观察17β-雌二醇(17β-E2)和ICI 182780对人成骨肉瘤MG63细胞株表达护骨素(OPG)、OPG配体(OPGL)及其相关因子[TRAIL、巨噬细胞集落刺激因子(M—CSF)、转化生长因子β(TGFβ)]的影响。方法用逆转录PCR(RT—PCR)法检测基因表达情况,用Western blot分析法检测蛋白表达情况。结果(1)17β—E2能上调MG63细胞中OPG及TGFβ的表达,下调OPGL、M—CSF及TRAIL的表达。(2)ICI 182780对被检测基因有不同的调节活性。结论雌激素缺乏可能导致成骨细胞中OPG、TGFβ的表达减少,而解除了对OPGL、M—CSF和TRAIL等细胞因子的抑制作用,使破骨细胞的数量和活性增加,骨吸收增强和骨量丢失,这可能是绝经后骨质疏松症的一个重要的发病机制;ICI 182780并非纯雌激素受体拮抗剂,而属于选择性雌激素受体调节剂。     

肿瘤坏死因子α对人成骨样细胞NF-κB和护骨素表达的调节

用肿瘤坏死因子α(TNF -α)干预培养的MG 63细胞(人成骨肉瘤来源)。结果显示:TNF -α上调MG 63细胞核蛋白p65表达,下调护骨素(OPG)mRNA和蛋白质表达。吡咯二硫氨基甲酸酯不能阻止TNF -α下调MG 63细胞OPG的作用。     

成骨样细胞MG-63中的甲状腺激素受体Ⅰ——细胞核可溶性甲状腺激素受体与激素(T3)结合的动力学

建立人类成骨样细胞系MG-63中甲状腺激素受体的结合实验的方法,测定受体动力学参数.体外培养MG-63细胞,制备细胞核提取液,对其细胞核提取物中的甲状腺激素受体与激素(主要是T3)结合的动力学进行了Scatchard分析.MG-63细胞核内存在高亲和力(Ka为7.68×109L/mol)和有限结合容量的甲状腺激素受体,最大结合容量为(111.25+10.73)fmol/mg蛋白.建立了一个简易的自培养细胞制备纯净细胞核的方法,为进一步研究成骨样细胞及骨组织中的甲状腺激素受体奠定基础.

Abstract：

To establish a method for radioligand binding assay of thyroid hormone receptors(TR)in human osteoblast-like osteosarcoma cell line MG-63 and to estimate the kinetic parameters of putative receptors. The MG-63cell was cultured in Ham's F12, the soluble TR was prepared from the intact nuclear extracts. The binding properties between TR and T3 were performed by using the traditional Scatchard analysis. The apparent Ka of TR in MG-63 is 7.68× 109 L/mol, and MBC(111. 25+ 10.77)fmol/mg protein. The study indicated that MG-63 cells possessed high affinity and limited-capacity of TR in its nuclear extracts. This may serve as the starting and basic work about TR in bone cell.     

RNA干扰基因敲低雌激素受体β对雌激素诱导人成骨样细胞护骨素表达的影响

RNA干扰敲低人成骨样细胞株MG63中雌激素受体β后，RT-PCR法发现不同浓度的17β-雌二醇均能上调MG63细胞中的护骨素mRNA表达水平，其中以10^-7mol／L的作用最强。而这种作用不能被G蛋白抑制剂suramin所抑制。提示雌激素受体β可能不涉及雌激素上调MG63细胞护骨素表达的调控作用。     

雌二醇对人成骨细胞和人成骨样细胞核转录因子-κB的影响

目的观察雌二醇(E2)对人成骨细胞和人成骨样细胞MG-63细胞株核转录因子-κB(NF-κB)的作用。方法培养的人成骨细胞、MG-63细胞接种于24孔板,随机分为阴性对照组、E2作用组,做免疫荧光染色,显微镜下观察。结果对照组NF-κB在两种细胞的胞浆中都有表达,E2作用后,MG-63细胞核及细胞浆内NF-κB的表达减弱,但人成骨细胞NF-κB的表达在E2作用后却没有改变。结论雌二醇对MG-63细胞的NF-κB表达有抑制作用,但对人成骨细胞的NF-κB表达则无影响。     

瘦素通过中枢机制影响骨代谢的研究进展

实验研究显示瘦索可通过中枢机制影响小鼠和人的骨代谢。瘦索主要通过改变下丘脑神经肽Y和α-MSH的释放量这一中枢途径而抑制骨形成；NPY和α-MSH在调节骨代谢方面具有相反作用；瘦索是介导体重和骨重的中问介质，也是能量缺乏信号和神经内分泌功能的调节剂，可通过中枢环路调节体重和骨重。     

橘红素对大鼠成骨细胞增殖、分化和成骨功能的影响

目的 研究橘红素(TG)对体外培养大鼠成骨细胞增殖、分化、矿化和成骨功能指标基因蛋白表达的影响。方法 选取出生24 h内的SD大鼠乳鼠颅骨,通过酶消化法培养原代成骨细胞,倒置显微镜下观察细胞形态和状态,并以碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红(ARS)染色法进行细胞鉴定;分别采用噻唑蓝(MTT)法、ALP染色法、ARS染色法检测TG对原代成骨细胞的存活率、评价成骨细胞分化能力和矿化能力的影响;采用Western印迹检测TG对原代成骨细胞成骨相关转录因子(OSX)、ALP、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)和骨桥蛋白(OPN)等成骨功能指标基因的蛋白表达。结果 与Control组相比,TG作用浓度为5、10、15、20μmol/L时可明显促进成骨细胞的增殖(P<0.01);TG共培养7 d后,与Control组比较,TG作用浓度为5、10、15、20μmol/L时ALP染色明显增加,说明TG能明显促进成骨细胞分化(P<0.05);TG共培养21 d后,与Control组比较,TG浓度为5、10、15、20μmol/L时ARS染色明显增加,说明TG能明显促进成骨细胞的矿化功能(P&...     

瘦素对大鼠主动脉平滑肌细胞迁移和增殖的影响

目的探讨瘦素对大鼠主动脉平滑肌细胞迁移和增殖的影响,以阐明瘦素在动脉粥样硬化发生发展机制中的作用。方法体外培养大鼠主动脉平滑肌细胞至第4~6代,分别用不同浓度的瘦素(0、20、40、80、100、200μg/L)孵育24 h后:模拟Boyden实验,检测瘦素对平滑肌细胞趋化迁移的影响;MTT法检测瘦素对平滑肌细胞生长的影响;流式细胞仪检测瘦素对平滑肌细胞增殖指数的影响。结果瘦素对平滑肌细胞的生长有促进作用,这种促增殖效应呈剂量依赖性,在瘦素浓度为100μg/L时达最大效应(OD值为0.193±0.010)。瘦素对平滑肌细胞增殖指数的影响与此相同。瘦素有明显的促进平滑肌细胞趋化迁移作用,而且随着瘦素浓度的增加,迁移的细胞数目明显增多。结论瘦素可以促进平滑肌细胞的迁移和增殖,提示瘦素可能有促进动脉粥样硬化的作用。     

雌二醇诱导人成骨样细胞差异表达基因筛查

目的 快速筛查17β雌二醇(E2)诱导人成骨肉瘤MG—63细胞株差异表达cDNA片段,寻找雌激素相关基因。方法 改良cDNA代表性差异分析法(cDNA RDA)分离E2干预MG—63细胞株表达上调cDNA片段,Southern杂交证实后,制备阵列膜行点杂交,然后挑取阳性差异克隆测序,经同源比较分析,最后选取部分克隆标记探针行Northern印迹杂交。结果经过4轮消减和动力性富集后得到5个E2诱导人成骨肉瘤MG—63细胞表达上调的差异cDNA条带,Southern杂交证明这些表达上调的cDNA片段来自E2干预的MG—63细胞;共得到600余个含有阳性插入片段的cDNA克隆,点杂交筛查得到120个差异表达克隆。选20个克隆测序得到15个序列,其中1个经Northern杂交证实E2干预后表达上调。结论 cDNA RDA能有效筛查差异表达cDNA片段,联合cDNA阵列点杂交可快速筛查差异表达基因,E2诱导人成骨肉瘤MG—63细胞某些基因表达上调。     

miR-181a-5p对人主动脉平滑肌细胞成骨样分化的影响

目的 观察miR-181a-5p对动脉钙化细胞模型的影响,探讨其可能的作用机制.方法 培养人主动脉平滑肌细胞(HASMC),经成骨样分化诱导后使用茜红素染色检测细胞成骨样分化的程度,采用real-time PCR检测成骨样分化标志基因骨钙素(OCN)、Runt相关转录因子2(RUNX2)和碱性磷酸酶(ALP)的mRNA...     

雌二醇对人成骨样细胞基质金属蛋白酶及其抑制因子的作用

目的 探讨雌二醇（Ｅ２对人成骨样ＭＧ－６３细胞基质金属蛋白酶（ＭＭＰ）及基质金属蛋白酶抑制因子（ＴＩＭＰ）的作用和雌激素缺乏致骨质疏松（ＯＰ）的发病机制。方法 ＭＭＰ和ＴＩＭＰ用酶联免疫吸了会法和免疫印迹法检测,ｍＲＮＡ用逆转录聚合酶链反应检测。ＭＭＰ活性用明胶酶谱法检测。结果 人成骨样ＭＧ－６３细胞在２４ｄ的培养中表达ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＴＩＭＰ－１和ＴＩＭＰ－２,但不表达ＭＭＰ－３、ＭＭＰ     

破骨样细胞中骨保护素和NF-κB配体受体的表达及其意义

目的探讨破骨样细胞中骨保护素(OPG)和NF-κB配体受体(RANKL)表达情况。方法单独培养骨髓单核细胞前体,用巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和维生素D诱导其转化为破骨样细胞,在0、5、10、15 d用光镜观察和TRAP染色(抗酒石酸染色)评估破骨样细胞的转化程度,用RT-PCR检测OPG和RANKL的表达情况;然后构建主动脉中膜平滑肌细胞(SMC)与骨髓单核细胞前体共培养的模型,用维生素C和β-磷酸甘油诱导SMC转化为成骨样细胞,并在0、5、10、15 d用同样方法再次检测共培养中破骨样细胞转化的情况,以及两种细胞中OPG和RANKL的表达情况。结果不管是单独培养、还是共培养,破骨样细胞中始终没有OPG和RANKL的表达。结论破骨样细胞的转化可能主要受成骨样细胞分泌的OPG和RANKL调控,本身并没有分泌OPG和RANKL进行自身调节的机制存在。