hi FGF2真核表达载体的构建及其高表达对细胞凋亡的影响

目的构建hi FGF2(high molecular weight isoform fibroblast growth factor-2,hi FGF2)真核表达载体,并观察其过表达后对细胞凋亡的影响。方法设计合成hi FGF2 cDNA模板引物,Nhel和Hind III双酶切pDsRed1-N1质粒,T4DNA连接酶重组hi FGF2质粒,PCR扩增目的基因,琼脂糖凝胶电泳检测及测序鉴定。将重组hi FGF2质粒瞬时转染HEK293细胞,荧光倒置显微镜检测转染效率。AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 hi FGF2真核表达载体符合设计要求,瞬时转染HEK293细胞的转染率达70%以上。过表达hi FGF2,HEK293细胞FITC/PI双染阳性率达(29.12±2.81)%,与正常组、转染空载体组差别有显著性(P<0.01或P<0.05)。结论成功构建hi FGF2真核表达载体,过表达hi FGF2导致细胞凋亡。     

肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体表达载体的制备

目的构建一种携带肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体（TRAIL）基因的重组腺相关病毒（rAAV）载体。方法首先构建携带可溶性肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体（sTRAIL）基因的穿梭质粒腺相关病毒穿梭质粒-可溶性肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体（pAAV-sTRAIL），将穿梭质粒转染入HEK293细胞（人胚肾细胞系）中，采用细胞内质粒DNA同源重组法构建重组腺相关病毒载体rAAV-sTRAIL。以噬斑分析法筛选单克隆rAAV-sTRAIL；PCR法鉴定阳性rAAV-sTRAIL；氯化铯密度梯度离心法纯化rAAV-sTRAIL；紫外分光光度仪测定rAAV-sTRAIL颗粒数及纯度，噬斑分析法测定rAAV-sTRAIL感染滴度；Western免疫印迹检测rAAV-sTRAIL在HEK293细胞中的表达情况。结果成功构建了rAAV-sTRAIL，制备的病毒纯度好、滴度高，且在HEK293转导细胞中能有效表达目的基因sTRAIL。结论构建的重组腺相关病毒载体rAAV-sTRAIL，为研究TRAIL抗肿瘤细胞效应及临床应用提供先进的载体系统。     

MK801对结肠癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响

摘要： 目的 探究 N-甲基-D-天冬氨酸受体亚型 1（NMDAR1）在结肠癌细胞 HT29 和 SW116 中的表达, 以及 NMDAR1 拮抗剂 MK801 对 HT-29 和 SW116 细胞生长抑制、 凋亡和迁移的影响。方法 采用免疫组织化学法检测 结肠癌细胞 HT-29 和 SW116 细胞表面 NMDAR1 的表达; 应用噻唑蓝（MTT）比色法测定 62.5、 125.0、 250.0、 500.0、 1 000.0、 2 000.0 μmol/L 的 MK801 对于 HT-29 和 SW116 细胞增殖作用的影响; 应用流式细胞术检测 2 000 μmol/L 的 MK801 对 HT29 和 SW116 细胞凋亡的影响; 应用细胞划痕实验检测 50 μmol/L MK801 对于结肠癌细胞 HT-29 和 SW116 迁移能力的影响。结果 结肠癌细胞 HT-29 和 SW116 均表达 NMDAR1, 且主要表达于细胞质中; 各浓度的 MK801 对 HT-29 细胞, 以及浓度为 500.0、 1 000.0、 2 000.0 μmol/L 的 MK801 对 SW116 细胞的生长抑制作用具有时 间效应关系, 24、 48 及 72 h 各 MK801 浓度组对 HT-29 和 SW116 细胞的抑制率随浓度升高整体呈增强趋势, 但抑制 率不呈明显的剂量效应关系; MK801 具有促进 HT-29 和 SW116 细胞凋亡的作用, 且主要表现诱导细胞早期凋亡; MK801 可抑制 HT-29 和 SW116 细胞迁移。结论 NMDAR1 在结肠癌细胞胞质中表达, 且 NMDAR1 拮抗剂 MK801 具有抑制肿瘤细胞生长、 迁移, 促进其早期凋亡的作用, 有望成为新一代抗肿瘤药物。     

丁酸钠诱导结肠癌HT-29细胞凋亡的信号通路及对AQP3基因表达影响的研究

目的：探讨丁酸钠诱导结肠癌HT-29细胞凋亡过程的分子机理及其对水通道蛋白AQP3基因表达的影响。方法：MTT法检测不同浓度的丁酸钠对结肠癌HT-29细胞生长的影响;RT-PCR检测不同浓度的丁酸钠对细胞周期蛋白Cyclin D1、CDK4、p16和AQP3的基因表达水平,同时使用流式细胞仪检测细胞周期。结果：加入浓度超过2.5mmol/L的丁酸钠后,结肠癌HT-29细胞生长受到抑制,Cyclin D1、CDK4和AQP3的表达水平下降,p16的表达水平上调,细胞阻滞于G1/S期。结论：浓度超过2.5mmol/L的丁酸钠可以诱导结肠癌HT-29细胞凋亡,使其细胞周期阻滞于G1/S期,且这种诱导作用是剂量依赖型的,其分子通路可能是通过p16-Cyclin D1/CDK4这条信号途径,在此过程中,伴随着AQP3的基因表达水平降低。     

沙利度胺调控PD-L1抑制HT-29结肠癌细胞的作用及机制研究

目的：探讨沙利度胺对HT-29结肠癌细胞的抑制作用及其机制。方法：CCK-8检测沙利度胺对HT-29结肠癌细胞增殖的作用;流式细胞术检测沙利度胺对HT-29结肠癌细胞凋亡的作用和对HT-29结肠癌细胞PD-L1表达的作用;Western Blot检测沙利度胺对HT-29结肠癌细胞c-Myc、STAT3、HIF-1蛋白表达的影响。结果：沙利度胺各浓度（40、80、160、320 μmol·L-1）明显抑制HT-29结肠癌细胞的增殖;沙利度胺各浓度（20、40、80 μmol·L-1）明显促进HT-29结肠癌细胞的凋亡,明显减少HT-29结肠癌细胞表面PD-L1的表达,明显减少HT-29结肠癌细胞c-Myc、STAT3、HIF-1蛋白的表达。结论：沙利度胺对HT-29结肠癌细胞具有抑制作用,其机制可能与减少PD-L1表达及抑制癌细胞上游c-Myc、STAT3、HIF-1信号分子表达有关。     

沙利度胺调控PD-L1抑制HT-29结肠癌细胞的作用及机制研究

目的：探讨沙利度胺对HT-29结肠癌细胞的抑制作用及其机制。方法：CCK-8检测沙利度胺对HT-29结肠癌细胞增殖的作用;流式细胞术检测沙利度胺对HT-29结肠癌细胞凋亡的作用和对HT-29结肠癌细胞PD-L1表达的作用;Western Blot检测沙利度胺对HT-29结肠癌细胞c-Myc、STAT3、HIF-1蛋白表达的影响。结果：沙利度胺各浓度（40、80、160、320 μmol·L-1）明显抑制HT-29结肠癌细胞的增殖;沙利度胺各浓度（20、40、80 μmol·L-1）明显促进HT-29结肠癌细胞的凋亡,明显减少HT-29结肠癌细胞表面PD-L1的表达,明显减少HT-29结肠癌细胞c-Myc、STAT3、HIF-1蛋白的表达。结论：沙利度胺对HT-29结肠癌细胞具有抑制作用,其机制可能与减少PD-L1表达及抑制癌细胞上游c-Myc、STAT3、HIF-1信号分子表达有关。     

槲寄生凝集素对人结肠癌HT-29细胞增殖及凋亡的影响

目的：研究槲寄生凝集素对人结肠癌HT-29细胞增殖和凋亡的影响。方法：采用MTT法观察槲寄生凝集素对体外培养的人结肠癌HT-29细胞增殖的影响,运用基因组DNA电泳观察凋亡特征性“梯状”条带及原位末端标记法检测槲寄生凝集素诱导HT-29细胞凋亡。结果：槲寄生凝集素对体外培养的人结肠癌HT-29细胞抑制作用表现出时间和剂量依赖性。基因组DNA琼脂糖凝胶电泳显示槲寄生凝集素作用于HT-29细胞后出现凋亡细胞特有的DNA阶梯状条带。原位末端标记法检测显示槲寄生凝集素可明显诱导HT-29细胞的凋亡。结论：槲寄生凝集素可抑制人结肠癌HT-29细胞生长并诱导其凋亡。     

miR-346靶向调控SFRP4介导5-FU诱导的结肠癌细胞毒性

目的观察miR-346及SFRP4对5-FU诱导的结肠癌细胞毒性的影响,为结肠癌化疗增效提供新的靶基因。方法构建pcDNA3.1-SFRP4上调SFRP4表达,以pcDNA3.1-SFRP4、NC、Con-miR、miR-346、miR-346+Vector、miR-346+SFRP4等转染SW480和HT-29细胞,Western blot法观察miR-346上调或下调后对SFRP4蛋白水平的影响,MTT观察不同转染条件下5-FU细胞存活率变化,流式细胞术观察细胞凋亡变化。结果 SFRP4可增加5-FU诱导的SW480、HT-29细胞毒性及细胞凋亡,miR-346能够降低5-FU诱导的SW480、HT-29细胞毒性及细胞凋亡。miR-346对SFRP4表达具有负向调控作用。结论 miR-346通过负向调控SFRP4表达降低5-FU诱导的结肠癌细胞毒性。     

青蒿琥酯联合苯达莫司汀对弥漫大B细胞淋巴瘤增殖和凋亡的影响

目的 研究青蒿琥酯(ART)与苯达莫司汀(BEN)联合用药对弥漫大B细胞淋巴瘤SUDHL-4和SUDHL-6细胞增殖和凋亡的影响。方法 将SUDHL-4细胞分组为4组：S4-对照组(不加药物)、S4-ART组(0.5μmol·L^-1 ART)、S4-BEN组(100μmol·L^-1 BEN)和S4-ART+BNE组(0.5μmol·L^-1 ART+100μmol·L^-1 BEN)组,SUDHL-6细胞分组同SUDHL-4细胞。各组均培养48 h。用噻唑蓝法检测细胞的存活率;用膜联蛋白V-FITC (Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)双染法检测细胞凋亡情况;用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测凋亡相关基因的表达;用蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白的表达水平。结果 S4-对照组、S4-ART组、S4-BEN组、S4-ART+BNE组细胞存活率分别为(100.00±5.19)%、(65.64±1.29)%、(78.52±2.58)%和(42.85±0.61)%;细胞凋亡率分别...     

5’-氮杂-2’-脱氧胞苷对结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中MGMT基因甲基化状态、mRNA表达及蛋白表达的影响

目的探讨甲基化酶抑制剂5’-氮杂-2’-脱氧胞苷（5’-Aza-CdR）对结直肠癌（colorectal cancer,CRC）细胞株HT-29和LoVo中MGMT基因甲基化水平、mRNA及蛋白表达的影响。方法用0.5、1.0、1.5μmol/L浓度的5’-Aza-CdR处理CRC细胞株HT-29和LoVo。应用MethyLight方法、实时荧光定量PCR方法及蛋白印迹试验（Westernblot）检测药物处理前后HT-29和LoVo细胞中MGMT基因的甲基化状态、mRNA和蛋白表达情况。结果 MethyLight检测HT-29和LoVo细胞中MGMT蛋白在药物作用后异常甲基化得到逆转。实时荧光定量PCR检测5’-Aza-CdR浓度为0.5、1.0、1.5μmol/L组HT-29细胞株和LoVo细胞株MGMT基因mRNA表达水平均较对照组上调,Western blot检测5’-Aza-CdR浓度为0.5、1.0、1.5μmol/L组MGMT蛋白表达水平均较对照组上调,且均具有药物剂量依赖性（P〈0.05,P〈0.01）。结论 CRC细胞株HT-29和LoVo中MGMT基因启动子甲基化可能是导致该基因表达下调甚至失活的主要原因。5’-Aza-CdR能够逆转CRC细胞株HT-29和LoVo中MGMT基因的甲基化状态,并能恢复mRNA及蛋白重新表达。     

Cell proliferation and Ca(2+)-calmodulin dependent protein kinase activation mediated by alpha 1A- and alpha 1B-adrenergic receptor in HEK293 cells

AIM: To examine the ability of alpha 1-AR subtypes on proliferation and Ca(2+)-calmodulin dependent protein kinase (CCDPK, formerly called MAPK) activation in transfected human embryo kidney 293 (HEK293) cells. METHODS: pREP8/alpha 1A-AR, pREP4/alpha 1B-AR, and pREP9/alpha 1D-AR were transfected, respectively, into HEK293 cells by calcium phosphate precipitation. The expression of alpha 1-AR was detected by radioligand binding assays. DNA synthesis was measured by [3H]thymidine incorporation. CCDPK activity was determined by immunoprecipitation method and myelin basic protein was used as substrate. RESULTS: Three clonal HEK293 cell lines stably expressing alpha 1A- or alpha 1B- or alpha 1D-AR were chosen and characterized by radioligand binding assay with receptor densities of about 0.6 nmol.g-1. Treatment with norepinephrine (NE) in the presence of propranolol for 24 h increased DNA synthesis in HEK293/alpha 1A- or HEK293/alpha 1B-AR cells concentration-dependently, with EC50 values of 48.8 nmol.L-1 (95% confidence limits 9.7-246 nmol.L-1) and 8.4 nmol.L-1 (95% confidence limits 2.1-32.9 nmol.L-1), respectively. The increase of DNA synthesis induced by NE 10 mumol.L-1 was 201% +/- 28% and 269% +/- 44% of basal, and the activation of CCDPK was 171% +/- 84% and 292% +/- 92% of basal in HEK293/alpha 1A-AR and HEK293/alpha 1B-AR cells, respectively. Preincubation with prazosin completely abolished NE-induced CCDPK activation in HEK293/alpha 1A- and alpha 1B-AR cells. Those changes were not found in HEK293/alpha 1D-AR cells. CONCLUSION: The activation of alpha 1A- or alpha 1B-AR but not alpha 1D-AR induces cell proliferation.     

神经酰胺诱导人结肠癌细胞凋亡作用

目的探讨外源性神经酰胺诱导人结肠癌HT-29细胞的凋亡作用。方法采用光镜、电镜、荧光显微镜和琼脂糖凝胶电泳方法检测C2-神经酰胺诱导HT-29细胞凋亡。MTT法检测C2-神经酰胺对HT-29细胞线粒体功能的影响。结果C2-神经酰胺使HT-29细胞发生核染色质断裂、DNA Ladder、凋亡小体等典型凋亡表现,12和24 h凋亡细胞率分别为64.1%和81.3%,呈现时间-剂量依赖关系。同时C2-神经酰胺处理细胞6 h后,细胞线粒体功能即出现损伤。结论外源性神经酰胺能诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡,参与其凋亡调控。     

慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞中FasL表达

目的：检测慢性乙型病毒性肝炎患者外周血单核细胞中的FasL的表达,探讨HBV诱导外周血单核细胞凋亡的可能作用机制。方法：PCR检测外周血单核细胞中HBV—DNA,流式细胞术检测凋亡,蛋白印迹检测FasL表达。结果：30例慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞中共检出HBV—DNA阳性24例,阴性6例。阳性组凋亡率为（38．14±5．23）％,阴性组凋亡率为（22．37±6．47）％,两者比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。阳性组FasL表达明显高于阴性组。结论：慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞中FasL高表达可能参与HBV诱导外周血单核细胞凋亡。     

SC58125抑制IκBα降解调节TNF-α诱导的HT29细胞凋亡

目的观察非甾体类抗炎药SC58125与TNFα是否具有协同诱导HT29细胞的凋亡作用,同时探讨其可能的分子机制。方法用MTT、琼脂糖凝胶电泳及流式细胞术,观察SC58125/TNFα对HT29细胞增殖与凋亡的影响;用EMSA及Westernblot检测转录因子NFκB的结合活性及IκBα的表达。结果SC58125与TNFα在抑制HT29细胞增殖及诱导其凋亡方面具有明显的协同作用,TNFα使HT29细胞生长受到明显抑制,DNA发生典型的“梯型”变化;SC58125可明显增强TNFα抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡作用,使HT29细胞凋亡率从11.2%±1.1%增加到53.9%±2.1%。凋亡过程中伴随Caspase3活性的激活;经TNFα刺激后的HT29细胞,IκBα迅速降解,NFκB的结合活性大大提高;而加入SC58125后,IκBα降解及NFκB的结合活性均明显受到抑制。结论SC58125与TNFα在诱导HT29细胞的凋亡方面具有明显的协同作用,这可能与SC58125抑制IκBα降解和激活Caspase有关。     

多巴酚丁胺对常见上皮源性肿瘤细胞增殖的影响

目的观察多巴酚丁胺对多种常见上皮源性肿瘤细胞株的增殖抑制作用。方法收集不同浓度多巴酚丁胺处理的胃癌SGC-7901细胞、结肠癌HT-29细胞、卵巢癌HO-8910细胞、宫颈癌SiHa细胞和肺癌A549细胞,于24 h、48 h和72 h采用噻唑蓝(MTT)法检测抑制率,流式细胞仪检测凋亡率。结果不同浓度的药物处理24 h、48 h和72 h后对以上5种上皮源性肿瘤细胞均有一定的抑制作用,随着药物浓度的增加和时间的延长,抑制率有不同程度的增加。30μmol/L药物处理72 h之后对各组细胞的抑制作用最强,由强到弱依次为SGC-7901(41.57±1.10)%、A549(24.32±2.22)%、SiHa(20.66±2.60)%、HT-29(20.38±1.60)%和HO-8910(15.25±0.73)%,对SGC-7901的抑制作用较强,与其他几种细胞差异有统计学意义(P<0.05)。该浓度在72 h对各肿瘤细胞的凋亡率以胃癌SGC-7901和肺癌A549细胞较明显,与对照组细胞差异有统计学意义(P<0.05)。结论多巴酚丁胺对上皮源性肿瘤细胞有一定的增殖抑制作用,并且呈浓度和时间依赖性,该药可明显抑制胃癌细胞增殖,并诱导其凋亡,具有潜在应用价值。