丹皮酚逆转内质网应激诱导的HepG2细胞凋亡抵抗

目的 探讨丹皮酚逆转内质网应激诱导的HepG2肝癌细胞凋亡抵抗的作用机制.方法 采用MTT及末端双脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记技术(TUNEL)观察内质网应激诱导剂衣霉素对正常人肝细胞株HL-7702及人肝癌细胞株HepG2细胞的增殖抑制及凋亡作用;Western blot法测定内质网应激诱导剂衣霉素对正常肝细胞HL-7702及肝癌细胞HepG2的环氧合酶-2(COX-2)表达的影响;采用Western blot法及TUNEL法观察COX-2的选择性抑制剂塞来昔布对内质网应激下的肝癌细胞HepG2 COX-2的表达及凋亡的影响;采用MTT及TUNEL法观察丹皮酚对内质网应激下的HepG2肝癌细胞的增殖抑制及凋亡作用;Western blot法观察丹皮酚对内质网应激诱导的HepG2肝癌细胞 COX-2表达的影响:结果与正常肝细胞HL-7702相比,在 TM诱导的内质网应激作用下肝癌细胞HepG2的增殖抑制率及凋亡率减少(P＜0. 05),并且内质网应激可诱导肝癌细胞HepG2产生COX-2蛋白.而丹皮酚可下调内质网应激诱导的HepG2肝癌细胞中COX-2的表达,并使内质网应激诱导的肝癌细胞的凋亡增加.结论 丹皮酚可通过下调COX-2的表达从而逆转内质网应激诱导的HepG2肝癌细胞凋亡抵抗.     

p53基因在内质网应激诱导的晶状体上皮细胞凋亡中的作用

目的探讨在内质网应激诱导的晶状体上皮细胞凋亡中,p53基因的作用.方法衣霉素用于诱导晶状体上皮细胞株LEC内质网应激.细胞凋亡用Hoechst染色法.基因表达测定采用RT-PCR.结果衣霉素处理导致CHOP基因表达升高,LEC细胞凋亡率和caspase-3活性增加.同时,衣霉素诱导细胞p53表达升高.通过转染的方式过表达CHOP基因可加强衣霉素诱导的LEC细胞凋亡以及p53表达升高.但是仅仅过表达CHOP基因并不能诱导LEC细胞凋亡以及p53表达升高.结论p53基因很可能在内质网应激所介导的细胞凋亡起重要作用,但p53基因不是CHOP的直接靶基因.     

α-鹅膏毒肽对2.2.15细胞乙肝病毒HBsAg和HBeAg分泌的影响

目的 观察α-鹕膏毒肽(α-Amallitin)对HepG2 2.2.15细胞(2.2.15细胞)乙肝病毒(HBV)HBsAg和HBeAg分泌的影响.方法 用不同浓度的α-鹅膏毒肽作用2.2.15细胞,用MTT法检测细胞毒性,时间分辨免疫荧光法(TRFIA)测定上清HBsAg和HBeAg浓度.结果 α-鹅膏毒肽在0.006～0.800μg/mL时,对HepG2 2.2.15细胞无明显毒性作用.当浓度达到4.000～20.000μg/mL时毒性较明显,TC50为10.190μg/mL;其对上清液HBsAg和HBeAg的抑制随浓度的增加而加强,其半数抑制浓度分别为0.495μg/mL和0.346μg/mL.结论 在无毒或低毒浓度下α-Amanitin能抑制2.2.15细胞株HBsAg和HBeAg的分泌,可能与α-Amanitin抑制HBV DNA的复制有关.     

黄芪抗乙型肝炎病毒的体外实验研究

目的 探讨黄芪对乙型肝炎病毒抗原表达的抑制作用.方法 黄芪作用于体外培养的HepG 2.2.15细胞,观察黄芪对HepG 2.2.15细胞分泌HBsAg,HBeAg的影响及药物的细胞毒性.结果 黄芪作用于HepG 2.2.15细胞12 d后,对细胞的半数毒性浓度(CD50)1 500 ng/ml,对HBsAg和HBeAg抑制的半数有效浓度(ID50)分别为115.4 μg/ml和317.2 μg/ml,黄芪对HBsAg和HBeAg的治疗指数(TI)分别13.00,4.73.结论黄芪在体外细胞培养中对HBsAg及HBeAg的分泌有较好的抑制作用.     

针对HBVS区的siRNA的抗病毒活性

目的: 体外观察siRNA对HepG2 2.2.15细胞中乙型肝炎病毒(HBV)S-mRNA及HBsAg,HBeAg产生的影响. 方法: 设计并合成针对HBV S区的三条siRNA,构建含上述siRNA的表达载体pSilencer ZY1,pSilencer ZY2和pSilencer ZY3,pSilencer HK2测序及酶切鉴定后用脂质体介导重组质粒转染HepG2 2.2.15细胞,用酶免分析法对HepG2 2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg进行检测,用逆转录聚合酶链反应检测HBV S-mRNA.结果: 成功构建了针对HBV S区的siRNA的表达载体,三条siRNA均可程度不同地抑制HepG2 2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg的分泌,72 h抑制率达高峰,对HBsAg的抑制率分别为81%,29%及78%,对HBeAg的抑制率分别为35%,3%及49%,并有抑制HBV S-mRNA的作用.结论: 针对HBV S区的siRNA能明显抑制HBV的复制.     

天花粉提取物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响

目的:探讨天花粉水提取物、醇提取物对HepG2.2.15细胞的增殖及培养细胞上清中HBsAg与HBeAg表达的影响。方法:用MTT方法检测HepG2.2.15细胞的存活率,以酶联免疫法(ELISA)检测HepG2.2.15细胞上清液HBsAg和HBeAg的表达量。结果:天花粉水提取物和醇提取物处理HepG2.2.15细胞后HBsAg和HBeAg的表达均呈时间依赖性和浓度依赖性抑制,但天花粉水提物的治疗指数明显优于醇提物。结论:天花粉水提物较醇提物有更好的抗HBV活性。     

TLR7配体Loxoribine抗乙型肝炎病毒的体外实验研究

目的 探讨TLR7配体Loxoribine对乙型肝炎病毒的抑制作用。方法 采用MTT法观察Loxoribine药物对体外培养HepG2.2.15细胞的毒性作用,ELISA及荧光定量PCR法分析药物对细胞培养上清液中HBsAg、HBeAg及HBV DNA含量的影响。结果 低浓度Loxoribine对体外培养的HepG2.2.15细胞生长有一定抑制作用,但随着药物浓度增高,对细胞生长并无明显毒性作用。Loxoribine可有效地抑制HepG2.2.15细胞HBV DNA的复制及HBsAg的分泌,并随着药物浓度的增加和作用时间的延长,对HBsAg抑制率增大,而对HBeAg的分泌无抑制作用。结论 Loxoribine在体外具有抗乙型肝炎病毒的作用。     

过表达肌浆网钙ATP酶对心肌细胞内质网应激的影响

目的 研究过表达肌浆网钙ATP酶2a(SERCA2a)对心肌细胞内质网应激的影响.方法 构建含SERCA2a cDNA的重组腺病毒载体(Adv-SERCA2a),以缺氧和衣霉素诱导内质网应激,随机将体外培养的心肌细胞分为以下6组:正常对照组、缺氧组、衣霉素组、过表达SERCA2a组、SERCA2a+缺氧组和SERCA2a+衣霉素组.采用Western印迹法检测内质网应激蛋白GRP78及C/EBP同源蛋白(CHOP)表达水平,流式细胞术检测心肌细胞凋亡率,台盼蓝染色检测心肌细胞存活率.结果 过表达SERCA2a+缺氧组GRP78及CHOP蛋白表达较缺氧组分别低49.1%和52.7%,细胞凋亡率较缺氧组低66.0%,细胞存活率较缺氧组高13.4%,差异有统计学意义(均P<0.05);过表达SERCA2a+衣霉素组GRP78及CHOP蛋白表达较衣霉素组分别低50.4%和66.1%,细胞凋亡率较衣霉素组低54.0%,细胞存活率较衣霉素组高6.7%,差异有统计学意义(均P<0.05).结论 过表达SERCA2a通过下调内质网应激蛋白表达,降低心肌细胞内质网应激水平,缓解过度内质网应激介导的细胞损伤.     

甘草甜素对HepG2.2.15细胞株HBeAg水平及TLR4表达的影响

目的 探讨甘草甜素(GL)时HepG2.2.15细胞上清HBeAg分泌,Toll样受体4(TLR 4)信号分子的表达及对细胞增殖的影响.方法 实时荧光定量PCR检测TLR4表达;直接免疫荧光流式细胞术(FCM)检测表达TLR4的阳性细胞率;ELASA检测HBV所分泌抗原;MTT检测细胞增殖活性,并与空白对照组比较.结果 给药后HBV e抗原(HBeAg)的分泌结果显示,总体均数间差异显著(P<0.05),但甘草甜素各组与对照组比较差异无统计学意义;GL各组TLR4 mRNA及流式细胞TLR4的表达总体均数间均有显著差异(P<0.01),分别与对照组相比差异有显著性(P<0.01),100μg/mL组尤其明显;MTT实验显示,200μg/mL缸以下三个剂量组均可促进细胞增殖,50μg/mL组与对照组间差异显著(P<0.05);400μg/mL、800μg/mL两组均显著抑制细胞增殖(P<0.01);而MTT结果与HBeAg水平呈显著负相关(P<0.01),与TLR4表达无相关关系(P>0.05.结论 研究表明,甘草甜素对HepG2.2.15的e抗原分泌可能具有双向作用;细胞的存活率与e抗原呈负相关;TLR4在HepG2.2.15细胞株低表达,GL可上调TLR 4表达,甘草甜素可影响先天免疫中的TLR4信号分子,有可能在体内通过免疫途径影响HBV复制和抗原分泌.     

ZD6474对肝癌细胞和乙肝相关肝癌细胞增殖的影响

目的:探讨ZD6474对肝癌细胞株HepG2和乙肝相关肝癌细胞株HepG2.2.15细胞增殖的影响.方法:用WST方法检测ZD6474对细胞增殖的抑制作用;采用流式细胞仪检测ZD6474对细胞周期及凋亡的影响.结果:ZD6474可以显著抑制HepG2和HepG2.2.15细胞增殖,6.4 μmol/L的ZD6474可以抑制(46.86±10.32)％的HepG2和(41.24±7.35)％的HepG2.2.15细胞增殖,其抑制增殖作用随剂量增加而增强(P＜0.05).ZD6474诱导细胞产生G0/G1期阻滞,6μmol/L的ZD6474可诱导71.90％的HepG2和69.90％的HepG2.2.15细胞阻滞于G0/G1期.结论:ZD6474可以抑制HepG2和HepG2.2.15细胞增殖,其机制可能与诱导细胞周期阻滞有关.     

APOBEC3G真核表达载体构建及抗HBV复制的初步研究

目的构建人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G（APOBEC3G）真核表达载体,并探讨其抗乙型肝炎病毒（HBV）复制的作用。方法采用RT-PCR法从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因编码区片段,构建pcDNA3.1-A3G真核表达载体,利用脂质体转染法将pcDNA3.1-A3G转染HepG2.2.15细胞,分别于转染后第24、48、72 h收集细胞培养上清液和细胞总蛋白,Western blot检测HBx蛋白表达情况,ELISA法检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg表达情况。结果测序结果显示pcDNA3.1-A3G真核表达载体中APOBEC3G编码区序列存在1处碱基同义突变;HepG2.2.15细胞经APOBEC3G蛋白干扰后,HBx、HBsAg和HBeAg表达量逐渐降低,于72h表达量显著降低。结论成功构建了APOBEC3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G;APOBEC3G在体外可以抑制HBV复制,为深入研究APOBEC3G作为抗HBV药物提供了实验基础。     

筛选调节HBV增殖和HBsAg产生的宿主细胞的miRNA

目的筛选调节乙型肝炎病毒(HBV)增殖和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)产生的宿主细胞的miRNA。方法用328种miRNA的反义链转染HepG2 2.2.15细胞,72 h收获上清,MTS检测细胞的增殖活性,ELISA检测表面抗原和e抗原的表达水平,实时定量PCR检测其中HBV DNA的拷贝数。构建筛选到的miRNA的过表达载体,转染HepG22.2.15细胞,也分别用MTS、ELISA和实时定量PCR进行检测。结果 miR-199a-3pASO、miR-210ASO和miR-185ASO促进了HBsAg产生和HBV增殖(P<0.05);miR-199a-3p、miR-210、miR-185的过表达,分别抑制了HBsAg的产生和HBV的增殖(P<0.05);miR-199a-3p、miR-210和miR-185的ASO转染组与对照组相比,分别降低了细胞内miR-199a-3p、miR-210和miR-185的表达水平(P<0.05);miR-199a-3p、miR-210和miR-185的过表达载体转染组与对照组相比,分别增加了细胞内miR-199a-3p、miR-210和miR-185的表达水平(P<0.05)。结论在没有对细胞的增殖活性产生影响的情况下,miR-199a-3p、miR-210和miR-185抑制了HBV表面抗原的产生和HBV的增殖,miRNA作为病毒与宿主细胞相互作用中的调节因子,在HBV的生命活动周期中具有重要作用。     

茵兰益肝颗粒剂体外抑制乙型肝炎病毒复制的实验研究

[目的]验证含有茵兰益肝颗粒剂药效成分的药物血清对转染乙型肝炎病毒基因的人肝癌细胞系2.2.15(HepG2.2.15)细胞分泌乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和e抗原的(HBeAg)抑制作用。[方法]组织培养及酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。[结果]药物血清第8天对HepG2.2.15细胞半数毒性浓度(TC₅₀)为11.48%,最大药物血清无毒浓度(TC₀)为6.0%。6.0%~3.0%、1.50%、0.75%4种药物血清浓度在HepG2.2.15细胞中第8天对HBsAg的抑制率分别为7.89%~5.8%、1.6%、1.6%,对HBeAg抑制率均为负值。[结论]茵兰益肝颗粒剂对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg有较低的抑制率,对HBeAg无抑制作用。     

HBVPreS2反义寡核苷酸对HepG 2.2.15细胞系HLA-I类抗原表达及生物活性的影响

目的 :观察针对乙型肝炎病毒 (HBV)PreS2 基因特异性反义寡核苷酸 (asON)对转基因细胞HepG2 .2 .15表面的人类白细胞I类抗原 (HLA I)基因表达的影响。方法 :设计合成互补于HBVPreS2 翻译起始区的反义寡核苷酸即序列I ,并设非互补序列作对照即序列II ,免疫细胞化学染色观察asON对HepG2 .2 .15表面表达的HLA I类抗原的影响 ,用ELISA法动态检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg的变化 ,放射免疫测定法检测asON对宿主细胞自身分泌蛋白 血清铁蛋白的影响。结果 :HepG2 .2 .15细胞表面HLA I类抗原表达降低 ,用药组和对照组相比有统计学意义 (P <0 .0 5 )。asON能够抑制HBV表达HBsAg和HBeAg ,对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为 6 6 %和 91% ,而序列II对HBsAg和HBeAg的抑制率均为 11%。asON对宿主细胞自身分泌蛋白无影响 ,即对宿主细胞无毒性作用。结论 :asON以序列特异性方式抑制HBV基因表达而对宿主细胞无毒性作用 ,HLA I类抗原表达降低 ,这对减轻过度炎症反应 ,阻止慢性肝炎至重症肝炎的发生具有重要意义     

Bay41-4109抗乙型肝炎病毒的体外实验研究

目的 观察Bay41-4109对2.2.15细胞分泌乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)DNA的影响,探讨Bay41-4109的体外抗HBV作用.方法 将一定浓度的Bay41-4109加入培养的2.2.15细胞,通过四甲基偶氮唑...     

硫代反义寡聚脱氧核苷酸体外对乙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

目的 探讨乙型肝炎病毒（HBV）C基因翻译起始区和C基因区硫代反义寡聚脱氧核苷酸（ASON）对HBV表达的序列性抑制作用。方法 以2．2．15细胞系作为实验对象,设计了一系列互补于HBV mRNA编码核心蛋白基因区（C区）15聚硫代ASON,通过脂质体介导将这些合成的外源基因导入2．2．15细胞中,用酶联免疫吸附法（ELISA）检测作用细胞培养上清液中乙型肝炎病毒E抗原（HBeAg)和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg)含量。结果 与HBV mRNA C基因起始区互补的硫代ASON序列特异性地抑制乙型肝炎病毒基因表达,而正义硫代寡聚脱氧核苷酸未见有抑制效应,与HBV mRNA C基因内部互补的序列很少或无抗病毒活性。另外,硫代ASON对细胞生长无毒性作用。结论 硫代ASON能够在细胞水平有效地抑制乙型肝炎病毒基因的表达。     

抗HBV反义寡核苷酸的筛选

目的 筛选出对HBV有抑制作用的反义寡核苷酸(AS-ONs),为HBV的预防和治疗提供基础.方法 合成5条与HBV互补的反义寡核苷酸,转染HepG2.2.15细胞,运用荧光定量PCR和酶联免疫法测定反义寡核昔酸对细胞培养液中HBVDNA和HBsAg、HBeAg的抑制作用.结果 寡核苷酸序列Ⅰ(TAC CTC TYG T...