皮肤组织工程相关问题的研究

皮肤组织工程的核心是建立皮肤细胞和生物材料的三维空间复合体,形成具有生命力的皮肤活体组织,对病损组织进行形态、结构和功能的重建修复并达到永久替代。本文就皮肤组织工程中的体外培养皮肤细胞的来源、分离和体外培养的方法进行了综合阐述,对皮肤组织工程中的支架生物材料的研究进行了介绍。     

表皮细胞、成纤维细胞复合脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤

目的；观察体外培养的人皮肤角朊细胞和成纤维细胞的生物学特性，复合脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤，为进一步临床应用奠定基础。方法：分别取人皮肤角朊细胞和成纤维细胞体外培养、扩增，测定细胞生长曲线、克隆形成率和染色体倍性；将培养的角朊细胞、成纤维细胞分别接种于脱细胞真皮基质表面，体外构建组织工程皮肤，观察细胞生长增殖情况。结果：在本培养体系下人皮肤角朊细胞和成纤维细胞增殖良好，细胞染色体倍性检测结果均为二倍体细胞。脱细胞真皮基质对角朊细胞、成纤维细胞无明显毒性作用，体外复合培养细胞可生长增殖。结论：此实验方法可以获得生长状态良好的组织工程皮肤种子细胞，复合脱细胞真皮基质可成功构建组织工程皮肤     

组织工程皮肤的构建及组织形态学观察

背景：应用于临床的组织工程皮肤具有血管化速度慢、力学强度差以及无法永久性保留等局限,因此,需要对相关技术环节进行改进以制备一种合适的永久性皮肤替代物。目的：建立一种构建有活性的双层组织工程皮肤的方法,并对其组织形态学进行观察。方法：以Ⅳ型胶原和成纤维细胞联合修饰的同种脱细胞真皮基质为支架,与表皮干细胞复合后依次经浸没式培养和气液分离界面培养构建组织工程皮肤,利用光镜和扫描电镜对其组织学特点进行观察和分析。结果与结论：以表皮干细胞和同种脱细胞真皮基质制备的组织工程皮肤具有表、真皮双层结构,其中表皮由多层不同分化程度的表皮细胞组成,真皮为天然三维孔隙结构,胶原纤维完整,且表皮层与真皮层紧密连接,形成整体结构,可满足全层皮肤替代物的基本组织学要求。     

组织工程皮肤的构建及组织形态学观察

背景:应用于临床的组织工程皮肤具有血管化速度慢、力学强度差以及无法永久性保留等局限,因此,需要对相关技术环节进行改进以制备一种合适的永久性皮肤替代物。目的:建立一种构建有活性的双层组织工程皮肤的方法,并对其组织形态学进行观察。方法:以Ⅳ型胶原和成纤维细胞联合修饰的同种脱细胞真皮基质为支架,与表皮干细胞复合后依次经浸没式培养和气液分离界面培养构建组织工程皮肤,利用光镜和扫描电镜对其组织学特点进行观察和分析。结果与结论:以表皮干细胞和同种脱细胞真皮基质制备的组织工程皮肤具有表、真皮双层结构,其中表皮由多层不同分化程度的表皮细胞组成,真皮为天然三维孔隙结构,胶原纤维完整,且表皮层与真皮层紧密连接,形成整体结构,可满足全层皮肤替代物的基本组织学要求。     

含有生肌液的组织工程皮肤修复免皮肤缺损

背景:在皮肤开放创面上进行缺损修复与重建是组织修复领域的研究焦点.构建含有中药的组织工程皮肤修复刨面缺损的研究并不多见.目的:将含有生肌液的皮肤支架与自体皮肤细胞复合,构建含药组织工程皮肤,修复兔皮肤缺损.设计:自体对照动物实验.单位:实验于2005-02/08在天津市天律医院骨科研究所细胞工程室完成.材料:同窝大耳白兔8只,体质量1.6-1.8kg.自行提取生肌液(1 500g/L),成分为当归、生地、龟板、象皮、血余、生石膏、炉甘石;明胶-壳聚糖支架材为料天津大学提供,分别修剪成1.3cm直径的圆片,60Co照射火菌;DR无细胞真皮基质由江苏省启动市医疗用品研究所提供.方法:分离培养兔皮肤细胞,获取第3代角质形成细胞与成纤维细胞.延兔脊柱两侧制作直径1.5 cm的圆形伞层皮肤缺损创面4个.分为4组,阴性对照组(明胶-壳聚糖支架贴附于创面后滴加生理盐水),人工真皮组(DR无细胞真皮基质贴附于创面后接种细胞悬液),非含药组织工程皮肤组(明胶-壳聚糖支架贴附于创面后接种细胞悬液),含药组织工程皮肤组(生肌液-明胶-壳聚糖支架贴附于创面后接种细胞悬液).主要观察指标:①术后13 d测量剩余创面面积.②术后7 d、10d取材行组织学与免疫组织化学染色检测.结果:①术后13 d各组创面面积均有不同程度的缩小,剩余面积阴性对照组＞人工真皮组＞非含药组织工程皮肤组＞含药组织工程皮肤组,非含药组织工程皮肤组、含药组织工程皮肤组与阴性对照组比较差异有显著性意义(P＜0.05).②术后10 d,阴性对照组、人工真皮组、非含药组织工程皮肤组均有炎性肉芽组织增生,无表皮组织形成;含药组织工程皮肤组形成接近正常的上皮组织及幼稚的真皮组织.非含药组织工程皮肤组与人工真皮组BrdU标记弱阳性,含药组织工程皮肤组BrdU标记强阳性.结论:实验采用的方法使种子细胞在含有生肌液的明胶-壳聚糖支架上增殖,在体修复皮肤损伤,能够有效扩展皮肤缺损处的覆盖面积,缩短皮肤缺损的愈合时间.     

含有生肌液的组织工程皮肤修复兔皮肤缺损

背景：在皮肤开放创面上进行缺损修复与重建是组织修复领域的研究焦点。构建含有中药的组织工程皮肤修复创面缺损的研究并不多见。目的：将含有生肌液的皮肤支架与自体皮肤细胞复合，构建含药组织工程皮肤，修复兔皮肤缺损。设计：自体对照动物实验。单位：实验于2005—02／08在天津市天津医院骨科研究所细胞工程室完成。材料：同窝大耳白兔8只，体质量1．6～1．8kg。自行提取生肌液（1500g／L），成分为当归、生地、龟板、象皮、血余、生石膏、炉甘在；明胶-壳聚糖支架材为料天津大学提供，分别修剪成1-3cm直径的圆片，60Co照射灭菌；DR无细胞真皮基质由江苏省启动市医疗用品研究所提供。方法：分离培养兔皮肤细胞，获取第3代角质形成细胞与成纤维细胞。延兔脊柱两侧制作直径1．5cm的圆形全层皮肤缺损创面4个。分为4组，阴性对照组（明胶-壳聚糖支架贴附于创面后滴加生理盐水），人工真皮组（DR无细胞真皮基质贴附于创面后接种细胞悬液），非含药组织工程皮肤组（明胶壳聚糖支架贴附于创面后接种细胞悬液），含药组织工程皮肤组（生肌液明胶-壳聚糖支架贴附于创面后接种细胞悬液）。主要观察指标：①术后13d测量剩余创面面积。②术后7d、10d取材行组织学与免疫组织化学染色检测。结果：①术后13d各组创面面积均有不同程度的缩小，剩余面积阴性对照组〉人工真皮组〉非含药组织工程皮肤组〉含药组织工程皮肤组，非含药组织工程皮肤组、含药组织工程皮肤组与阴性对照组比较差异有显著性意义（P〈0.05）。②术后10d，阴性对照组、人工真皮组、非含药组织工程皮肤组均有炎性肉芽组织增生，无表皮组织形成；含药组织工程皮肤组形成接近正常的上皮组织及幼稚的真皮组织。非含药组织工程皮肤组与人工真皮组BrdU标记弱阳性，含药组织工程皮肤组BrdU标记强阳性。结论：实验采用的方法使种子细胞在含有生肌液的明胶壳聚糖支架上增殖，在体修复皮肤损伤，能够有效扩展皮肤缺损处的覆盖面积，缩短皮肤缺损的愈合时间。     

组织工程皮肤的最新研究

构建一种理想的组织工程皮肤，无论是对急性烧(创)伤患者，还是伤后要求皮肤修复重建的患者都有重大作用。但是，迄今为止，尚无一种持久、合适耐用的皮肤代用品。目前从组织工程学的观点来看，人工皮肤主要有3类：①培养的表皮膜。②真皮替代物。③具有表皮、真皮双层结构的复合皮肤替代物。前两类都有一定的局限性。理想的皮肤替代物应同时修复表皮和真皮组织，因为这两种成分不仅影响皮肤的功能和外形，而且具有相互影响的机制，促进彼此的分化。文章就临床上使用的各种组织工程皮肤的特性、使用情况、作用机制和目前存在的问题及其未来的发展方向进行展望。     

组织工程细胞支架及其相关技术研究

细胞、生物材料制备的细胞支架,以及组织和器官的构建是组织工程的三大要素.理想的细胞支架应具有一定的生物降解速度、良好的细胞亲和性、呈特定的三维多孔结构,且含有可控制释放的生长因子.本文介绍了在组织工程细胞支架用生物材料合成和改性、细胞支架构建、细胞支架表面改性、生长因子控制释放以及所研制的细胞支架在皮肤、骨、软骨、神经修复等组织工程研究方面的最新进展和相关技术.     

皮肤组织工程中人表皮干细胞的体外培养及分化特性研究

目的：探索人表皮干细胞(keratinocyte stem cell，KSC)的筛选方法、体外培养条件及生长分化特性。方法：由包皮消化获得表皮细胞，以低密度单克隆筛选法挑取KSC克隆，并以挑取克隆传代及子代细胞混合传代两种不同的方法持续传代培养，采用3种不同的滋养细胞。计算每代KSC子代细胞的克隆形成率(colony forming efficiency，CFE)以及整合素β1及外皮蛋白的表达情况。结果：将KSC克隆的子代细胞混合消化传代培养，CFE会逐渐下降，从最初的95％以上降至第6代时的25％左右。每代均可见3种处于不同分化状态的克隆混合生长，即干细胞克隆(绝大部分细胞未分化，整合素β1阳性、外皮蛋白阴性)、短暂增殖克隆(部分细胞进入终末分化)、终末分化克隆(所有细胞均发生终末分化，外皮蛋白阳性、整合素β1阴性)。以挑取克隆传代法传代培养，其CFE仍能保持在95％以上并能持续传代。结论：以低密度单克隆筛选法可成功地筛选出KSC克隆并能持续传代培养，多种成纤维细胞可作为培养KSC的滋养细胞。KSC在体外会分裂增殖并逐渐分化，但干细胞的数量比例可以保持在较高水平。     

皮肤组织工程

这篇综述主要介绍了皮肤及组织工程既往研究的工作进程，如培养自体上皮细胞，培养异体表皮细胞、真皮替代物，含活性细胞的组织工程皮肤等，并初步探讨了组织工程皮肤促进慢性溃疡愈合的机制。     

三维培养的人成纤维细胞增殖特性在皮肤组织工程研究中的意义

目的：探讨三维培养对人皮肤成纤维细胞增殖的影响。方法：培养人皮肤成纤维细胞，制备鼠尾胶原。对人皮肤成纤维细胞进行三维培养，检测细胞的增殖特性。结果：三维培养的人皮肤成纤维细胞生长曲线显示细胞增殖缓慢，流式细胞仪检测7，14d G0／G1期细胞分别为(79&;#177;3)％，(87&;#177;2)％。未见明显细胞凋亡峰。结论：三维培养对人皮肤成纤维细胞增殖有抑制作用。     

组织工程皮肤的研究与进展

背景:在因烧伤或外伤造成的大面积皮肤缺损的病例中,组织工程化皮肤为其提供了新的治疗方向,因此,研究皮肤组织工程的相关种子细胞及支架具有重要意义,已成为当今的研究热点。资料来源:应用计算机检索Pubmed数据库1990-01/2007-01有关皮肤组织工程的文章,检索词“tissue engineered skin,stem cell”,限定文章语言种类为English。同时应用计算机检索中国期刊全文数据库、万方数据1994-01/2007-01期间的相关文章,检索词“皮肤组织工程,皮肤干细胞”,限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,选取符合研究要求的相关文章全文。纳入标准:①有关皮肤组织工程种子细胞的研究。②有关皮肤组织工程支架的研究。排除标准:重复或类似的同一研究、Meta分析、或个案报道等。资料提炼:共收集到97篇有关皮肤组织工程的文章,排除重复或类似的同一研究,69篇符合研究要求。资料综合:组织工程学的发展为皮肤移植治疗大面积皮肤缺损提供了新的发展方向,使其克服了原有的皮肤供区不足、免疫排斥、传播疾病等各种问题。①皮肤种子细胞:胚胎干细胞及多种成体干细胞均可作为组织工程化皮肤的种子细胞,其中皮肤干细胞成为首选,将其种于生物支架上,可以获得临床所需的表皮、真皮及复合皮肤。②表皮替代物的研究现状。③目前各种真皮替代物的制作方法。④复合人工皮肤的研究方向。⑤现在各种技术仍不够成熟,大范围临床应用始终面临许多问题,但组织工程化皮肤已成为研究者的工作重点。结论:组织工程化皮肤是治疗大面积皮肤缺损的最佳方案,具有广阔的临床应用前景,随着生命科学、手术技术、材料科学以及诸多相关学科的飞速发展,一种功能与外形近乎正常皮肤的组织工程化皮肤既可实现。     

简便快捷获取角朊细胞和真皮成纤维细胞：组织工程皮肤种子细胞培养的3种方法比较

目的：探讨如何以简便快捷的方法获得大量最佳生长状态的角朊细胞和真皮成纤维细胞以作为皮肤组织工程的种子细胞。方法：用2．5g／L胰酶、35g／L热溶素和9．O&;#215;10^3U／L Dispase分别在A，B，C不同条件下处理皮肤标本，观察表皮与真皮的分离情况，并分别培养角朊细胞和真皮成纤维细胞，观察比较细胞的贴壁率和克隆形成率，通过MTT和BrdU检测观察细胞的生长状态，并分别用不同方法获得的细胞构建组织工程皮肤。结果：A，B，C3种方法角朊细胞的贴壁率(％)分别为：8．7&;#177;0．2，12．1&;#177;0．2，15．9&;#177;0．4；成纤维细胞的贴壁率(％)分别为：20．2&;#177;2．4，30．5&;#177;1．8，38．3&;#177;1．9。组间比较差异有统计学意义(t=3．3506，t0.05/2.18=2．101，P&;lt;0．05)。角朊细胞克隆形成率(％)分别为：0．110&;#177;0．025，0．260&;#177;0．026，0．370&;#177;0．021。组间比较差异有统计学意义(t=2．2875，t0.05/2.18=2．101，P&;lt;0．05)。在各种条件下，Dispase处理组获得的细胞数量、细胞贴壁率和克隆形成率均优于其他消化液处理组，细胞纯度高，生长状态良好；用其他方法获得的细胞生长状态相似，都可成功构建组织工程皮肤。结论：使用9．0&;#215;10^3U／L Dispase可以简便快捷的获得大量生长状态良好的角朊细胞和真皮成纤维细胞以作为皮肤组织工程的种子细胞，合适的消化方法、时间和温度可以最大限度保持原代细胞的活力。     

皮肤组织工程种子细胞-表皮干细胞提供来源选择的研究

目的寻找表皮基底层细胞中含有较高干细胞比例的供皮区。方法选择不同供皮部位，利用免疫组织化学的方法，以K19和整合素β1作为表皮干细胞鉴定标记。结果皮肤基底层表皮干细胞以包皮及阴囊最多，其次是臀部，背部多于胸部。四肢近端外侧多于四肢近端内侧，头皮、手掌及足底皮肤基底层干细胞数量较少。结论从组织工程种子细胞的供应来源考虑，以男性包皮最佳，在客观上也容易获得。     

组织工程化人工皮肤的构建与应用

目的 探讨组织工程化人工皮肤的构建与应用。方法 无血清培养人原代表内细胞，接种于经桂枝汤浸泡的异种真皮，进行复合移植。结果 人原代表皮细胞在无血清培养下生长增殖较好；桂枝汤浸泡的异种真皮存时间明显延长；复合移植于烧伤创面上皮片获成活。结论 人表皮细胞和经桂枝汤浸泡的异种真皮复合移植可作为一种新的皮肤代用品。     

组织工程皮肤支架材料的研究与应用

目的：组织工程产品一般由具有活力的细胞和支架材料组成.支架材料包括人工合成的生物降解聚合物和天然生物衍生材料两大类,均具有促进细胞生长和增殖的特性.探索理想的支架材料是当前皮肤组织工程领域的热点,为此本文对组织工程皮肤支架材料的进展情况进行回顾.资料来源：应用计算机检索PubMed和Medscape数据库1990-01/2004-12期间的相关文章,检索词＂skin,artificial＂,并限定文章语言种类为英文.同时计算机检索中国期刊全文数据库2002-01/2004-12期间的相关文章,检索词＂皮肤,人工＂,并限定文章语言种类为中文.资料选择：对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文.纳入标准：文章所述内容应与组织工程皮肤支架材料研究相关.排除标准：重复研究或Meta分析类文章.资料提炼：共收集到61篇相关文献,27篇文献符合纳入标准,排除的34篇文献是由于内容陈旧或重复.资料综合：27篇文献涉及到不同类型的支架材料,包括人工合成的生物降解聚合物和天然生物衍生材料.人工合成的生物降解聚合物由于能在体内降解为小分子物质并通过机体代谢排出,且易于加工、具有良好的组织相容性、机械性能和降解速率的可控性,因此被广泛用作组织工程支架材料,常见的主要有聚乳酸、聚羟基乙酸以及它们的共聚物、聚亚氨酯、聚环氧乙烷等.天然生物衍生材料主要包括胶原、氨基匍聚糖、纤维蛋白凝胶、透明质酸、几丁质及脱细胞处理后的天然细胞外基质等.由于天然材料抗原性较弱,往往存在细胞表面受体的特异识别位点,不易引起免疫排斥反应,并可诱导调节细胞的生长和分化,同时也避免了人工合成材料在孔隙、空间结构等方面的制作难题,因此也被广泛用于组织工程支架材料.结论：支架材料包括人工合成的生物降解聚合物和天然生物衍生材料.天然生物衍生材料避免了人工合成材料在孔隙、空间结构等方面的制作难题,且来源丰富,制作较为简单,造价低廉,在组织相容性、理化性能及生物降解性等方面明显占优,但存在抗原性消除不确定、疾病传播隐患及降解速率不易控制等不足.目前尚未发现完美的支架材料,因此继续开展组织工程皮肤支架材料的研究是必要的.     

人表皮干细胞体外分选和培养对构建组织工程皮肤种子细胞的可能性

目的：探讨人表皮干细胞在体外分选和培养的叮能性，为构建组织工程皮肤寻找理想的种子细胞。方法：实验于2002-01／12在中山大学基础医学院动物中心完成。根据表皮干细胞与Ⅳ型胶原蛋白的高黏附的特性，运用黏附实验将干细胞从培养在鼠Ⅳ型胶原包被的培养瓶的表皮细胞中分选出来，并从形态学、超微结构及免疫组化等方面进行了鉴定。结果：分选出来培养的细胞符合表皮千细胞的特征，说明分选培养的细胞是表皮干细胞。结论：预先在体外对表皮干细胞进行分选和培养是可行的，该细胞群有望成为构建组织工程皮肤的种子细胞，为下一步应用表皮干细胞构建组织工程皮肤奠定了牢固的基础。     

组织工程皮肤构建中的细胞因子

1异种脱细胞真皮基质制备方法的改进,见14卷2010年41期7635-7638页。2皮肤全层缺损真皮修复不同阶段对表皮再生的影响,见14卷2010年41期7631-7634页。     

组织工程皮肤研究的中国之最

组织工程皮肤是最早应用于临床的组织工程产品,先后为自体表皮研究、异体表皮研究、复合皮肤替代物研究等,随着组织工程技术的发展,研制出与正常皮肤结构和功能相近的组织工程皮肤,为烧伤和整形患者提供了理想的皮肤替代物。     

人羊膜与成纤维细胞的共培养在组织工程中的应用

目的：通过人羊膜与成纤维细胞的共培养，来观察成纤维细胞在HA上的生长特性，以及胶原原纤维产生情况，为使人羊膜成为组织工程皮肤的载体打下基础。方法：将不同浓度的成纤维细胞种植于人羊膜上进行共培养。观察细胞在人羊膜细胞外基质（HA-ECM)的生长、排列以及细胞的粘附和胶原原纤维产生情况。结果：梭形的成纤维细胞在HA-ECM上生长良好，放射状或平行排列；组织切片发现HA-ECM上有较多梭形细胞附着，细胞捧列紧密；电镜下见成纤维细胞胞膜基底部向HA-ECM内伸出数个突起，细胞与羊膜基质粘附相当牢固，胞外有较多胶原原纤维堆积。结论：种植于HA-ECM的成纤维细胞有一个最适宜的细胞浓度3．5&;#215;10^9L^-1；HA-ECM具有支架和渗透作用，成纤维细胞在其上生长、粘附良好，胶原合成、分泌旺盛，HA-ECM是一种较理想的成纤维细胞载体。