弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体构建方法探讨

目的 探讨构建弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体的方法，为建立基因敲除弓形虫基因突变株打下基础。方法 用PCR方法扩增弓形虫SAG3基因同源序列，将所获得的1．53kb和2．81kb序列连接克隆插入TUB5／CAT质粒中，构建置换型打靶载体，采用PCR扩增、酶切分析鉴定。结果 将SAG3基因中1．53kb和2．81kb两个同源序列分别插入TUB5／CAT质粒中，构建了弓形虫RH株5’SAG3-TUB5／CAT-3’SAG3置换型载体，经鉴定所获得的打靶载体结构准确。结论 建立了弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体，并获得了弓形虫RH株SAG3基因置换型打靶载体，为分析弓形虫基因功能提供了可行的方法。     

小鼠锌指蛋白基因Znf230条件基因打靶载体的构建

目的 构建用于小鼠锌指蛋白基因Znf230条件基因打靶的载体,为产生Znf230基因敲除的小鼠模型准备条件.方法 设计和合成引物,经PCR从小鼠的基因组中扩增出5'同源臂、3'同源臂及锚定序列,长度分别为4,4,1 kb的片段,反向插入pBS载体的neo基因的两侧,从而构建小鼠Znf230条件基因打靶载体Znf230-pBS(5).结果 经过限制性内切酶及DNA测序鉴定,证实该条件基因打靶载体含有的同源序列与Genebank公布的基因序列一致,表明载体构建成功.结论 PCR技术和定向克隆技术是构建条件基因打靶载体简单而可靠的方法.运用该技术可获得小鼠锌指蛋白基因Znf230的条件基因打靶载体.     

小鼠MPI基因的打靶载体的构建和筛选

目的　构建小鼠MPI基因的基因打靶载体转染ES细胞 ,构建用于同源重组筛选的对照载体。方法根据计算机分析小鼠MPI基因的基因组序列 ,构建用于同源重组载体的长臂和短臂并且转染小鼠ES细胞 ,经抗性筛选后得到阳性克隆 ,抽提基因组DNA后用PCR的方法进行重组子的初步筛选。结果　成功构建了MPI基因的基因打靶载体并且摸索了用PCR的方法进行重组细胞初步筛选的方法。结论　这个载体的构建为MPI基因功能的研究打下了基础 ,同时用PCR方法进行初步筛选大大减少了Southern杂交的工作量 ;利用实验小鼠来研究印迹基因是非常有效的方法 ,它不仅能了解印迹基因在小鼠生长发育过程中的功能 ,而且进而有助于研究人的相应印迹区。     

重组人瑞替普酶基因在山羊胎儿成纤维细胞β-酪蛋白基因座的定点整合

目的:利用体细胞基因打靶技术来获得定点整合有重组人瑞替普酶(rPA)的山羊胎儿成纤维细胞株.方法:构建了针对山羊β-酪蛋白基因座的定点打靶载体,其上游同源臂为β-酪蛋白启动子端同时包含其信号肽编码区长约6.1 kb的基因组片段,下游同源臂为3.3 kb从β-酪蛋白外显子6至外显子9的基因组片段.rPA小基因起始密码子位于β-酪蛋白信号肽编码区下游.将载体瞬时转染C127小鼠乳腺癌细胞,并通过激素进行诱导,酶联免疫吸附分析(ELISA)检测细胞培养上清中的rPA表达量来验证载体表达功能.将载体通过电穿孔的方法转染同基因型的山羊胎儿成纤维细胞.利用G418和GANC进行药物筛选,并通过PCR和southern杂交的方法进行基因组DNA检测.结果:获得了一株定点整合的细胞克隆,绝对基因打靶效率为2×10-7.结论:本实验结果为后续利用核移植技术制备乳腺生物反应器提供了坚实的实验基础.     

小鼠釉基质丝氨酸蛋白酶基因打靶载体的构建及鉴定

目的：对牙釉质丝氨酸蛋白酶（EMSP1）基因 进行体外扩增，构建基因打靶载体，利用基因打靶技术建立转基因动物模型，研究EMSP1生理功能和病理学意义。方法：根据EMSP1的DNA序列，采用Oligo 6.0软件设计两对引物，以129品系小鼠基因组DNA为模板，分别扩增长为5 000 bp和1 700 bp片段作为同源长短臂。将其分插入通用型基因敲除载体pSSC-9的正向筛选基因neo两侧，用PCR方法、限制性酶切DNA 序列分析进行鉴定。结果：采用双酶切鉴定，阳性重组克隆分别切出5000 bp和1700 bp片段，表明长短臂已克隆于载体中。DNA序列分析表明，成功构建 EMSP1基因打靶载体pSSC-9- EMSP1。结论：成功构建小鼠EMSP1基因打靶载体。     

Brevican基因敲除小鼠的制备

目的制备brevican基因敲除小鼠。方法采用ET克隆方法,构建brevican打靶载体。线性化打靶载体,电转化胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES),将正确同源重组的ES细胞注射入囊胚腔,生育嵌合体,再交配繁育杂合子及纯合子。PCR法鉴定小鼠的基因型。结果将PGK启动子指导的NEO表达框敲进Bcan第3外显子,敲除第3～8外显子序列,得到打靶载体,上游臂为2.4 kb,下游臂为4.8 kb。基因打靶后,得到双臂均发生正确同源重组的克隆数14个。利用阳性ES细胞克隆注射入囊胚,得到3只嵌合率大于50%的雄鼠,繁育得到6只Brevican-/-纯合子小鼠。结论利用同源重组方法,成功敲除干细胞靶基因,建立Brevican-/-建系小鼠。     

基于Cre重组酶体系的小鼠HPRT定点整合打靶载体的构建及其应用

目的：构建带有Cre重组酶识别位点变异体lox66的针对小鼠HPRT基因的基因打靶载体,并用于小鼠胚胎干细胞基因打靶研究。方法：利用含HPRT基因组DNA片段的质粒pMP8和人工合成含lox66序列的寡核苷酸,构建含Cre重组酶识别位点变异体lox66的置换型打靶载体,经过限制性内切酶酶切鉴定其结构正确后,用电穿孔法对小鼠胚胎干细胞R1株进行基因转染,经G418／6－TG（6－thioguanine)分组药物筛选,进行pSP-HPRT-lox66-Neo载体的应用研究。结果：得到了与设计一臻的置换型打靶载体pSP-HPRT-lox66-Neo;将线性化的打靶载体导入ES细胞后,能与靶位点有效地发生同源重组,获得了20个靶基因被灭活了的ES细胞克隆。结论：此研究成功构建了含Cre重组酶识别位点变异位lox66针对小鼠HPRT基因位点的置换型打靶载体,在胚胎干细胞基因打勒中得到有效的应用。     

基因打靶置换型载体的构建和应用研究

目的：构建针对小鼠凝血因子Ⅸ基因的基因打靶置换型载体，并用于小鼠胚胎干细胞基因打靶研究。方法：在用噬斑原位杂交法克隆ｍＦⅨ基因组ＤＮＡ并完成结构分析的基础上，利用常规的分子克隆技术，设计并构建置换型载体，经过限制性内切酶酶切鉴定和ＰＣＲ鉴定其正确后，用电穿孔法对体外培养的小鼠胚胎干细胞Ｒ１株进行基因转移，经Ｇ４１８／ＧＡＮＣ分组药物选择，进行ｐＭＦⅨＤＥＬ载体的应用研究。结果：构建获得包括正负双向     

卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体的构建及鉴定

目的 构建卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体.方法 体外培养卡片介苗菌株并提取基因组DNA,扩增Hsp16.3基因两侧序列5′-Hsp16.3和3'-Hsp16.3,分别插入到pKO质粒载体预定位点中构建Hsp16.3基因置换型打靶载体,筛选并进行PCR、双酶切鉴定及测序鉴定.结果 构建的卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体,经PCR、双酶切鉴定及测序证实pKO质粒中的2个插入片段为所需目的基因.结论 成功构建出卡介苗菌株Hsp 16.3基因打靶载体.     

LTC4合酶基因敲除靶向载体的构建

目的:构建鼠LTC4合酶基因靶向敲除载体,用于转染鼠胚胎干细胞,建立LTC4合酶基因敲除鼠。方法:分离、克隆LTC4合酶基因的1.85kb和1.35kb片段,作为靶向载体的5'同源臂和3'同源臂,重组到pJNS2载体中,筛选鉴定阳性重组子。结果:构建的靶向载体由5'同源臂-Neo-3'同源臂-hTk-pJNS2构成。结论:经DNA测序及限制性酶切鉴定分析,该构建载体结构及序列正确,可用于转化鼠胚胎干细胞。     

Rtn4-A/B基因敲除小鼠模型的制备

目的通过制备Rtn4-A/B基因敲除小鼠,探索Rtn4-B基因的生物学功能。方法用细菌人工染色体(BAC)载体构建Rtn4-A/B基因打靶载体并使其线性化,通过电转化法将其转入129SvEv品系雄性小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)。将正确同源重组的ES细胞注射入C57BL/6J小鼠囊胚腔,繁育出嵌合体小鼠后,进一步繁殖以获得杂合子小鼠。抽提小鼠尾尖组织DNA,采用PCR法鉴定小鼠的基因型。结果基因打靶后,得到14个发生双臂正确同源重组ES细胞克隆。利用阳性ES细胞克隆进行囊胚内显微注射,得到5只嵌合率大于50%的雄鼠,最终繁育得到4只Rtn4-A+/-B+/-杂合子小鼠。结论利用ES细胞基因打靶、同源重组等方法,成功获得Rtn4-A/B基因敲除杂合子小鼠。     

小鼠胚胎干细胞凝血因子IX基因的定向敲除

目的:将小鼠胚胎干细胞中凝血因子Ⅸ(mFⅨ)基因定向敲除,为建立血友病B的转基因小鼠模型奠定基础;摸索建立ES细胞基因打靶技术体系.方法:将线性化的针对小鼠mFⅨ基因组的基因打靶置换型载体(pMFⅨDEL)DNA用电穿孔法转入小鼠ES细胞,经过G418和GANC分组药物选择,用PCR和基因组Southern杂交两种方法,鉴定药物抗性细胞中发生同源重组的情况.结果:(1)从药物抗性细胞克隆中鉴定获得了4个发生了按所设计的方式进行了同源重组的ES细胞克隆;(2)观察到在Es细胞中,pMFⅨDEL载体DNA与内源mFⅨ基因发生同源重组的频率平均为1.67×10-6.结论:得到了4个mFⅨ基因已被敲除的ES细胞克隆;建立了ES细胞基因打靶的技术体系.     

利用细菌内同源重组技术构建胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶的基因敲入打靶载体

目的 构建胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶的基因敲入打靶载体,最终获得胰岛β细胞中特异性表达Cre重组酶的基因敲入小鼠,为胰岛β细胞功能研究提供良好的基因敲除动物模型。方法 以低拷贝质粒pBR322-2s为骨架构建取获载体（retrieving vector）,应用λ噬菌体Red重组酶介导的缺口修复（gap-repair）方法,通过细菌内的同源重组克隆长度约为12 kb的小鼠胰岛素2（Ins2）基因组DNA,同时构建1个带有内部核糖体进入位点（IRES）序列、Cre重组酶序列和正负向筛选标记基因的微型打靶载体（mini-targeting vector）,最后通过同源重组获得Ins2-Cre打靶载体。结果 以Ins2基因的第3外显子为靶点,成功构建了受内源性Ins2基因启动子严格调控的表达Cre重组酶的基因敲入型打靶载体。结论 成功构建了在胰岛β细胞中特 异性表达Cre重组酶的基因敲入型打靶载体,为获得胰岛β细胞中基因特异性敲除小鼠模型提供了关键材料。     

线粒体钾通道Kcna3基因敲除小鼠初步制备

目的为观察线粒体钾通道在缺血再灌注(I/R)心肌损伤中的作用,探讨其和心衰的关系,制备基因敲除小鼠模型以探讨钾通道单分子作用。方法用BAC载体制备同源重组载体,对129小鼠胚胎干细胞(ES)打靶筛选后,显微注射至C57BL/6J小鼠囊胚获得嵌合小鼠。经尾基因组DNA PCR鉴定和测序,鉴别杂合子小鼠。结果在40只灰色小鼠中初步鉴定出Kcna3+/-基因型F1小鼠8只。结论在国内首先用ES同源重组基因打靶方法,成功育成Kcna3基因敲除鼠杂合子,为下一步获得纯合子鼠奠定了基础。对进一步用钾离子通道病模型研究心肌保护病理生理机制和药物筛选具重要意义。     

微小RNA簇miR-302s条件性基因打靶小鼠的制备和鉴定

目的 制备微小RNA簇miR-302s条件性基因打靶小鼠.方法 构建miR-302s打靶载体,通过电穿孔的方法转染胚胎干细胞(ES细胞),用正负筛选法筛选阳性ES细胞并进行PCR鉴定和Southern分析.利用显微注射技术将正确同源重组的ES细胞注射至B6(Cg)-Tyr＜sup＞c-2J＜/sup＞/J小鼠囊胚腔内,注射后的囊胚植入受体小鼠子宫.将得到的嵌合体小鼠与野生型雌鼠交配获得miR-302s-LoxP基因打靶小鼠.结果 获得嵌合体小鼠11只,其中4只嵌合雄鼠嵌合率＞50％.利用嵌合体小鼠进行繁育交配,得到miR-302s基因打靶杂合子小鼠11只.结论 成功建立miR-302s条件性基因打靶小鼠模型,为进一步研究miR-302s基因功能打下基础.     

小鼠β2m正义与反义RNA表达载体的构建及鉴定

目的：构建小鼠β2微球蛋白基因（β2 microglobulin gene,β2m)正义及反义RNA表达载体，为研究降低细胞MHC I类分子的表达作准备。方法：从小鼠基因组获得的β2m克隆中以β2m-pSV△HXgpt为模板，合成两对引物，采用常规PCR方法分别扩增出β2m引导区及其下游主要编码区，即外显子1及部分外显子2，然后利用重叠延伸法将两条片段拼接起来，再将其分别正向、反向插入载体pcDNA3，并进行限制性内切酶酶切鉴定及序列分析。结果：构建出小鼠β2m正义和反义RNA表达载体pcDNA3- β2mSN及pcSN及pcDNA3-β2mAN。结论：克隆的正义及反义β2m 经限制性内切酶酶切鉴定结果正确，测序分析结果与献一致，从而为下一步降低移植排斥反应的体内外研究奠定了基础。     

人HBV、HBx定向敲入p53位点大鼠胚胎干细胞株的建立

目的 建立人HBV、HBx定向敲入p53位点的大鼠胚胎干细胞株,为建立相关动物模型奠定基础.方法 通过PCR方法扩增出人p53基因上下游同源臂、HBV全基因组序列、HBV的X蛋白编码基因(HBx),将其插入本实验室自主构建的基因打靶通用载体pKO中,分别构建pKO-gHBV及pKO-X打靶载体.载体经SalⅠ酶切线性化后,电转入状态良好的大鼠胚胎干细胞株中,经3轮药物筛选,获得单细胞克隆.通过PCR技术筛选获得阳性细胞克隆,并进行支原体污染鉴定和核型分析.结果 成功构建pKO-gHBV及pKO-X打靶载体;电转大鼠胚胎干细胞株,经3轮药物筛选,分别挑取若干细胞克隆,其中2个pKO-X细胞克隆和1个pKO-gHBV细胞克隆经PCR鉴定、支原体检测和核型分析确定结果正确.结论 成功建立了人HBV、HBx定向敲入p53位点的大鼠胚胎干细胞株,为后续建立动物模型奠定了基础.     

敲除PKD1基因的小鼠胚胎干细胞的建立

目的：通过PKD1基因打靶载体的胚胎干细胞转染，药物筛选以及分子鉴定，获得发生同源重组的胚胎干细胞克隆，为产生PKD1基因缺陷小鼠品系准备条件。方法：体外培养小鼠胚胎干细胞，用电穿孔的方法进行PKD1基因打靶载体的转移，并用G418进行筛选培养，得到阳性克隆后，进一步扩大培养，抽提胚胎干细胞的基因组DNA，采用DNA印迹法进行分子鉴定。结果：经G418筛培养得到192个阳性在隆，分子鉴定获得2个发生同源重组的胚胎干细胞克隆。结论：鉴定得到的2个同源重组胚胎干细胞克隆，为进一步建立PKD1基因缺陷小鼠奠定了基础。     

携带人TGF-β1腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(Adeno-hTGF-β1),为hTGF-β1基因转染骨髓间质干细胞(BMSCs)的研究奠定基础。方法应用基因重组技术构建hTGF-β1腺病毒表达载体,分别用限制性内切酶酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定,并通过脂质体Fugene 6介导腺病毒DNA转染293细胞。结果重组hTGF-β1腺病毒DNA经限制性内切酶XhoⅠ酶切后,得到14.5、8.1、4.2、4.0、2.5、1.4、0.6 kb片段。与空白腺病毒相比,5.6 kb的片段已被置换成4.2 kb和4.0 kb片段;经PI-SceⅠ/I-CeuⅠ双酶切后,得到32.6 kb和2.6 kb含目的基因片段,片段大小无误,表明重组Adeno-hTGF-β1腺病毒表达系统构建成功。以重组Adeno-hTGF-β1DNA为模板的PCR产物中出现1.35 kb hTGF-β1目的基因片段,表明hTGF-β1基因成功连接至adeno-X腺病毒表达载体中。重组hTGF-β1腺病毒表达载体通过Fugene 6介导转染293包装细胞出现细胞病变效应(CPE)。采用PCR反应鉴定293细胞包装的腺病毒,证实扩增出247 bp的hTGF-β1目的基因片断和312 bp的腺病毒骨架基因片断。结论携带人hTGF-β1的腺病毒载体的构建成功,并能在293细胞包装,为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础。