DDX5对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨DDX5在类风湿关节炎滑膜中的表达,及其对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖及凋亡的影响。方法应用RT-qPCR检测类风湿关节炎滑膜组织中DDX5的表达;取行关节置换的类风湿关节炎患者滑膜细胞原代培养,转染siDDX5 72 h后,CCK8检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果DDX5 mRNA表达,类风湿关节炎组(1.61±0.63)高于对照组(1.00±0.00),(P0.05,t=4.56)差异有统计学意义;成纤维细胞增殖活性:转染72 h后,转染siDDX5组(0.81±0.02)低于转染siCtrl组(0.89±0.009),(P0.01,t=5.5),差异有统计学意义;细胞凋亡:转染72 h后,转染siDDX5组(21.7±2.12)高于转染siCtrl组(13.4±1.44),(P0.05,t=5.35),差异有统计学意义。结论 DDX5可能通过促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖,抑制凋亡,参与滑膜增生。     

血小板生成素抑制TGFβ1诱导的肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的研究

  目的  探讨血小板生成素处理对TGFβ1介导的肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响。  方法  CCK8法测定血小板生成素及TGFβ1组合处理后细胞生长的抑制率，采用荧光实时定量PCR及免疫荧光染色分别检测不同处理组细胞αSMA、COL1A2基因及蛋白的表达水平，应用免疫荧光染色检测细胞增殖相关蛋白Ki-67的表达水平，应用荧光实时定量PCR检测HO-1基因的表达水平。  结果  TGFβ1处理能够诱导肺成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，细胞形态发生显著变化且增殖速度提高，肌成纤维细胞标志基因/蛋白αSMA及COL1A2的表达水平随诱导时间延长显著提高（P < 0.01）。在TGFβ1处理同时添加血小板生成素（TPO），αSMA、COL1A2基因和蛋白的表达水平均显著下调（P < 0.01）。此外，TPO显著抑制TGFβ1诱导的细胞增殖，且增殖相关蛋白Ki- 67的表达水平较TGFβ1处理组显著降低（P < 0.05）。此外，发现TGFβ1处理导致HO-1的表达水平下降，而添加TPO能够挽救该基因的表达水平（P < 0.05）。  结论  血小板生成素能够抑制TGFβ1诱导的肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，这一发现对肺纤维化的对症治疗具有潜在的应用价值。      

过表达巨噬细胞移动抑制因子对子宫颈癌SiHa细胞上皮间质转化的影响

目的 探讨过表达巨噬细胞移动抑制因子（MIF）对子宫颈癌SiHa细胞发生上皮间质转化 （EMT）的影响.方法 应用基因转染方法将重组质粒pEGFP-N1-MIF转入SiHa细胞,构建过表达MIF的SiHa细胞;用实时荧光聚合酶链反应（RT-PCR）及免疫细胞化学方法分别检测各组细胞中E-cadherin、vimentin mRNA及蛋白的表达水平.结果 RT-PCR检测结果显示,转染pEGFP-N1-MIF的细胞中MIF mRNA相对表达量升高（F=2950.278,P＜ 0.01）;转染pEGFP-NI-MIF的细胞中vimentin的mRNA高于各对照组,而E-cadherin的mRNA低于各对照组（F值分别为2 135.048,1 893.563,均P＜0.01）;转染pEGFP-N 1-MIF的细胞中vimentin的蛋白表达水平高于各对照组,而E-cadherin的蛋白表达水平低于各对照组（F值分别为2 348.021,1 789.421,均P＜ 0.01）.结论 过表达MIF促进SiHa细胞中vimentin表达,抑制E-cadherin表达,说明过表达MIF促进子宫颈癌SiHa细胞发生上皮间质转化.     

MTSS1在胃癌组织中的表达及对胃癌细胞增殖凋亡的作用研究

目的 探讨肿瘤转移抑制候选基因(MTSS1)在胃癌组织中的表达水平及对胃癌细胞增殖凋亡的作用.方法 Western Blot检测胃癌组织及对应的癌旁组织中MTSS1蛋白表达水平.通过细胞转染的方法 将过表达载体pEGFP-N1-MTSS1、空载体pEGFP-N1转染至胃癌细胞中,MTT法检测转染48 h的细胞增殖情况,流式细胞术检测转染48 h的细胞凋亡情况,Western Blot检测转染48 h细胞中Cleaved Caspase-3、HES1、NICD1、NICD2蛋白表达水平.胃癌细胞与NOTCH信号通路抑制剂S2188作用48 h后,检测细胞凋亡及细胞中Cleaved Caspase-3、HES1、NICD1、NICD2蛋白表达水平.结果 胃癌组织中MTSS1蛋白水平明显低于癌旁组织(P=0.000);pEGFP-N1-MTSS1组细胞存活率明显低于pEGFP-N1组(P=0.000);pEGFP-N1-MTSS1组细胞凋亡率明显高于pEGFP-N1组(P=0.000);pEGFP-N1-MTSS1组细胞中Cleaved Caspase-3、HES1、NICD1、NICD2表达水平与pEGFP-N1组比较,差异均有统计学意义(P=0.000);NOTCH信号通路抑制剂S2188作用胃癌细胞48 h后,抑制剂组的细胞凋亡率明显高于对照组(P=0.000),两组的Cleaved Caspase-3、HES1、NICD1、NICD2蛋白表达水平比较,差异均有统计学意义(P=0.000).结论 MTSS1在胃癌组织中表达下调.MTSS1能促进胃癌细胞凋亡,抑制胃癌细胞增殖,作用机制与NOTCH信号通路有关.     

针对核干细胞因子腺病毒干扰载体构建与干扰作用观察

目的构建针对核干细胞因子(Nucleostemin)基因寂寞的RNA干扰腺病毒载体,观察其干扰作用。方法根据克隆的全长Nucleostemin基因(1 650bp,GenBank接受序号:AY825265)设计RNA干扰反向重复序列,采用分子生物学组装腺病毒载体,制备高效价RNAi重组腺病毒。实验分为Backbone-P1P2重组腺病毒感染组(P1P2干扰组)、Backbone-P3P4重组腺病毒感染组(P3P4干扰组)、Backbone空质粒病毒感染对照组(B组)和无病毒感染对照组。不同剂量腺病毒液RNAi(分别为60、30、15和7.5μL)转染F6细胞及U937细胞,采用蛋白质印迹法检测F6细胞及U937细胞中核干细胞因子的蛋白表达水平,采用实时荧光定量PCR(QPCR)检测U937细胞中核干细胞因子的mRNA表达水平。计数法绘制细胞生长曲线,判定细胞活力;流式细胞术检测细胞周期变化。结果靶向核干细胞因子基因的腺病毒RNA干扰载体(Backbone-P1P2,Backbone-P3P4)被成功构建。蛋白质印迹法检测结果显示,F6细胞内不同梯度浓度腺病毒RNA干扰后,核干细胞因子表达量分别为1.23、4.48、5.03和5.75,随P3P4片段RNA干扰浓度梯度下降而核干细胞因子表达量呈上升趋势。P1P2干扰组蛋白水平为0.219±0.051,与空质粒转染对照组的2.174±0.196比较明显降低,F=279.4,P<0.001;P3P4干扰组蛋白水平为0.0164±0.003,与空质粒转染对照组比较明显降低,F=363.4,P<0.001。P1P2干扰组基因表达水平为1.585±0.20,与空质粒转染对照组的3.932±0.271比较明显降低,F=145.9,P<0.001;P3P4干扰组基因表达水平为1.328±0.251,与空质粒转染对照组比较明显降低,F=149.9,P<0.001。细胞周期实验发现,核干细胞因子干扰后,P1P2腺病毒RNA干扰组为44.89±4.04,与空质粒转染对照组的54.74±3.28对比减低,F=10.75,P=0.031;P3P4干扰组为45.00±3.82,与空质粒转染对照组对比减低,F=11.23,P=0.029;S期+G2M期细胞P1P2干扰组为55.11±2.81,与空质粒转染对照组的45.26±1.72对比升高,F=26.82,P=0.007;P3P4干扰组为55.00±2.64,与空质粒转染对照组相比明显升高,F=28.67,P=0.006。表明核干细胞因子在细胞周期中阻碍G2/M检验点通过。结论成功构建针对核干细胞因子基因沉默的RNA干扰腺病毒载体,该病毒载体可特异有效的沉默下调核干细胞因子基因的表达,为今后研究核干细胞因子功能奠定了基础。     

雌激素受体β1上调p21基因表达抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖

目的将雌激素受体(ER)β1真核表达质粒转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞中,观察外源性ERβ1基因转染MDA-MB-231细胞后对p21基因表达和细胞增殖能力的影响,探讨ERβ1在乳腺癌中的生物学作用机制。方法应用脂质体法将ERβ1真核表达质粒转染至乳腺癌MDA-MB-231细胞中,流式细胞仪观察细胞凋亡率的变化;分别用实时聚合酶连锁反应(RT-PCR)、Western Blot检测转染前后细胞中ERβ1、p21mRNA和蛋白表达的变化;细胞增殖曲线显示转染后细胞增殖能力的改变。统计分析采用t检验和单因素方差分析。结果外源性ERβ1真核表达质粒转染组MDA-MB-231细胞较未转染组ERβ1、p21mRNA和p21蛋白水平明显增强(P0.010),细胞增殖能力明显减弱,细胞凋亡率从1.4%升至6.14%(t=-7.960,P=0.001)。结论 ERβ1可以通过上调p21基因抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖。     

成纤维生长因子19稳定敲减对大肠癌细胞增殖、迁移的影响

目的:构建慢病毒稳定敲减FGF19大肠癌细胞系,探究FGF19敲减对人大肠癌细胞增殖、迁移的影响。方法:通过慢病毒转染大肠癌COLO201和HCT116细胞,分别在适宜病毒转染指数条件下转染并构建稳转株;以嘌呤霉素进行筛选,获得稳定敲减FGF19的细胞株;PCR和Western bloting鉴定COLO201和HCT116稳转细胞株中FGF19的表达情况;Transwell实验检测细胞的迁移活性,CCK-8和克隆形成实验检测细胞的增殖活性。结果:成功构建了稳定敲减FGF19的两株大肠癌细胞。稳定敲减FGF19的HCT116、COLO201细胞(KD组)的FGF19 mRNA水平与空载对照组(NC组)相比明显减少(P=0.001 1,P=0.000 1);与NC组相比,KD组细胞的FGF19蛋白表达明显下降,差异均具有统计学意义(P=0.001,P=0.000 1)。KD组细胞的迁移活性以及增殖能力均相比NC组明显下降(迁移P=0.001 7/P=0.000 1; CCK-8 P=0.042 5/P=0.033 4;克隆P=0.005 1/P=0.002 2)。结论:成功构建FGF19...     

EGFRvⅢ在人脑成胶质细胞瘤中的表达及其对成胶质细胞瘤A172细胞增殖的影响

目的:探讨表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(epidermal growth factor receptor variant Ⅲ,EGFRvⅢ)在人脑成胶质细胞瘤中的表达及其对成胶质细胞瘤A172细胞增殖的影响.方法:应用免疫组织化学染色法检测EGFRvⅢ在60例人脑成胶质细胞瘤及其癌旁正常脑组织中的表达.建立稳定高表达EGFRvⅢ的成胶质细胞瘤A172细胞株,应用细胞计数法、MTT法、细胞克隆形成实验以及裸鼠成瘤实验检测其对成胶质细胞瘤A172细胞增殖的影响.结果:EGFRvⅢ在脑成胶质细胞瘤组织中的阳性表达率明显高于其癌旁正常脑组织(P＜0.01);与转染空载体对照组比较,高表达EGFRvⅢ的A172细胞增殖能力明显增加;对照组和高表达EGFRvⅢ组的细胞克隆数分别为(50±10)个和(140±25)个,差异有统计学意义(P＜0.01);高表达EGFRvⅢ组的裸鼠皮下移植瘤的体积和质量均高于对照组(P＜0.01).结论:EGFRvⅢ在人脑成胶质细胞瘤组织中高表达,并且可促进成胶质细胞瘤A172细胞的增殖.     

蛋白激酶SGK3过表达对乳腺癌细胞株MDA-MB-231影响的研究

目的 血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶3 (serum and glucocorticoid-inducible protein kinase 3,SGK3)参与细胞增殖、分化和物质转运等生命活动,在某些肿瘤形成中担任重要角色.本研究设计观察SGK3过表达对乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞增殖和存活的影响,并初步探讨其作用的分子机制.方法 免疫组化方法检测乳腺癌组织中SGK3蛋白的表达;通过GenEscortTMⅠ介导用重组质粒pEGFPN1-SGK3瞬时转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,荧光显微镜和蛋白质印迹法鉴定转染细胞中融合蛋白SGK3-GFP的表达;细胞增殖实验观察转染细胞的生长增殖情况;流式细胞术分析转染细胞的细胞周期时相变化;蛋白质印迹方法检测细胞增殖与存活相关基因的表达.结果 SGK3在乳腺癌组织中的表达量明显高于癌旁组织和正常乳腺组织(F=29.672,P＜0.001),与二者组间比较,均P＜0.01.荧光显微镜下可见转染细胞因外源基因的表达而发出绿色荧光,且蛋白质印迹法检测可见融合蛋白SGK3-GFP的表达;过表达SGK3的MDA-MB-231细胞,其细胞生长速度加快,细胞倍增时间缩短(F=19.557,P-0.001),与亲本细胞及转染空载体细胞组间比较均P＜0.01.与亲本细胞和转染空载体组比较,SGK3过表达使细胞凋亡比例明显下降(F=12.156,P=0.008),与前两者组间比较P值分别为0.019和0.030;细胞内源性Bad的表达量降低(F=11.152,P=0.010),与前两者组间比较P值分别为0.008和0.005;而Bcl-xL(F=8.810,P=0.016,与前两者组间比较P值分别为0.014和0.009)以及p-GSK3β(F=42.253,P＜0.001,与前两者组间比较P值分别为＜0.001和0.009)的表达量均升高.结论 乳腺癌组织高表达SGK3,SGK3过表达可促进MDA-MB-231细胞的增殖与存活,影响细胞增殖与存活相关基因的表达可能是其发挥作用的主要分子机制.     

放射线诱导Smad 7基因表达阻断放射性肺纤维化离体实验研究

目的研究含Egr-1基因启动子和Smad 7 cDNA的重组腺病毒在细胞水平表达Smad 7蛋白，是否具有阻断转化生长因子-β1(TGF-β1)信号传导通路从而阻断胶原合成的生物学活性。方法重组腺病毒感染成纤维细胞(3T6)，经深部X线照射后通过免疫细胞化学方法检测Smad 7蛋白在细胞内的表达定位。成纤维细胞再经TGF-β1刺激后通过^3H-胸腺嘧啶核苷(^3H-TdR)和^3H-脯氨酸(^3H-Pro)结合法检测比较实验组和对照组细胞增殖能力和胶原合成情况，采用液体闪烁计数法测定每分钟闪烁计数(cpm)值进行定量比较。结果细胞免疫化学结果显示Smad 7蛋白表达定位于细胞浆内。同位素^3H—Pro检测结果显示实验组cpm值为3287，对照组cpm值为5690，两者差异有统计学意义(P=0．026)。空白组cpm值为3625，与实验组无差别(P=0．741)，说明实验组成纤维细胞胶原合成量明显低于对照组，与基础水平相当。^3H—TdR检测结果显示各组间细胞增殖能力无明显差别(P=0．312)。结论通过重组腺病毒在成纤维细胞内表达的Smad7蛋白具有在细胞浆内阻断TGF-β1信号传导通路从而抑制胶原合成的生物学活性，其抑制胶原合成可能是在转录水平实现的。     

沉默AQP-5表达对结肠癌细胞株HT-29凋亡影响机制探讨

目的 通过抑制内源性水通道蛋白(AQP-5)的表达,探讨AQP-5对HT-29细胞凋亡及凋亡抑制蛋白(inhibitaors of apoptosis proteins,IAPs)表达的影响.方法 体外常规培养人结肠癌HT-29细胞,通过siRNA技术抑制内源性AQP-5的表达,并经蛋白质印迹法检测AQP-5-siRNA转染效率;采用MTT法检测各组细胞增殖抑制率;流式细胞术检测细胞凋亡率;荧光实时定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测转染AQP-5-siRNA的HT-29细胞IAPs家族成员c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NAIP、Survivin和Livin表达水平.结果 蛋白质印迹法检测结果显示,转染AQP-5-siRNA的HT-29细胞AQP-5表达下调达90％.MTT分析结果显示,与转染NS-siRNA组细胞增殖抑制率(1.13±0.11)％相比,AQP-5-siRNA组的HT-29细胞增殖抑制率显著增加,高达(27.9±5.16)％,t=12.705,P＜0.001;流式细胞分析结果发现,与NS-siRNA组细胞凋亡率(0.99±0.18)％相比,AQP-5-siRNA组的HT-29细胞凋亡率显著增加,高达(10.81±1.32)％,t=-12.767,P＜0.001.荧光实时定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测结果显示,与转染NS-siRNA组相比较,AQP-5-siRNA组c-IAP1(t=-3.232,P=0.018)、c-IAP2(t=-0.651,P=0.001)、XIAP(t=-9.296,P＜0.001)和Livin(t =-8.07,P＜0.001)的mRNA表达水平下降,AQP-5-siRNA组c-IAP1(t=-0.591,P=0.007)、c-IAP2(t=-4.889,P=0.008)、XIAP(t=-6.487,P=0.003)和Livin(t=-6.216,P=0.003)蛋白表达水平也下降,其中以XIAP下降最明显;Survivin和NAIP表达变化不明显.结论 AQP-5-siRNA可体外促进HT-29细胞凋亡,其机制可能与下调c-IAP1、c-IAP1、XIAP和Livin mRNA及蛋白表达有关.     

半乳糖凝集素3对食管癌Eca109细胞增殖和转移的影响

目的 探讨半乳糖凝集素3（Gal3）对食管癌Eca109细胞增殖和转移的影响.方法 构建合成Gal3过表达慢病毒质粒转染食管癌Eca109细胞,应用倒置显微镜观察Gal3的过表达质粒转染食管癌细胞后荧光表达;CCK-8法检测转染前后细胞增殖能力的变化;用流式细胞术检测转染组细胞和未转染组细胞凋亡率.Transwell方法检测转染前后细胞迁移能力变化;用Western印迹检测Gal3转染前后在食管癌中表达水平变化.结果 Western印迹结果显示Gal3在食管癌细胞中表达,在Eca109/Gal3组中表达水平明显升高（t=14.33,P=0.013;t=10.28,P=0.037）.CCK-8法检测发现转染后细胞增殖能力明显升高（t=-17.277,P＜0.05;t=-13.4,P＜0.05）,流式细胞仪以Annexin-V/7-AAD双标法显示Eca109/Gal3组凋亡率明显下降（t=3.053,P＜0.05;=5.446,P＜0.05）.Transwell实验结果,Eca109/Gal3组细胞转移率高于未转染组（t=3.465,P＜0.05;t=3.252,P＜0.05）.结论 Gal3在食管癌细胞中有表达,并且其过表达能显著增强食管癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力,明显抑制细胞的凋亡,深入研究Gal3可能为食管癌的治疗提供一种新的靶点.     

碱性成纤维细胞生长因子小分子干扰RNA对胶质瘤细胞株U251增殖与凋亡的影响

背景与目的:碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors,FGFs)家族中的重要一员,bFGF是多功能细胞因子,参与创伤愈合、组织修复、未成熟神经细胞的增殖和分化过程.本课题组前期对bFGF在胶质瘤中的表达做过研究,证实bFGF在胶质瘤细胞中过表达,并刺激胶质瘤细胞的增殖和新生血管生成.本研究检测bFGF小分子干扰RNA对胶质瘤细胞的增殖和凋亡的影响.方法:用化学法合成四条针对bFGF的siRNA和一条阴性对照siRNA,并用脂质体法转染胶质瘤细胞系U251;以Opti-MEM I无血清培养基培养的U251细胞作为正常对照.通过RT-PCR和免疫组化的方法检测bFGF的表达,并用流式细胞术、MTT法检测转染后U251细胞的凋亡和增殖活性的变化.结果:转染48 h后,正常对照、阴性对照、siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3和siRNA-4组U251细胞中的bFGF mRNA水平分别为0.95 0.02、0.95±0.02、0.85 0.02、0.76±0.04、0.65±0.04和0.56±0.03;转染72 h后,分别为0.95±0.04、0.89±0.05、0.81±0.05、0.80±0.05、0.77±0.04和0.53±0.05.四条bFGF siRNA中,siRNA-4作用最显著.转染48 h后,siRNA-4和阴性对照组细胞增殖抑制率分别为(66.4±1.2)%和(56.3±1.4)%;转染72 h后,分别为(40.0±2.6)%和(14.7±0.6)%,siRNA-4与阴性对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05).结论:理想的bFGF小分子干扰RNA 能够抑制该基因的表达并抑制胶质瘤细胞的增殖活性.     

碱性成纤维细胞生长因子反义寡核苷酸对肝癌细胞凋亡的影响

目的 检测碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)反义寡核苷酸对肝癌细胞凋亡的影响,探讨bFGF作为肝癌治疗靶点的有效性.方法 以脂质体作为转染载体,转染bFGF反义寡核苷酸于HepG2细胞,用共聚焦显微镜和Western blot方法,检测转染bFGF反义寡核苷酸后肝癌细胞株HepG2中bFGF蛋白的表达,用流式细胞仪检测转染bFGF反义寡核苷酸后HepG2细胞的凋亡率.结果 与转染错义寡核苷酸组相比,bFGF反义寡核苷酸对HepG2细胞中bFGF蛋白表达有明显抑制作用,转染bFGF反义寡核苷酸可明显增加HepG2细胞的凋亡率(P＜0.01).结论 bFGF在肝癌细胞凋亡中有重要调节作用,可作为肝癌增敏治疗的有效靶点.     

宫颈癌相关成纤维细胞的分离与鉴定

目的 宫颈癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast,CAF)在宫颈癌的进展中起着重要作用,原代成纤维细胞培养与体内微环境更为接近.本研究旨在分离纯化并鉴定CAF,初步探讨CAF的生物学特性.方法 选择郑州大学第一附属医院妇科2015-01-04-03-27收治的患者6例.用胶原酶消化法分离宫颈正常成纤维细胞(normal fibroblast,NF)和CAF;显微镜下观察细胞形态;用CCK-8法绘制生长曲线;ELISA法检测细胞上清中人转化生长因子β1(transforminggrowth factor betal 1,TGF-β1)的分泌水平;免疫荧光法及蛋白质印迹法检测细胞标志物波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)和成纤维细胞活化蛋白α(fibroblast activation protein α,FAPα).结果 CAF大小、形状不一,密度接触抑制消失;NF大小、形状一致,存在密度接触抑制.CAF的生长速度快于NF,z=-2.160,P=0.031.CAF中TGF-β1的浓度为(449.93±19.99) ng/L,而NF中为(209.50±16.25) ng/L,二者差异有统计学意义,z=-2.611,P=0.008.CAF高表达α-SMA和FAPα,而NF不表达α-SMA和FAPα,两者均表达Vimentin.结论 成功分离纯化并鉴定CAF.CAF具有平滑肌和成纤维细胞双重特性,其增殖能力及细胞活性均强于NF.     

胰腺癌相关性成纤维细胞中前列腺环素合成酶对胰腺癌细胞作用研究

目的 探究胰腺癌相关性成纤维细胞(CAFs)中的前列腺环素合成酶(PGIS/PTGIS)对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及相关作用机制。方法 利用GEPIA、Kaplan-Meier等数据库分析PGIS在胰腺癌及正常胰腺组织中的表达差异;通过q-PCR检测PGIS在CAFs及人胰腺星状细胞(HPSC)中的表达差异;通过CoCl₂化学诱导构建肿瘤微环境缺氧模型,检测胰腺癌及CAFs细胞的PGIS表达水平;利用siRNA转染、慢病毒感染的方式分别构建敲低和过表达PGIS的CAFs细胞,通过CCK-8增殖、Transwell迁移及侵袭等实验探究敲低和过表达PGIS的CAFs细胞对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;通过小鼠胰腺原位成瘤探究过表达PGIS的CAFs细胞在体内对胰腺癌细胞增殖的影响;通过Western blot检测过表达PGIS的CAFs细胞对胰腺癌PI3K/Akt通路相关蛋白表达的影响。结果GEPIA、Kaplan-Meier数据库分析显示,与正常胰腺组织相比,PGIS在胰腺癌组织中高表达,并且与患者不良预后相关(P<0.05);与HPSC细...     

MiR-124对食管癌细胞增殖和侵袭的作用及机制研究

摘 要：［目的］检测miR-124及其靶基因CREB1在食管癌组织中的表达情况,探讨miR-124/CREB1在人食管鳞癌细胞KYSE-150体外增殖和侵袭中的作用及机制。［方法］ 通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测32例食管鳞状细胞癌(ESCC)组织及周围正常组织的miR-124和CREB1表达。Targetscan分析miR-124与CREB1的结合位点,荧光素酶基因报告实验验证miR-124 与CREB1是否结合;过表达或抑制miR-124后,采用Western blot检测KYSE-150细胞中CREB1的表达;在KYSE-150细胞中转染miR-124 mimic为miR-124 mimic或转染miR-124抑制剂为anti-mi-R124,转染后24h、48h、72h收集细胞计数,检测细胞增殖情况;转染24h后通过体外侵袭实验检测过表达或抑制miR-124对KYSE-150细胞侵袭的影响。在KYSE-150细胞中转染CREB1 siRNA后24h、48h、72h收集细胞计数,检测细胞增殖情况;转染CREB1 siRNA 24h后检测KYSE-150细胞侵袭能力的变化;在KYSE-150细胞中共同转染anti-miR-124和siCREB1,检测细胞增殖和侵袭能力变化情况。［结果］ MiR-124在食管癌组织表达降低(P<0.001),而CREB1在食管癌组织中表达升高(P<0.001);CREB1是miR-124下游分子,过表达miR-124抑制KYSE-150细胞中CREB1的表达(P=0.016),抑制miR-124促进KYSE-150细胞中CREB1的表达(P<0.001)。在食管癌细胞中,过表达miR-124抑制KYSE-150细胞的增殖和侵袭(P均<0.05),抑制miR-124促进KYSE-150细胞的增殖和侵袭(P均<0.05);敲低CREB1抑制KYSE-150细胞的增殖和侵袭(P均<0.05)。敲低CREB1可抑制anti-miR-124对KYSE-150细胞增殖和侵袭的促进作用(P均<0.05)。［结论］过表达miR-124通过靶向CREB1抑制食管癌细胞的增殖和侵袭。     

宫颈及宫颈癌间质成纤维细胞的分离、鉴定与衰老检测研究

背景与目的：宫颈癌作为最常见的妇科恶性肿瘤之一,近年来发病呈年轻化趋势。目前认为人类乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的感染,特别是高危型HPV感染是其发生的主要因素。已有研究证实,在肿瘤发生的微环境中,间质成纤维细胞衰老可能促进上皮性肿瘤的发生,但宫颈癌的发生是否也伴有间质成纤维细胞的衰老鲜见报道。本研究拟对正常宫颈和宫颈癌间质成纤维细胞进行特异性研究,以揭示慢性炎症诱导宫颈癌发生的机制,旨在为宫颈癌的诊治提供新的理论依据。方法：分离纯化正常宫颈成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)和宫颈癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs),通过ELISA法检测细胞因子白介素-6(interleukin-6,IL-6)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的分泌水平;并用衰老相关β-半乳糖甘酶染色(senescence-associated β-galactosidase,SA-β-gal)、细胞计数和蛋白质印记法(Western blot)分别鉴定细胞衰老、绘制细胞生长曲线和检测NFs与CAFs中p16蛋白表达。结果：CAFs分泌的细胞因子IL-6和VEGF比NFs高2倍以上(P<0.05);CAFs中SA-β-gal的活性比NFs高;而CAFs中p16水平的表达水平比NFs中高。结论：间质成纤维细胞衰老可能与宫颈癌的发生和HPV密切相关,研究细胞因子介导的宫颈癌间质衰老可能有助于宫颈癌的预防、诊断和治疗。     

OCT-4在宫颈癌内表达情况及沉默表达后对宫颈癌Siha细胞放射敏感性影响

目的 研究OCT-4在宫颈癌组织中表达情况及沉默表达后对人鳞状宫颈癌Siha细胞放射敏感性的影响和机制。方法 利用RT-PCR和蛋白印迹法检测 20例宫颈癌患者癌组织中OCT-4基因mRNA和蛋白表达水平。OCT-4-SiRNA转染构建OCT-4沉默表达Siha细胞系并进行检测(OCT-4 SiRNA组),并设置未转染对照组和NC转染对照组。MTT和克隆实验检测各组细胞增殖情况,流式细胞术检测各组细胞凋亡和细胞周期情况,蛋白印迹法检测各组细胞中cleaved-caspase-3和p-Akt水平。多组间比较行单因素方差分析,两组间比较行成组t检验。结果 随着宫颈癌患者放疗敏感性降低OCT-4基因mRNA (P=0.011、0.009、0.003、0.001)和蛋白表达水平(P=0.008、0.005、0.002、0.001)逐渐升高。与未转染对照组和NC转染对照组相比,OCT-4-SiRNA沉默表达组Siha细胞经不同剂量X射线照射后的细胞增殖抑制率上升(P=0.009、0.003、0.001、0.001);克隆形成能力显著降低(P=0.008、0.005、0.001、0.001),细胞凋亡上升并阻滞细胞在G₁期,细胞中cleaved-caspase-3水平上升而p-Akt水平下降。结论 OCT-4表达水平与宫颈癌患者放疗敏感性相关,而沉默OCT-4表达能提高Siha细胞放射敏感性,并通过促进cleaved-caspase-3而抑制p-Akt水平发挥作用。