脂多糖通过PI3K/Akt/mTOR通路调控巨噬细胞自噬*

 目的： 观察脂多糖对巨噬细胞自噬活化的影响及相关信号通路的探讨。方法: 体外培养巨噬细胞株RAW264.7,分为对照组、饥饿状态激活自噬组、单纯脂多糖（LPS）刺激组、LPS+PI3K抑制剂（hVps34）组和LPS+mTOR抑制剂（雷帕霉素）组。构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-GFP-LC3,转染巨噬细胞,通过荧光显微镜观察各组细胞中自噬体形成情况。qRT-PCR方法检测各组中与细胞自噬相关的Atg5、Atg7、LC3-II和Bnip3 mRNA表达水平的改变。利用Western blotting检测LC3-II、p-Akt和p-mTOR蛋白在各组中的表达情况,以评价LPS激活巨噬细胞自噬的分子通路。结果: 成功构建稳定表达GFP-LC3的巨噬细胞,在荧光显微镜下可以观察到自噬在饥饿状态组、LPS+hVps34组和LPS+雷帕霉素组均有明显增强;qRT-PCR检测到Atg5、LC3-II和Bnip3 mRNA的表达在饥饿状态组、LPS+hVps34组和LPS+雷帕霉素组均有明显增强,而在LPS组中略微下降;Western blotting 检测发现p-Akt在饥饿状态组、LPS组和LPS+雷帕霉素组中表达明显升高;p-mTOR在饥饿状态组、LPS+hVps34组和LPS+雷帕霉素组表达明显下降;LC3-II的表达在饥饿状态组、LPS+hVps34组和LPS+雷帕霉素组中表达要高于对照组和LPS组。结论: LPS参与巨噬细胞自噬的调控,其可能的信号通路为PI3K/Akt/mTOR通路,但仍存在其它有效的调控通路。     

ASF1B通过PI3K/Akt通路调节人胶质瘤细胞的增殖和侵袭

目的:探讨抗沉默功能1B组蛋白伴侣(ASF1B)对人胶质瘤细胞的增殖与侵袭的影响及机制。方法:首先比较GENT2数据库中正常人脑组织与人脑肿瘤组织中ASF1B的表达,分析ASF1B表达与预后的关系;WesternBlot法检测A172、U87、U251和HS683细胞系中ASF1B的表达;采用siRNA技术抑制人脑胶质瘤细胞系U251和U87细胞ASF1B基因表达;分别通过CCK-8法和Transwell小室法检测U251和U87细胞增殖和侵袭情况,Western Blot法检测PI3K/Akt通路中p-Akt和p-mTOR蛋白的表达水平。结果:与正常脑组织相比,ASF1B在人脑肿瘤组织中的表达明显增加,ASF1B高表达的人脑肿瘤患者总生存期更短(P=0.036);ASF1B下调不仅明显抑制U251和U87细胞的增殖和侵袭;也明显抑制p-Akt和p-mTOR蛋白表达。结论:ASF1B通过PI3K/Akt通路促进U251和U87细胞增殖和侵袭。     

小剂量EMAP-II诱导U251细胞凋亡和自噬性死亡

目的研究小剂量内皮-单核细胞激活多肽(EMAP-II)对人U251胶质瘤细胞凋亡和自噬的影响。方法培养人U251胶质瘤细胞,给予小剂量EMAP-II,或者给予自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)和广谱caspase抑制剂zVAD-fmk预处理后再给予小剂量EMAP-II,应用MTT法检测细胞活力;小剂量EMAP-II作用不同时间后,应用Hoechst33342染色观察U251细胞的凋亡程度;应用免疫荧光法检测微管相关蛋白轻链-3(LC3)在U251细胞的分布;Western blot方法检测bcl-2、bax和LC3-Ⅱ的蛋白表达水平。结果与对照组相比,小剂量EMAP-II显著抑制了人U251胶质瘤细胞的活力,在EMAP-II作用0.5h时效果最显著;然而,3-MA和zVAD-fmk均能显著增强U251细胞活力,二者联合应用后细胞活力恢复至对照组水平;EMAP-II作用后可见U251胶质瘤细胞核染色质凝聚、边缘化;同时伴有bcl-2蛋白表达的显著降低和bax蛋白表达的显著增强;自噬标记物LC3在胞浆内呈点状分布,荧光表达显著增强,并且LC3-II的蛋白表达水平显著上调。结论小剂量EMAP-II能够显著抑制人U251胶质瘤细胞活力,诱导人U251胶质瘤细胞的凋亡和自噬性死亡。     

Akt激酶抑制剂MK-2206诱导U2OS人骨肉瘤细胞凋亡与自噬

 目的：研究Akt抑制剂MK-2206对U2OS细胞凋亡和自噬的影响。方法：采用MTT法检测MK-2206对U2OS细胞活力的影响,DNA片段末端标记试剂盒检测细胞凋亡的变化,免疫印迹法检测细胞内蛋白的表达,用LC3-II的表达量用来确定细胞的自噬水平。结果：MK-2206剂量依赖性地降低了U2OS细胞的活力;MK-2206能够促进caspase-9、caspase-3和PARP的活化切割而诱导U2OS细胞发生凋亡;MK-2206给药后可促进细胞内LC3-II的表达,氯喹阻断自噬后明显增强了MK-2206对U2OS细胞活力的抑制作用。结论：Akt 抑制剂MK-2206能够诱导U2OS细胞发生凋亡和自噬;抑制自噬可促进MK-2206对U2OS细胞的毒性。     

利多卡因通过PI3K/Akt途径抑制人口腔癌细胞HN13增殖并促进其凋亡

目的：研究利多卡因对人口腔鳞癌细胞HN13增殖、凋亡的影响及机制。方法：常规条件下培养人口腔鳞癌细胞HN13,分为对照组（NC,不添加任何药物）、利多卡因低（40μmol/L）、中（400μmol/L）、高（4 000μmol/L）剂量组、阳性对照组（PC,100μmol/L顺铂）,采用CCK-8法测定细胞OD值,分析不同浓度利多卡因对癌细胞增殖的影响;采用Annexin V-FITC/PI双染法结合流式细胞术检测不同浓度利多卡因对HN13细胞凋亡的影响。Western blot检测各组细胞PI3K/Akt途径中关键分子p-PI3K、p-Akt、Bcl-2等蛋白表达差异。结果：CCK-8结果显示,与对照组相比,利多卡因400μmol/L、4 000μmol/L处理组细胞存活数减少（P<0.05）。流式细胞术检测结果显示400μmol/L、4 000μmol/L利多卡因处理组细胞凋亡率提高（P<0.05）。Western blot结果显示,与NC对照组相比,利多卡因处理后各组细胞中p-PI3K、p-Akt、Bcl-2表达明显降低（P<0.05）,其中4 000μmol/...     

荷叶碱通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路促进自噬减少巨噬细胞泡沫化的机制研究

目的:探讨荷叶碱对泡沫细胞形成的影响及其可能的分子机制。方法:体外培养人单核-巨噬细胞系THP-1,利用氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导建立泡沫细胞模型,同时用5、10和20μmol/L荷叶碱进行干预。采用油红O染色观察细胞内脂质沉积;用试剂盒测定细胞总胆固醇含量;通过Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、P62、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)蛋白水平,免疫荧光检测自噬流,透射电镜检测自噬小体,评估细胞内自噬水平及自噬相关通路的变化。利用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制细胞自噬,观察荷叶碱是否通过调控自噬抑制泡沫细胞形成。结果:与正常对照组相比,Ox-LDL组细胞内脂质沉积和总胆固醇含量显著增加。与Ox-LDL组相比,荷叶碱组细胞内脂质沉积和总胆固醇含量显著减少,自噬流显著增强,自噬小体增多;3-MA处理后,荷叶碱抑制细胞泡沫化的作用被削弱。荷叶碱降低p-mTOR和p-Akt蛋白水平。结论:荷叶碱可能通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt/mTOR通路促进自噬,减少细胞内脂质沉积,从而抑制泡沫细...     

白藜芦醇通过PI3K/Akt通路及线粒体途径抑制软骨肉瘤

 目的：探讨白藜芦醇抑制软骨肉瘤的机制及对线粒体途径和PI3K/Akt通路的影响。方法：SW1353软骨肉瘤细胞培养至对数生长期后设对照组和白藜芦醇处理组,药物处理组用25、50和100 μmol/L白藜芦醇处理24 h、48 h或72 h。采用CCK8法检测SW1353软骨肉瘤细胞的活力,Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡,Western blotting检测activated caspase-3、Bcl-2、Bax、Akt和p-Akt蛋白在细胞中表达情况,细胞划痕实验观察细胞迁移情况。结果：白藜芦醇处理后细胞活力下降,呈时间-剂量依赖性（P<0.01）。Hoechst  33258染色检测可见药物处理组有明显的细胞凋亡核象。Western blotting检测显示药物处理组activated caspase-3和Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白和p-Akt蛋白表达下调,总Akt改变不显著。细胞划痕试验显示,白藜芦醇能显著抑制SW1353细胞的迁移。结论：白藜芦醇能够诱导软骨肉瘤凋亡,部分是通过线粒体途径及PI3K/Akt信号通路发挥作用。     

lncRNA-CCAT1通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路对宫颈癌HeLa细胞自噬的影响

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)结肠癌相关转录因子1(CCAT1)对宫颈癌HeLa细胞自噬的影响及其可能作用机制.方法:培养宫颈癌HeLa细胞,将CCAT1过表达质粒pcDNA3.1-CCAT1转染至HeLa细胞中,采用qRT-PCR检测转染后细胞中CCAT1的表达水平;CCK8法检测细胞增殖活性;单丹磺酰戊...     

PI3K/Akt信号通路在脓毒症肾脏损伤诱导的自噬中的调节作用*

 目的：研究脓毒症造成肾脏损伤时的自噬情况以及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B(Akt)信号通路的调节作用。方法：对大鼠盲肠进行结扎与穿刺（CLP）,对肾脏组织切片进行HE染色,并测定血清尿素氮和肌酐。通过Western blotting定量分析CLP大鼠肾脏损伤发生后不同时点自噬相关分子微管相关蛋白轻链3（LC3）Ⅰ/Ⅱ、beclin-1和Akt蛋白磷酸化的表达情况;体外用LPS诱导人近端肾小管上皮细胞株HK-2发生自噬,检测不同浓度LPS和不同刺激时间自噬相关分子LC3Ⅰ/Ⅱ和Akt蛋白磷酸化的表达情况;进一步使用PI3K抑制剂、Akt抑制剂和LPS刺激HK-2细胞观察自噬相关蛋白的表达情况及细胞的凋亡水平。结果：同对照组相比,CLP大鼠显微镜下可见肾损伤的典型病理改变,血清尿素氮和肌酐均有上升。CLP肾脏损伤发生后,自噬相关蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、beclin-1含量及Akt磷酸化水平均有上升。LPS刺激HK-2细胞后,随着刺激浓度的增加,p-Akt(308)表达量逐渐提高,而LC3Ⅰ/Ⅱ及p-Akt(472)的表达量在10 mg/L LPS刺激组最高。随着刺激时间的延长,p-Akt(308)表达量逐渐提高;LC3Ⅰ/Ⅱ表达量同p-Akt(472)在刺激8 h时最高;使用PI3K抑制剂及Akt抑制剂后,LPS诱导的LC3表达显著下调,HK-2细胞凋亡明显增加。结论：CLP肾脏损伤发生时可以诱导自噬发生, PI3K／Akt信号通路在其中发挥重要调节作用。     

紫草素通过PI3K/Akt通路抑制氧糖剥夺诱导的大鼠原代皮层神经元凋亡

目的:探讨紫草素对氧糖剥夺(OGD)损伤模型中大鼠原代皮层神经元的作用及机制。方法:用不同浓度(0. 02、0. 2、2和20μmol/L)紫草素对大鼠原代皮层神经元经进行预处理,再经OGD损伤处理,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法和荧光素二乙酸酯/碘化丙啶(FDA/PI)双染法分别检测神经元活性和凋亡情况,选择最适紫草素浓度。然后,在加入紫草素之前提前加入LY294002(PI3K/Akt信号通路抑制剂,1μmol/L),用Wesern blot法检测神经元p-Akt(Ser473)水平变化,用LDH法和FDA/PI双染法检测神经元活性和凋亡率变化。结果:0. 2、2及20μmol/L的紫草素可显著提高神经元存活率(P 0. 05),同时还可使神经元内p-Akt(Ser473)水平显著升高(P 0. 05); LY294002可显著阻断紫草素对神经元p-Akt(Ser473)水平和凋亡率的影响(P 0. 05)。结论:紫草素可通过激活PI3K/Akt通路来减少OGD诱导的大鼠原代皮层神经元凋亡。     

丙泊酚对人胶质瘤U251细胞株增殖、凋亡、侵袭和转移能力的调节作用

目的　探究丙泊酚对人胶质瘤U251细胞增殖、凋亡、侵袭和转移能力的作用和机制。 方法 将细胞随机分为U251组、Propofol（1 mM）组、Propofol（2 mM）组和Propofol（5 mM）组。除U251组外,其余组用相应浓度的丙泊酚处理,CCK8检测细胞增殖,流式检测细胞凋亡,Transwell检测细胞侵袭能力,划痕实验检测细胞迁移能力,Western blot检测Ki67、Caspase-3、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF）、磷脂酰肌醇-3-羟激酶（Phosphoinositide 3-kinase, PI3K）、Akt、p-PI3K和p-Akt的表达。 结果 与U251组比较,Propofol （1, 2, 5 mM）组细胞增殖速度明显降低,细胞凋亡率显著升高;同时,Propofol （1, 2, 5 mM） 组侵袭细胞数与U251组比较明显减少,Propofol（2, 5 mM） 组划痕闭合率明显低于U251组;此外,丙泊酚还能显著抑制细胞增殖和迁移相关蛋白Ki67和VEGF表达,诱导细胞凋亡相关蛋白Caspase-3表达;丙泊酚能明显降低p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的比值。 结论 丙泊酚能降低胶质瘤U251细胞的增殖、侵袭和转移能力,抑制U251细胞凋亡,作用机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路激活有关。     

PI3K/Akt/mTOR信号通路在巨噬细胞自噬及动脉粥样硬化斑块不稳定中的作用

 目的：探讨磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路在巨噬细胞自体吞噬以及动脉粥样硬化斑块不稳定中的作用。方法：利用Akt抑制剂康士得（20 μmol/L）、mTOR抑制剂雷帕霉素（10 nmol/L）及mTOR-siRNA（30 nmol/L）体外处理小鼠RAW 264.7 巨噬细胞株 48 h后,透射电镜观察巨噬细胞自噬体的变化,细胞免疫荧光法及Western blotting法检测微管相关蛋白LC3-II表达,实时荧光定量qRT-PCR和Western blotting法检测Akt、mTOR及自噬相关蛋白Beclin 1的表达,ELISA检测巨噬细胞分泌炎症因子水平。体内实验中, 24只雄性新西兰兔给予球囊损伤+ 1%胆固醇喂养8周,然后随机分为对照组、康士得（1.0 mg·kg-1·d-1）组和雷帕霉素（0.5 mg·kg-1·d-1）组,每组8只,干预4周。血管内超声（IVUS）检测斑块的影像学特征,透射电镜观察斑块中巨噬细胞超微结构的改变,免疫荧光法检测微管相关蛋白LC3-II表达,免疫组织化学法检测巨噬细胞Akt和mTOR的蛋白表达。 结果：与对照组比较,康士得、雷帕霉素及mTOR-siRNA干预巨噬细胞后,透射电镜下观察到自噬体明显增多,微管相关蛋白LC3-II和自噬相关蛋白Beclin 1的表达水平明显上调,而Akt及mTOR 的mRNA及蛋白表达水平明显减少,巨噬细胞分泌的IL-10明显降低,而IFN-γ的分泌显著增加。体内实验： IVUS显示,与对照组比较,康士得组及雷帕霉素组的外弹性膜面积（EEMA）、斑块面积（PA）及斑块负荷（PB）明显减少,透射电镜下观察到巨噬细胞中自噬体增加,组织免疫荧光法示LC3-II明显增加,HE染色显示斑块纤维帽的厚度明显增加,内、中膜厚度显著减低,组织免疫组化染色显示巨噬细胞RAM-11及p-mTOR染色显著减少。结论：选择性抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路能诱导巨噬细胞自噬,减少斑块巨噬细胞的浸润, 抑制炎症反应进而稳定动脉粥样硬化易损斑块。     

红景天苷抑制PI3K/Akt/mTOR通路诱导人结直肠癌细胞凋亡和自噬

目的:通过观察红景天苷对人结直肠癌(CRC)HT29细胞体外生长的作用初步探讨其诱导凋亡、自噬的可能机制.方法:不同浓度红景天苷(0.5、1.0、2.0 mmol/L)处理HT29细胞后,MTT法检测细胞增殖情况;赫斯特染色检测HT29细胞凋亡;免疫荧光染色观察HT29细胞LC3荧光强度变化;吖啶橙染色观察HT29细胞...     

Akt抑制剂perifosine抑制胃癌细胞增殖并诱导凋亡的实验研究

目的: 探讨新的Akt抑制剂perifosine对胃癌细胞增殖与凋亡的影响。方法: 采用MTT法检测perifosine对胃癌细胞SGC-7901细胞增殖的影响;流式细胞术分析细胞周期变化;AnnexinⅤ-FITC试剂盒检测细胞凋亡;免疫印迹法检测蛋白表达水平。结果: Perifosine能够抑制SGC-7901细胞的增殖,且抑制作用呈时间和剂量依赖性。胃癌细胞经perifosine处理后,细胞阻滞于G₂期,p21表达水平增加,而cyclin B1的表达受到抑制;凋亡诱导现象随着perifosine剂量的增加而增强。免疫印迹结果显示perifosine活化SGC-7901细胞内caspase-3﹑caspase-9及其底物多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP),促进凋亡诱导蛋白Bax的表达,并抑制Bcl-2的表达。结论: Perifosine对人胃癌细胞SGC-7901的生长具有显著的抑制作用,其凋亡诱导活性与调节caspase家族和Bcl-2家族蛋白的表达密切相关。     

CTHRC1 facilitates bladder cancer cell proliferation and invasion through regulating the PI3K/Akt signaling pathway

IntroductionEmerging evidence has illustrated that Collagen triple helix repeat containing 1 (CTHRC1) is crucial for tumorigenesis and development. However, the effects of CTHRC1 on bladder cancer progression remain largely unclear. Here, we aim to investigate the function and mechanism of CTHRC1 in behaviors of bladder cancer cells in vitro and in vivo.Material and methodsInterference assays were applied to determine the biological functions of CTHRC1. The expression of CTHRC1 was examined by quantitative real time-PCR (qRT-PCR), Western blot and immunohistochemical (IHC) analysis. Effects of CTHRC1 on proliferation, migration and invasion were evaluated by CCK-8, colony formation, flow cytometry, EdU staining, wound healing, transwell and western blot assays. Bladder cancer cells transfected with sh-CTHRC1 were injected into nude mice to explore the effect of CTHRC1 on tumorigenesis in vivo.ResultsCTHRC1 expression was increased in bladder cancer tissues and cell lines compared with normal controls, and associated with advanced clinical stage and lymph node metastasis. Also, patients with high levels of CTHRC1 expression were found to have a poor prognosis. Knockdown of CTHRC1 alleviated bladder cancer cell proliferation, migration and invasion in vitro and impeded tumorigenesis in vivo. Moreover, mechanistic investigation indicated that CTHRC1 could regulate the PI3K/Akt signaling pathway.ConclusionsOur data demonstrated that CTHRC1 played an oncogenic role in bladder cancer by modulating the PI3K/Akt signaling pathway, which sheds novel light on diagnosis and treatment of bladder cancer.     

ROCK通过抑制PI3K/Akt通路促进高糖诱导的心肌细胞凋亡

目的:探讨Rho相关卷曲螺旋激酶(ROCK)是否通过调控PI3K/Akt信号通路参与高糖诱导的原代心肌细胞凋亡。方法:培养原代Wistar乳鼠心肌细胞,用α-横纹肌肌动蛋白(α-SCA)免疫组化法进行鉴定;建立心肌细胞高糖模型,采用5.5、33和40 mmol/L葡萄糖作用于细胞48 h。采用MTT法检测细胞活力;RT-qPCR检测各组心肌细胞中ROCK1和ROCK2的表达水平;流式细胞术检测各组心肌细胞的凋亡水平;Western blot检测ROCK1、ROCK2、cleaved caspase-3、Bcl-2、PI3K、Akt和p-Akt的蛋白水平;为了证实ROCKs对PI3K/Akt信号通路的调控作用,将细胞分为对照组(5.5 mmol/L葡萄糖处理细胞)、高糖组(33 mmol/L葡萄糖处理细胞)和高糖加Y27632(ROCK抑制剂)组,Western blot检测ROCK1、ROCK2、PI3K、Akt和p-Akt的蛋白水平。结果:高糖培养48 h后,33和40 mmol/L葡萄糖组细胞相对活力分别为(79.71±2.43)%和(68.41±7.49)%,与对照组相比显著降低...     

S100A6通过PI3K/Akt信号通路促进人骨肉瘤细胞143B增殖和迁移

 目的：研究PI3K/Akt信号通路在S100A6介导的人骨肉瘤细胞143B的增殖和迁移中的作用。方法：首先制备重组的人S100A6蛋白（recombinant human S100A6, rhS100A6）;rhS100A6与PI3K抑制剂（LY294002和wortmannin）单独或同时处理143B细胞,其中rhS100A6的终浓度为30 mg/L,LY294002和wortmannin的终浓度分别为10 μmol/L和05 μmol/L;采用Western blotting分析143B细胞中PI3K/Akt信号通路相关分子总Akt（total Akt, t-Akt）及磷酸化Akt（phosphorylation of Akt, p-Akt）蛋白的表达变化,MTT检测细胞增殖,Transwell检测细胞迁移。 结果：（1）成功制备rhS100A6蛋白,rhS100A6显著增强143B细胞的增殖和迁移能力（P<005）;（2）rhS100A6上调143B细胞中Akt的磷酸化;（3）与rhS100A6组相比,rhS100A6与LY294002或wortmannin联合处理组143B细胞的p-Akt减少（P<005）,细胞的增殖和迁移能力降低,在不同时点细胞的增殖率下降103%～697%,细胞迁移率下降379%～416%,差异均有统计学意义（P<005）。 结论：S100A6促进人骨肉瘤细胞143B增殖和迁移的作用至少部分是通过激活PI3K/Akt信号通路实现的。