咪达唑仑减轻氧糖剥夺/复糖复氧诱导的小鼠神经元损伤

目的 探讨咪达唑仑对氧糖剥夺(OGD)/复糖复氧(R)诱导的小鼠神经元细胞系HT22损伤的影响。方法 用OGD/R诱导建立神经元细胞HT22损伤模型,将HT22细胞分为OGD/R组、咪达唑仑低、中和高剂量组、咪达唑仑高剂量+KG-501(CREB抑制剂)组,另设常规培养HT22细胞为对照组。ELISA检测TNF-α、IL-6水平;商品化试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA);MTT和Edu实验检测细胞增殖;流式细胞术测量细胞凋亡率;RT-qPCR检测CREB mRNA和PGC-1α mRNA表达水平;Western blot检测Ki-67、Bcl-2、Bax、CREB、PGC-1α蛋白表达水平。结果 与对照组相比,OGD/R组细胞A₄₉₀值(24、48 h),增殖率、SOD、CAT活性、CREB mRNA和PGC-1α mRNA表达水平、Ki-67、Bcl-2、CREB、PGC-1α蛋白表达水平显著降低(P<0.05),细胞凋亡率、TNF-α、IL-6、MDA、Bax蛋白表达显著升高(P<0.05)。与OGD/R组相...     

硫化氢对氧糖剥夺/复氧神经元细胞自噬和凋亡的作用研究

目的　探讨外源性硫化氢（H2S）对氧糖剥夺／复氧（OGD/R）诱导的神经元细胞自噬和损伤的影响,明确H2S减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的分子机制。 方法　以大鼠神经元PC12细胞为研究对象,采用经典的OGD/R诱导细胞损伤,硫氢化钠（NaHS）作为H2S的供体预处理后观察H2S对OGD/R诱导的细胞自噬抑制蛋白mTOR、AMPK及其磷酸化AMPK的影响。为明确AMPK在H2S调节PC12细胞自噬中的作用,采用AMPK过表达质粒进行干预,并观察其对H2S减轻PC12细胞损伤的影响。 结果　OGD/R处理的PC12细胞mTOR磷酸化水平降低、AMPK活性增强,NaHS预处理可部分逆转上述改变。而AMPK过表达后,可消除NaHS对OGD/R诱导的自噬和细胞凋亡的抑制作用。 结论　H2S可通过抑制AMPK活化,进而抑制缺血再灌注时大脑神经元过度的自噬和凋亡,最终减轻神经元损伤。     

羟基红花黄色素 A 对糖氧剥夺/复糖复氧后星形胶质细胞保护作用及其机制研究

目的:探讨糖氧剥夺/复糖复氧(OGD/R)状态下羟基红花黄色素A(HSYA)对星形胶质细胞(Ast)的保护作用及其机制。方法:分离小鼠原代Ast,实验设置为正常对照组、模型组和HSYA处理组。MTT、LDH检测Ast活力;免疫荧光检测GFAP蛋白表达;RT-PCR和Western blot检测C3、S100A10、PTX3极化指标;RT-PCR和ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10炎症因子表达;氧化检测试剂盒检测CAT、SOD、GSH-Px、RNS、ROS、MDA含量;Western blot检测GFAP、p-NF-κB(p65)、p-STAT3、Nrf2、HO-1蛋白表达。结果:Ast经OGD/R处理后被激活且形态发生改变;同时A1型Ast增加,TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子及RNS、ROS、MDA表达升高;A2型Ast降低,CAT、SOD、GSH-Px降低。HSYA可减轻OGD/R状态下Ast的形态异常,减少A1型Ast,同时减少炎症因子分泌以及RNS、ROS和MDA含量,降低p-NF-κB(p65)和p-STAT3表达;增加IL-10分泌和CA...     

硫化氢对氧糖剥夺/复氧诱导小鼠脑皮层神经元损伤的体外观察

目的 探讨硫化氢（H₂S）对氧糖剥夺/复氧（OGD/R）诱导神经元损伤的影响。方法 小鼠皮层神经元用无糖厄尔氏平衡盐溶液（EBSS）于2% O₂、5% CO₂、93% N₂ 37℃培养4h,换用neurobasal + B27培养基于37℃ 5%CO₂培养箱中继续培养12h,建立OGD/R模型。以硫氢化钠(NaHS)作为H₂S的供体,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞存活率;用fura-2/AM和显微荧光成像系统检测神经元胞质钙离子浓度（［Ca ²⁺ ］i）;利用比色法检测乳酸脱氢酶（LDH）释放率;碘化丙啶（PI）染色检测细胞损伤。 结果 200、300与600 μmol/L NaHS预处理30min再OGD/R,神经元存活率显著提高（n=4）;300 μmol/L NaHS预处理后再OGD/R,［Ca ²⁺］i（n=5）、LDH释放率（n=4）和细胞损伤率（n=6）均低于OGD/R组,且使用10 μmol/L钙螯合剂BAPTA也降低OGD/R诱导的LDH释放率和细胞损伤率。 结论 H₂S减轻OGD/R所致皮层神经元损伤,其机制与H₂S抑制OGD/R诱导神经元钙超载有关。     

白藜芦醇预处理对大鼠皮质神经元氧糖剥夺/再复氧损伤后神经元突起生长的影响

目的探讨白藜芦醇预处理对大鼠皮质神经元氧糖剥夺/再复氧损伤后神经元突起生长的影响。方法体外皮质神经元氧糖剥夺150min,复氧培养24 h。实验分为正常组、对照组和5μmol/L白藜芦醇预处理组。免疫荧光法鉴定神经元,细胞计数试剂盒8(CCK-8)法测定细胞活力,TUNEL法检测细胞凋亡,免疫荧光法和Western blotting检测微管相关蛋白2(MAP-2)和生长相关蛋白43(GAP-43)的表达,并计数神经元突起的长度和数目。结果培养细胞均高表达神经元特异性标记物MAP-2。白藜芦醇组细胞活力较对照组明显增加(0.551±0.009比0.436±0.013,P0.01),而凋亡则明显降低(18.3%±1.3%比35.3%±1.9%,P0.01),上调MAP-2(0.790±0.102比0.462±0.063,P0.01)和GAP-43(0.768±0.084比0.424±0.065,P0.01)蛋白的表达,增加神经元突起的长度(89.510±6.939比61.538±9.14,P0.01)和数目(6.347±1.002比3.040±0.608,P0.01)。结论白藜芦醇预处理能减轻氧糖剥夺/再复氧对神经元的损伤,促进神经元突起的生长。     

毛蕊异黄酮对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞线粒体凋亡通路的影响

目的 探讨毛蕊异黄酮对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞线粒体凋亡通路的影响。 方法 将PC12细胞随机分为4组：正常组（control）、模型组（model）、毛蕊异黄酮组（calycosin）和尼莫地平组（nimodipine,阳性对照药组）。除control组外,其余各组进行缺氧缺糖2 h,复氧复糖24 h制作模型处理。Calycosin组和nimodipine组在复氧复糖的同时分别给予含有毛蕊异黄酮（0.07 μmol/L）和尼莫地平（5.00 μmol/L）的含药培养基处理。用CCK-8法检测各组细胞活性,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,细胞免疫荧光法检测各组细胞Bax/Bcl-2比值,Western blotting法检测线粒体凋亡通路中关键蛋白细胞色素C（Cyt-C）、凋亡酶激活因子1（Apaf-1）和Caspase-3表达。 结果 与control组相比,model组细胞的活性明显降低（P<0.05）,细胞凋亡率明显升高（P<0.05）,Bax/Bcl-2比值明显升高（P<0.05）,线粒体凋亡通路中关键蛋白Cyt-C、Apaf-1和Caspase-3的表达均明显升高（P<0.05）;与model组相比,calycosin组和nimodipine组的细胞活性均明显提高（P<0.05）,细胞凋亡率明显降低（P<0.05）,Bax/Bcl-2比值明显降低（P<0.05）,线粒体凋亡通路中关键蛋白Cyt-C、Apaf-1和Caspase-3的表达均明显降低（P<0.05）,差异有统计学意义。 结论 毛蕊异黄酮可显著提高缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞活性,抑制细胞凋亡,其作用机制与毛蕊异黄酮抑制线粒体凋亡通路中关键蛋白Cyt-C、Apaf-1和Caspase-3表达密切相关。     

腺苷预处理对氧糖剥夺/复氧糖诱导的星形胶质细胞及脂质运载蛋白-2表达的影响

目的:探讨在氧糖剥夺/复氧糖(OGD/R)情况下腺苷预处理对体外培养星形胶质细胞的影响和脂质运载蛋白-2(LCN-2)表达的影响及其意义。方法:原代培养的大鼠星形胶质细胞随机分为腺苷预处理对照组(Ado-treated control)、对照组(Control)、实验组(ADO/R)和模型组(OGD/R)。用MTT法检测各组细胞活力,ELISA检测各组OGD/R后细胞培养基中乳酸脱氢酶(LDH)的浓度,免疫荧光及免疫印迹检测各组LCN-2的相对表达。结果:腺苷预处理对照组与对照组的细胞活力、LDH浓度和LCN-2的表达量均无明显差别。与腺苷预处理对照组、对照组相比,模型组细胞损伤程度和LCN-2的表达量均明显升高。与模型组相比,实验组细胞损伤程度和LCN-2的表达量均明显降低。结论:腺苷可以通过减少LCN-2的释放明显改善OGD/R所引起的星形胶质细胞的损伤,从而增强脑组织对缺血再灌注损伤的耐受。     

紫草素通过PI3K/Akt通路抑制氧糖剥夺诱导的大鼠原代皮层神经元凋亡

目的:探讨紫草素对氧糖剥夺(OGD)损伤模型中大鼠原代皮层神经元的作用及机制。方法:用不同浓度(0. 02、0. 2、2和20μmol/L)紫草素对大鼠原代皮层神经元经进行预处理,再经OGD损伤处理,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法和荧光素二乙酸酯/碘化丙啶(FDA/PI)双染法分别检测神经元活性和凋亡情况,选择最适紫草素浓度。然后,在加入紫草素之前提前加入LY294002(PI3K/Akt信号通路抑制剂,1μmol/L),用Wesern blot法检测神经元p-Akt(Ser473)水平变化,用LDH法和FDA/PI双染法检测神经元活性和凋亡率变化。结果:0. 2、2及20μmol/L的紫草素可显著提高神经元存活率(P 0. 05),同时还可使神经元内p-Akt(Ser473)水平显著升高(P 0. 05); LY294002可显著阻断紫草素对神经元p-Akt(Ser473)水平和凋亡率的影响(P 0. 05)。结论:紫草素可通过激活PI3K/Akt通路来减少OGD诱导的大鼠原代皮层神经元凋亡。     

沉默beclin1基因对缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞凋亡的影响

目的 探讨beclin1基因对缺氧缺糖/复氧复糖小鼠海马神经元细胞系HT22细胞凋亡的影响。方法 取对数生长期的HT22细胞,随机分为4组：正常组（normal）、缺氧缺糖/复氧复糖（OGD/R）模型组（model）、beclin1基因沉默组（beclin1^-/-）、转染对照组（control）。除normal组外,其余各组细胞均在缺氧缺糖6 h后进行复氧复糖。利用RNAi技术,针对小鼠cDNA序列设计beclin1干扰序列,用脂质体Lipo2000包裹后转染至HT22细胞。于转染48 h后用荧光显微镜观察转染效率,Western blotting检测细胞beclin1 表达情况。各组细胞均于复氧复糖24 h后采用CCK-8法检测细胞活力,乳酸脱氢酶（LDH）法检测细胞损伤情况,免疫荧光染色检测Bax、Bcl-2表达及比值变化,Western blotting检测LC3、P62及Caspase-3表达。SPSS 19.0 统计学软件进行数据分析。结果 与normal组相比,model组细胞活力及P62蛋白表达显著降低（P<0.01）,乳酸脱氢酶（LDH）漏出率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Caspase-3表达及Bax/Bcl-2均显著升高（P<0.01）。与model组相比,beclin1^-/-组细胞活力及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 表达显著降低（P<0.01）,LDH漏出率、Bax/Bcl-2及P62、Caspase-3表达显著升高（P<0.01）;control组与model组比较差异无显著性。结论 沉默beclin1抑制细胞自噬可使缺氧缺糖/复氧复糖处理的HT22细胞损伤加重,细胞凋亡进一步增加。     

黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元JNK3表达的影响

 目的：观察黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元c-jun氨基末端激酶(c-jun N terminal kinase,JNK3)表达的影响。方法：取原代培养8d的大鼠海马神经元,随机分为正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖组(模型组)、黄芪注射液组和溶媒对照组。模型组缺氧缺糖0.5h再复氧复糖,各组于复氧复糖后0、0.5、2、6、24、72和120h用免疫组化法和免疫印迹法检测海马神经元JNK3的表达。结果：除120h之外,模型组JNK3阳性神经元数目和蛋白平均吸光度值在各个时间点均比对照组明显增多(P<0.05);黄芪注射液组JNK3阳性神经元数目和蛋白平均吸光度值均比模型组明显减少(P<0.05)。结论：黄芪注射液可抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元JNK3表达,并因此抑制神经元的凋亡。     

PGC-1α过表达逆转OGD/R诱导的神经元线粒体功能降低和凋亡

目的:探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1α(PGC-1α)基因过表达对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的神经元线粒体功能及细胞凋亡的影响。方法:采用RT-PCR的方法从C57BL/6乳鼠大脑皮层获取PGC-1α的全基因序列,并克隆到真核表达载体p EGFP-N1上,经PCR初步鉴定后转染原代皮层神经元,Western blot鉴定PGC-1α的表达情况,成功构建PGC-1α真核表达载体p EGFP-N1-PGC-1α。分别将转染p EGFP-N1和p EGFP-N1-PGC-1α载体的皮层神经元进行OGD/R处理,分别采用Mito Tracker Red染色、流式细胞术、ATP代谢检测试剂盒和TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测线粒体质量分数、活性氧簇(ROS)和ATP生成、细胞凋亡以及caspase-3激活的变化。结果:PGC-1α过表达可抑制OGD/R诱导的神经元线粒体生成能力的降低和ROS的生成(P0.05),增强ATP的合成能力(P0.01),抑制神经元的凋亡(P0.01)并降低caspase-3的激活(P0.05)。结论:PGC-1α过表达可通过促进线粒体生成、抑制ROS的产生和维护线粒体功能而抑制OGD/R诱导的神经元凋亡。PGC-1α可以作为开发脑缺血再灌注损伤药物的靶标之一。     

远志皂苷元抗H/R诱导皮层神经元凋亡的机制初探

 目的：初步探讨远志皂苷元（senegenin, Sen）对抗缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation, H/R）诱导大鼠原代皮层神经元凋亡的作用及机制。方法：提取原代大脑皮层神经元,培养至第6 d,进行相应的实验处理,分为正常对照组（control组）、模型组(H/R组)、Sen保护处理组（Sen+H/R组）和Sen处理组（Sen组）。流式细胞术检测各组凋亡率。采用Western blotting检测JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、Bcl-2和Bax的表达变化。结果：H/R组与control组比较,细胞凋亡率显著升高（P<0.05）;而H/R+Sen组细胞凋亡率显著低于H/R组（P<0.05）,提示Sen可对抗H/R诱导的皮层神经元凋亡,模型构建成功;Western blotting结果显示Sen可显著增强H/R模型中JNK和c-Jun蛋白表达,抑制其磷酸化（P<0.05）,上调Bcl-2蛋白表达并抑制Bax蛋白表达（P<0.05）。结论：Sen抗H/R诱导神经细胞凋亡,发挥保护作用的可能机制是通过上调JNK和c-Jun蛋白表达,并抑制其磷酸化,进而上调Bcl-2表达并抑制Bax表达等来实现的。     

Bcl-2抑制剂对黄芪注射液降低缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元caspase-3表达的影响

目的:观察Bcl-2抑制剂对黄芪注射液降低缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元caspase-3表达的影响。方法:取体外原代培养8 d的海马神经元,随机分为6组:正常对照组、模型组(缺氧缺糖/复氧复糖组)、黄芪注射液组、黄芪注射液溶剂(无菌去离子水)对照组、Bcl-2抑制剂组和Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组。除正常对照组外均进行缺氧缺糖0.5 h再复氧复糖,各组均于复氧复糖后24 h进行指标检测:采用细胞免疫化学染色法观察细胞形态和caspase-3阳性细胞率,Western blotting法检测海马神经元Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白的表达,RTPCR法检测海马神经元caspase-3 mRNA的表达。结果:与正常对照组相比,模型组细胞caspase-3阳性率、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白及caspase-3 mRNA表达均明显增强(P0.05);与模型组相比,黄芪注射液组Bcl-2表达明显增加,细胞caspase-3阳性率、cleaved caspase-3蛋白及caspase-3 mRNA表达均明显降低(P0.05);而黄芪注射液溶剂对照组、Bcl-2抑制剂组及Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组则无明显差异;黄芪注射液溶剂对照组Bcl-2表达较正常对照组无明显变化,而Bcl-2抑制剂组及Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组显著下降(P0.05)。结论:Bcl-2抑制剂可对抗黄芪注射液降低缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元caspase-3表达的作用,黄芪注射液通过Bcl-2发挥对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡的抑制作用。     

氧葡萄糖剥夺-再恢复后抑制小胶质细胞TLR9激活对神经元的保护作用

目的:观察氧葡萄糖剥夺-再恢复(OGDR)后小胶质细胞BV-2 Toll样受体9(TLR9)激活对神经元凋亡的影响。方法:对BV-2细胞或TLR9-siRNA转染的BV-2细胞进行OGDR处理4 h后,将细胞上清添加至OGDR处理4 h的小鼠原代皮层神经元中,继续正常培养24 h后,倒置显微镜下观察神经元形态变化,TUNEL染色检测神经元凋亡,Western blotting检测神经元caspase-3蛋白的表达。实验分为正常BV-2组、negative control-siRNA组、TLR9-siRNA组、OGDR组、OGDR+NC-siRNA组、OGDR+TLR9-siRNA组和对照组(神经元OGDR后不添加BV-2细胞上清)。结果:OGDR后神经元胞体肿胀,折光性下降,出现空泡样变,轴突变细、扭曲、断裂。TUNEL染色各组均可见绿染凋亡小体。与对照组比较,其它组的caspase-3蛋白表达升高(P0.05);与正常BV-2组比较,OGDR组和TLR9-siRNA组的caspase-3蛋白表达升高(P0.05);OGDR+TLR9-siRNA转染组与TLR9-siRNA转染组和OGDR组比较,caspase-3蛋白表达下降(P0.05)。结论:OGDR后BV-2细胞TLR9激活致神经元凋亡增多,caspase-3蛋白表达升高;抑制TLR9表达后,神经元损伤减轻。     

缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞自噬的形态学变化与细胞凋亡的关系

目的:观察缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞自噬的形态学变化及其与细胞凋亡的关系,探讨自噬对PC12细胞的保护作用。方法:取对数生长期的PC12细胞,随机分为正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖组、自噬抑制剂组和自噬激活剂组。其中缺氧缺糖/复氧复糖组、自噬抑制剂组和自噬激活剂组进行缺氧缺糖3 h后再复氧复糖12 h,自噬抑制剂组和自噬激活剂组于复氧复糖的同时分别给予自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤和自噬激活剂雷帕霉素。用透射电子显微镜和单丹磺酰尸胺荧光染色检测自噬小体的变化,Annexin V-FITC/PI流式细胞术和TUNEL染色检测细胞凋亡的情况。结果:与正常对照组相比,缺氧缺糖/复氧复糖组的自噬小体增多(P0.05),细胞凋亡率和凋亡指数升高(P0.05)。与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,自噬抑制剂组的自噬小体明显减少(P0.05),细胞凋亡率和凋亡指数显著升高(P0.05),而自噬激活剂组自噬小体变大,数量明显增多(P0.05),并偶见自噬溶酶体,细胞凋亡率和凋亡指数显著下降(P0.05)。结论:缺氧缺糖/复氧复糖可以诱导PC12细胞发生自噬,且细胞自噬可以抑制细胞凋亡,发挥神经保护作用。     

Effect of transitory glucose deprivation on mitochondrial structure and functions in cultured cerebellar granule neurons

We found that 60-min glucose deprivation leads to progressive decrease in the mitochondrial membrane potential and increase in [Ca²⁺]_i in cultured cerebellar granule neurons. The latter effect was fully reversible, returning to the basal level 60 min after restoration of normal glucose level in the incubation medium, whereas mitochondrial membrane potential remained at 10.0 ± 1.8% below the initial value. Electron microscopy indicated that glucose deprivation induced appearance of mitochondria with local lightening of the matrix and destruction of cristae. This mitochondrial conformation was preserved during the restoration phase after glucose level in the cultivation medium returned to the normal level. Neuronal death within a 24-h period after 60-min glucose deprivation was relatively small, being 14.0 ± 4.4%.     

VX-induced cell death involves activation of caspase-3 in cultured rat cortical neurons

Exposure of cell cultures to organophosphorous compounds such as VX can result in cell death. However, it is not clear whether VX-induced cell death is necrotic or involves programmed cell death mechanisms. Activation of caspases, a family of cysteine proteases, is often involved in cell death, and in particular, caspase-3 activation appears to be a key event in programmed cell death processes including apoptosis. In this study, we investigated VX-induced neuronal cell death, as well as the underlying mechanism in terms of its effect on caspase-3 activity. Primary cortical neuronal cultures were prepared from gestational days 17 to 19 Sprague Dawley rat fetuses. At maturation, the cells were treated with varying concentrations of VX and cell death was evaluated by lactate dehydrogenase (LDH) release. VX induced an increase in LDH release in a concentration-dependent manner. Morphological VX-induced cell death was also characterized by using nuclear staining with propidium iodide and Hoechst 33342. VX induced a concentration- and time-dependent increase in caspase-3 activation. Caspase-3 activation was also confirmed by the proteolytic cleavage of poly(ADP-ribose)polymerase (PARP), an endogenous caspase-3 substrate. These data suggested that in rat cortical neurons, VX-induced cell death via a programmed cell death pathway that involves changes in caspase-3 protease.