原花青素单一活性成分B2对高糖作用下人内皮祖细胞的保护作用

目的:研究原花青素单一活性成分B2(PC-B2)对高糖环境下人内皮祖细胞(EPCs)的保护作用及其作用机制。方法:从健康人外周血中分离诱导培养人EPCs,并进行鉴定。将EPCs分为control组(PBS处理)、高渗对照组(25 mmol/L甘露醇处理)、高浓度30 mmol/L葡萄糖作用组以及不同浓度(2、10和50 mg/L)PC-B2与30 mmol/L葡萄糖共处理组。使用CCK-8法检测各组中EPCs活力的变化;同时检测各组EPCs中乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)水平;ELISA方法检测各组EPCs上清中一氧化氮(NO)、内皮素-1(ET-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)的含量变化;流式细胞术检测各组中EPCs活性氧簇(ROS)生成和凋亡率变化;Western blot检测血管内皮生长因子(VEGF)和血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)的表达情况。结果:与control组相比,高糖作用组中人EPCs的活力显著下降(P0.05);LDH漏出量以及MDA、ET-1、ICAM-1和VCAM-1含量均显著升高(P0.05);而SOD和GSH活性以及NO含量显著降低(P0.05);细胞中ROS含量和凋亡率显著上升(P0.05);EPCs中VEGF和VEGFR-2表达量显著降低(P0.05)。与高糖作用组相比,不同浓度PC-B2作用组EPCs活力均明显回升(P0.05);LDH漏出量以及MDA、ET-1、ICAM-1和VCAM-1含量均逐渐下降(P0.05);SOD和GSH活性以及NO含量均显著上升(P0.05);细胞中ROS生成和凋亡率逐渐下降(P0.05);而EPCs中VEGF和VEGFR-2表达量也随之逐渐上升,并具有浓度依赖性(P0.05)。结论:PC-B2能够提升高糖作用下人EPCs活力,减少高糖引起的氧化损伤,恢复EPCs正常功能,降低高糖诱导的炎症因子和细胞凋亡,从而对人EPCs发挥保护作用,并可通过诱导VEGFR-2和VEGF表达发挥作用。     

脑源性神经营养因子保护H_2O_2诱导的氧化损伤血管内皮细胞

目的:研究脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)对过氧化氢(H2O2)诱导的氧化损伤血管内皮细胞的保护作用及其作用机制。方法:离体培养人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),建立H2O2致HUVECs氧化损伤模型后,利用不同浓度(1、10和100μg/L)BDNF处理HUVECs,同时设置未损伤对照组、H2O2损伤后PBS处理组和Trk B inhibitor组(同时加入100μg/L BDNF和1∶1 000的Trk B inhibitor)。利用MTT方法检测各组细胞存活率;同时测定各组细胞中乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)水平变化;ELISA方法检测各组细胞分泌一氧化氮(NO)、内皮素1(ET-1)及细胞间黏附分子1(ICAM-1)的浓度变化;流式细胞术检测各组细胞中活性氧簇(ROS)含量及细胞凋亡的变化;Western blot检测各组细胞中Trk B、p-Trk B、cleaved caspase-3、Bcl-2及Bax的蛋白水平。结果:与未损伤组相比,经H2O2氧化损伤后,PBS处理组的HUVECs存活率显著下降,LDH和MDA含量显著上升而SOD和GSH的活性显著下降,细胞中NO分泌功能显著降低而ET-1和ICAM-1的分泌浓度则显著增加,ROS的含量和细胞凋亡率均显著上升,cleaved caspase-3和Bax的蛋白水平显著上升,Bcl-2蛋白表达则显著下降;与PBS处理组相比,不同浓度BDNF处理组中HUVECs的存活率逐渐上升,LDH和MDA含量逐渐下降,而SOD和GSH活性逐渐上升,细胞中的NO分泌量显著上升而ET-1和ICAM-1分泌量逐渐下降;ROS含量和细胞凋亡率则逐渐下降,Trk B和p-Trk B水平均显著上升,cleaved caspase-3和Bax的蛋白水平逐渐下降而Bcl-2蛋白表达逐渐上升,但BDNF的作用均受到Trk B inhibitor的抑制。结论:BDNF能够通过提高HUVECs细胞存活率,增强细胞抗氧化损伤能力,降低ROS产生和细胞凋亡率而保护氧化损伤的血管内皮细胞,并通过其与Trk B结合后激活BDNF-Trk B信号通路发挥作用。     

肌肽对高糖诱导的大鼠H9C2心肌细胞损伤的保护作用及其机制

目的 研究肌肽对高糖诱导受损的大鼠心肌细胞（H9C2）的保护作用及其机制。 方法 用含50 mmol/L葡萄糖的高糖培养液建立高糖损伤模型,实验观察组给予5、15 mmol/L肌肽进行保护。MTT检测各组H9C2心肌细胞活力;ELISA测定培养液中IL-1β、IL-6和TNF-α炎症因子浓度含量;试剂盒检测细胞中SOD、MDA、AST和LDH活性;二氢乙锭测定细胞中活性氧含量;免疫印迹测定细胞中bax、bcl-2、p65和IκB-α的蛋白表达。 结果 肌肽预处理组细胞内活性氧含量下降,SOD活性升高,AST和LDH活性减弱,MDA含量降低;其培养液中炎症因子含量明显降低,细胞核中p65蛋白水平降低,胞浆中IκB-α蛋白水平升高,bax和bax/bcl-2比值降低。 结论 肌肽能够减轻高糖诱导的H9C2心肌细胞损伤,降低细胞炎症反应,其机制可能与ROS/NF-κB信号通路有关。     

硫化氢通过抑制氧化应激改善高糖诱导的内皮细胞衰老

目的:探讨外源性硫化氢对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)衰老的作用及机制。方法:建立高糖(33 mmol/L葡萄糖)诱导的HUVECs早熟型衰老模型,观察硫化氢对衰老的作用及其相关的分子机制。结果:HUVECs经高糖处理后,细胞生长缓慢,衰老相关β半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal)阳性细胞数目增加,血浆纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)表达明显增高,超氧化物歧化酶1(SOD1)显著减少,丙二醛(MDA)产量明显增多,核因子κB p65(NF-κB p65)活性增加;与模型组比较,100μmol/L和200μmol/L硫氢化钠(硫化氢供体)处理组的细胞数目明显增加,SA-β-Gal染色阳性细胞数目及PAI-1蛋白表达显著下降,SOD1表达明显增加,MDA产量明显减少,NF-κB p65活性降低。结论:硫化氢能通过抑制氧化应激反应和NF-κB p65活性而抵抗高糖诱导的HUVECs衰老。     

高糖通过激活活性氧介导的NF-κB信号通路诱导HK-2人肾小管上皮细胞转分化

目的基于活性氧/核因子κB(ROS/NF-κB)信号通路探讨高糖诱导的人肾小管上皮细胞转分化机制。方法 HK-2正常人近端肾小管上皮细胞随机分为空白对照组、渗透压对照组、高糖组、吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)组。用相差显微镜观察细胞形态、噻唑蓝(MTT)法检测细胞活性,流式细胞术检测细胞内ROS含量, ELISA检测丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性; Western blot法检测细胞NF-κBp65、磷酸化的NF-κB抑制蛋白α(p-IκBα)和IκB激酶α(IKKα)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和细胞间黏附分子1(ICAM-1)的蛋白水平;免疫细胞化学法检测细胞NF-κBp65、上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达。结果高糖组细胞变成长梭形或不规则形,边缘可呈现放射状,细胞间隙变大,折光度下降,排列不整齐。同时细胞活性随处理时间的延长不断下降, PDTC组细胞活性较高糖组高。与空白对照组相比,高糖组ROS及MDA含量增加、 SOD活性下降, PDTC组ROS及MDA含量较高糖组减少、 SOD活性较高糖组增强。与空白组比较,高糖组NF-κBp65、 p-IκBα、 IKKα、 MCP-1、 ICAM-1蛋白水平增加;与高糖组比较PDTC组以上蛋白水平降低。与空白组比较,高糖组NF-κBp65及α-SMA的阳性细胞所占比率升高、 E-cadherin的阳性细胞所占比率降低;与高糖组比较, PDTC组NF-κBp65及α-SMA的阳性细胞所占比率降低、 E-cadherin的阳性细胞比率升高。结论高糖可以诱导HK-2细胞发生上皮间质转化, ROS介导的NF-κB信号通路的激活参与以上进程, PDTC可阻断该过程。     

Vaspin对HUVECs中TNF-α介导的NF-κB和PI3K/Akt信号通路的影响

目的探讨Vaspin对TNF-α介导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)NF-κB和PI3K/Akt信号通路的影响。方法体外分离并培养HUVECs。NF-κB荧光酶报告质粒瞬时转染HUVECs,用不同浓度(0~320μg/L)Vaspin预培养,随后用10μg/L的TNF-α作用于HUVECs,荧光酶报告分析法测定NF-κB的转录活性。Western blot测定磷酸化的Akt水平。ELISA测定细胞上清液中IL-1及IL-6的浓度。Real-time PCR、Western blot检测细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的mRNA和蛋白表达水平。结果在HUVECs中,Vaspin抑制TNF-α介导的NF-κB转录活性(P0.05),并且NF-κB下游因子IL-1、IL-6、ICAM-1、VCAM-1和MCP-1的表达降低(P0.05)。Vaspin增加了炎性因子TNF-α介导的磷酸化的Akt水平(P0.05)。结论 Vaspin抑制HUVECs中TNF-α介导的NF-κB信号通路,增强TNF-α介导的PI3K/Akt信号通路的传导。     

Trx-1过表达通过NF-κB信号通路减轻MPP~+所致PC12细胞的氧化应激损伤

目的:探讨硫氧还蛋白1(Trx-1)过表达通过NF-κB信号通路减轻1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP~+)诱导的大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞氧化应激损伤的作用,探讨帕金森病的发病机制。方法:采用1、3和5 mmol/L MPP~+损伤PC12细胞,MTT法检测细胞活力,商用试剂盒检测细胞上清液中氧化应激指标乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量,Western blot检测细胞中Trx-1蛋白的表达。以3 mmol/L MPP~+损伤PC12细胞,以含Ad-Trx-1-GFP序列的慢病毒感染建立Trx-1过表达的帕金森病细胞模型,采用MTT法、商用试剂盒和Western blot分别检测Trx-1过表达对PC12细胞活力、氧化应激反应和NF-κB信号通路的影响。给予NF-κB信号通路激活剂佛波酯(PMA)作用于经MMP~+处理的P12细胞,观察激活NF-κB信号通路对PC12细胞活力和氧化应激反应的影响;给予NF-κB信号通路抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)作用于Trx-1过表达的MPP~+损伤PC12细胞,观察Trx-1过表达通过NF-κB信号通路对PC12细胞活力和氧化应激反应的影响。结果:1、3和5 mmol/L MPP~+能够明显降低PC12细胞活力、细胞上清液中SOD活性和细胞内Trx-1蛋白的表达,升高细胞上清液中LDH活性和MDA含量,且3 mmol/L MPP~+和5 mmol/L MPP~+的作用明显大于1 mmol/L MPP~+(P0.05),而3 mmol/L MPP~+和5 mmol/L MPP~+间的差异无统计学显著性。Trx-1过表达能够明显减弱MPP~+对PC12细胞活力的抑制作用及其诱导的氧化应激损伤和NF-κB信号通路活化。NF-κB信号通路的激活促进了MPP~+对PC12细胞活力的抑制作用及其诱导的氧化应激损伤,而抑制NF-κB信号通路则增强了Trx-1过表达对MPP~+损伤的PC12细胞的保护作用。结论:Trx-1过表达可通过NF-κB信号通路减轻MPP~+作用下PC12细胞的氧化应激损伤。     

褪黑素协同丙戊酸钠减轻糖氧剥夺诱导的小鼠神经元损伤

目的:研究褪黑素(Mel)和丙戊酸(VPA)处理对糖氧剥夺(OGD)诱导的神经元损伤的保护作用及分子机制。方法:利用小鼠海马神经元来源的细胞系HT22细胞制备OGD细胞模型,分别给予不同浓度的Mel和VPA处理,利用CCK-8试剂盒检测细胞活性,乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒商品化试剂盒检测细胞培养上清中LDH的活性,Western Blot检测各组细胞中NF-κB/RelA(Lys310)乙酰化水平。结果:Mel在10 mmol/L浓度下,与VPA(10 mmol/L)联合使用时,能对神经产生保护作用。Mel和VPA联合处理降低了OGD暴露HT22细胞NF-κB/RelA(Lys310)乙酰化。结论:Mel和VPA通过降低NF-κB/RelA(Lys310)乙酰化发挥神经保护作用。     

核转录因子κB抑制剂PDTC对高糖培养大鼠肾成纤维细胞VEGF和PEDF表达的影响

目的:探讨核转录因子κB(NF-κB)抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)对高糖培养大鼠肾成纤维细胞(NRK)血管内皮生长因子(VEGF)及色素上皮衍生因子(PEDF)表达的影响。方法:NRK按培养条件分为常糖组:5.6mmol/L葡萄糖;高糖A组:15mmol/L葡萄糖;高糖B组:30mmol/L葡萄糖;PDTC对照组:5.6mmol/L葡萄糖+5.0μmol/LPDTC;PDTCA组:15mmol/L葡萄糖+10μmol/LPDTC;PDTCB组:30mmol/L葡萄糖+20μmmol/LPT-DC。采用半定量RT-PCR方法及ELISA测定各组培养24h、48h后NRK的VEGF及PEDFmRNA及蛋白的表达。结果:与常糖组相比,高糖各组NRK的VEGF蛋白含量及mRNA表达明显升高(P<0.01,P<0.05);与高糖B组相比,PDTC干预各组NRK的VEGF蛋白含量及mRNA表达呈下降趋势(P<0.01,P<0.05)。与常糖组相比,高糖各组NRK的PEDF蛋白含量及mRNA表达明显下降(P<0.01,P<0.05);与高糖B组相比,PDTCB组NRK的PEDF蛋白含量及mRNA表达明显升高(P<0.01)。结论:PDTC能明显抑制高糖培养大鼠NRK的VEGF表达并明显上调PEDF的表达,间接提示NF-κB可能通过参与VEGF和PEDF的表达失衡导致糖尿病肾病(DN)的发生。     

miR-122低表达对糖尿病肾病足细胞损伤和IKK/NF-κB信号通路的抑制作用研究

目的:探究微小RNA-122(miR-122)低表达对糖尿病肾病(DN)足细胞炎性因子水平、增殖、凋亡、迁移和IκB激酶(IKK)/核因子κB(NF-κB)信号通路的影响。方法:体外培养人肾小球足细胞HGPC,取对数生长期细胞，分为正常糖组(5mmol/L D-葡萄糖)、高糖组(30mmol/L D-葡萄糖)、inhibitor NC组(转染inhibitor NC片段至细胞，后加入30mmol/L D-葡萄糖)、miR-122 inhibitor组(转染miR-122 inhibitor片段至细胞，后加入30mmol/L D-葡萄糖),每组设置3个重复。24h后，实时荧光定量PCR(qPCR)测定各组细胞中miR-122表达水平，酶联免疫法(ELISA)测定细胞上清液中白介素(IL)-6、IL-1β及IL-10水平，细胞计数试剂盒8(CCK-8)法、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)法、Hoechst 33258染色法及划痕法分别测定细胞活力、增殖率、凋亡率及迁移率，蛋白免疫印迹法(WB)测定细胞中IKKα、IκBα、磷酸化(p-)IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB ...     

同型半胱氨酸硫内酯损伤血管内皮细胞的机制研究

目的: 在体外培养的内皮细胞中探讨同型半胱氨酸硫内酯(HTL)致血管内皮细胞损伤作用及其机制。方法: 体外培养的人脐静脉内皮细胞,与不同浓度的HTL孵育,用ELISA检测内皮细胞中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和可溶性细胞间黏附分子(sICAM)-1的浓度,荧光显微镜检测活性氧簇(ROS)的含量、核转录因子κB(NF-κB)的激活及IκBα蛋白表达,同时检测内皮细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)漏出量与一氧化氮(NO)水平。结果: HTL(1 mmol/L)孵育内皮细胞3 h后显著增加细胞 ROS含量,刺激NF-κB转入胞核而活化,孵育细胞24 h后明显升高细胞上清液中sICAM-1和TNF-α浓度;降低细胞活力和NO的水平,增加LDH的漏出量。抗氧化剂NAC、NADPH氧化酶抑制剂Apocynin和NF-κB抑制剂PDTC可显著抑制HTL所致ROS含量的增加以及NF-κB激活,降低HTL刺激的培养液中sICAM-1和TNF-α的浓度,增加培养液中NO水平。结论: HTL诱导的血管内皮细胞功能损伤的机制可能与诱导氧化应激以及NF-κB活化有关。     

血管紧张素-(1-7)/Mas受体轴通过调控NF-κB通路保护心肌细胞对抗高糖诱导的损伤

目的:探讨血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]/Mas受体轴能否通过抑制核因子-κB(NF-κB)通路对抗高糖(HG)引起的心肌细胞损伤。方法:应用细胞计数检测试剂盒(CCK-8)检测心肌细胞存活率;双氯荧光素(DCFH-DA)染色荧光显微镜照相法检测胞内活性氧(ROS)水平;Hoechst 33258核染色荧光显微镜照相测定凋亡细胞的形态及数量的变化;JC-1染色法测定线粒体膜电位(MMP);应用免疫蛋白印迹法测定NF-κB p65和cleaved caspase-3蛋白的表达水平。结果:应用35 mmol/L葡萄糖分别处理H9c2心肌细胞30、60、90、120和150 min均能明显增加磷酸化(p)NF-κB p65的水平,其中60 min时,表达水平增加最明显;1μmol/L Ang-(1-7)与HG共同处理心肌细胞60 min能抑制HG对p-NF-κB p65表达的上调作用;0.1~30μmol/L的Ang-(1-7)与HG分别共处理心肌细胞24 h均能抑制HG的细胞毒性,使细胞存活率增多;另一方面,1μmol/L Ang-(1-7)能抑制HG引起的细胞凋亡、氧化应激、线粒体损伤等,使凋亡细胞数量、cleaved caspase-3表达、ROS生成水平及MMP丢失减少;但是10μmol/L Ang-(1-7)/Mas受体拮抗剂A-779能明显阻断上述的Ang-(1-7)的心肌细胞保护作用;与Ang-(1-7)的作用相似,100μmol/L PDTC(NF-κB抑制剂)与HG共处理心肌细胞24 h也能显著抑制上述的HG损伤作用。结论:Ang-(1-7)/Mas受体轴可通过抑制NF-κB通路对抗HG诱导的心肌细胞损伤。     

ATP敏感性钾通道的开放通过抑制TLR4/NF-κB通路对抗高糖引起的H9c2心肌细胞损伤和炎症

目的:探讨开放ATP敏感性钾通道(K_(ATP)通道)能否抑制Toll样受体4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)通路对抗高糖(HG)引起的H9c2心肌细胞损伤和炎症。方法:应用Western blot测定TLR4和NF-κB p65的蛋白水平;应用ELISA法检测细胞培养液中白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平;采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)测定心肌细胞存活率;罗丹明123染色荧光显微镜照相法测定线粒体膜电位(MMP);双氯荧光素染色荧光显微镜照相法测定细胞内活性氧簇(ROS)水平;Hoechst 33258核染色荧光显微镜照相法检测凋亡细胞数量。结果:H9c2心肌细胞经HG(35 mmol/L葡萄糖)处理24 h,胞内TLR4和磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)的蛋白水平明显增加,100μmol/L K_(ATP)通道开放剂二氮嗪(DZ)预处理30 min可抑制HG对TLR4和p-NF-κB p65蛋白水平的上调作用;此外,30μmol/L TAK-242(TLR4抑制剂)和HG共处理心肌细胞24 h也可减轻HG对p-NF-κB p65的上调作用。另一方面,100μmol/L DZ预处理有明确的心肌保护作用,可抑制HG引起的细胞毒性、炎症反应、线粒体损伤、氧化应激和细胞凋亡,使细胞存活率升高,并减少IL-1β和TNF-α分泌水平、MMP丢失、ROS生成及凋亡细胞数量;而30μmol/L TAK-242或100μmol/L PDTC(NF-κB抑制剂)共处理心肌细胞24 h也可发挥和DZ相类似的作用,能抑制HG引起的上述损伤和炎症反应。结论:开放K_(ATP)通道可通过抑制TLR4/NF-κB通路对抗HG引起的H9c2肌细胞损伤和炎症。     

紫草素对高糖诱导的血管内皮细胞凋亡和氧化应激的影响

目的:探讨紫草素(shikonin)对高浓度葡萄糖诱导的血管内皮细胞凋亡和氧化应激水平的影响及其可能的作用机制。方法:体外培养的大鼠胸主动脉内皮细胞随机分为5组:正常对照组(培养基中葡萄糖浓度为5.5 mmol/L)、高糖组(培养基中葡萄糖浓度为33 mmol/L)、高糖+低浓度紫草素组(培养基中葡萄糖浓度为33mmol/L,紫草素浓度为0.1μmol/L)、高糖+中浓度紫草素组(培养基中葡萄糖浓度为33 mmol/L,紫草素浓度为1μmol/L)和高糖+高浓度紫草素组(培养基中葡萄糖浓度为33 mmol/L,紫草素浓度为10μmol/L)。各组细胞经相应处理后,CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞的凋亡率;此外,检测细胞中丙二醛(malondialdehyde,MDA)、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的水平,以反映细胞的氧化应激状态;Western blot检测Nrf2/HO-1信号通路的活性。结果:相较于高糖组,紫草素处理可呈剂量依赖性地逆转高糖所致的内皮细胞活力降低及凋亡率增加。与正常对照组相比,高浓度葡萄糖可升高内皮细胞中MDA和ROS的含量,同时降低SOD和GSH-Px的活性;相较于高糖组,给予紫草素干预后,细胞内MDA和ROS的含量降低,SOD和GSH-Px的活性升高。此外,高糖可致内皮细胞中cleaved caspase-3、HO-1及核内Nrf2蛋白表达的增加;与高糖组相比,给予紫草素干预后细胞中cleaved caspase-3、HO-1和核内Nrf2的表达部分下降。结论:紫草素可显著改善高糖所致的血管内皮细胞凋亡,其作用机制可能与激活Nrf2/HO-1信号通路并降低细胞的氧化应激水平有关。     

抗衰老Klotho蛋白减轻大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的:观察抗衰老Klotho蛋白对大鼠乳鼠原代心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的作用并探讨其作用机制。方法:建立大鼠乳鼠心肌细胞H/R模型,并将心肌细胞分为正常对照组、H/R模型组和不同浓度(0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L)Klotho作用H/R组。观察各组心肌细胞H/R前后搏动频率变化,利用MTT方法检测细胞存活率;测定各组心肌细胞H/R后LDH、CK、AST的漏出量及MDA含量、SOD活性;流式细胞术检测各组心肌细胞的凋亡率;real-time PCR检测各组心肌细胞中内质网应激标记及凋亡相关分子GRP78、CRT和CHOP和caspase-12 mRNA的表达情况;Western blot法检测心肌细胞内内质网应激凋亡蛋白CHOP和caspase-12蛋白表达及Akt磷酸化水平。结果:与正常对照组相比,H/R模型组中心肌细胞搏动频率和细胞存活率显著下降,细胞凋亡率显著升高(P0.05);LDH、CK、AST和MDA含量升高而SOD活性显著降低(P0.05);GRP78、CRT、CHOP和caspase-12 mRNA表达显著增高(P0.05);CHOP和caspase-12蛋白表达随之增高而Akt的磷酸化水平显著降低(P0.05)。与H/R模型组相比,抗衰老Klotho蛋白作用H/R心肌细胞后,心肌细胞搏动频率和细胞存活率显著升高,细胞凋亡率逐渐降低(P0.05),LDH、CK、AST和MDA含量下降而SOD活性显著增高(P0.05),GRP78、CRT、CHOP和caspase-12 mRNA的表达逐渐降低(P0.05),CHOP和caspase-12蛋白表达也随之降低,而Akt磷酸化水平显著增加(P0.05)。结论:抗衰老Klotho蛋白能够提升H/R损伤后心肌细胞的存活率,抑制细胞凋亡,通过抵抗氧化应激和过度内质网应激反应发挥作用,并与激活Akt磷酸化有关。     

黄芪多糖通过激活AMPK减轻同型半胱氨酸对人血管内皮细胞的损伤

目的:探讨黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)能否减轻同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)对人血管内皮细胞的损伤及其可能的机制。方法:培养人脐静脉内皮细胞,分为正常对照组、APS组[APS(200mg/L)处理24 h]、Hcy组[Hcy(1 mmol/L)处理24 h]和Hcy+APS组[Hcy(1 mmol/L)和APS(200 mg/L)共同处理24 h]。采用MTT法检测细胞活力,采用试剂盒法检测内皮细胞中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和超氧化物歧化酶(superoxidase dismutase,SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,采用RT-q PCR检测SOD1、过氧化氢酶(catalase,CAT)和NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2,NOX2)的mRNA表达,并采用Western blot检测腺苷酸活化蛋白激酶α(AMP-activated protein kinaseα,AMPKα)和磷酸化AMPKα(phosphorylated AMPKα,pAMPKα)的蛋白水平。结果:与对照组相比,Hcy组内皮细胞活力明显下降,LDH活性升高,细胞内MDA含量,SOD活性下降,SOD1和CAT的mRNA表达水平显著下降,而NOX2的mRNA表达水平明显升高(P0.05)。APS能够抑制Hcy引起的细胞活力下降、LDH活性升高及MDA含量增加;增加SOD活性,提高SOD1和CAT的mRNA表达水平,减少NOX2的mRNA表达水平(P0.05)。AMPK抑制剂Compound C则可以显著降低APS对Hcy引起的内皮细胞损伤的修复作用。结论:APS可通过活化AMPK调控细胞内氧化应激从而抑制Hcy对血管内皮细胞的损伤。     

坏死性凋亡介导高糖引起的人脐静脉内皮细胞损伤

目的:研究坏死性凋亡是否介导高糖(HG)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)损伤。方法:CCK-8法检测细胞存活率;Western blot法测定受体相互作用蛋白3(RIP3)、cleaved caspase-3的蛋白水平;罗丹明123染色荧光显微镜照相法检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP);双氯荧光素(DCFH-DA)染色荧光显微镜照相法测定胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的水平。结果:应用不同浓度葡萄糖(10、20和40 mmol/L)处理HUVECs 24 h,RIP3的蛋白水平随葡萄糖剂量增加而升高,40 mmol/L时达高峰;应用40 mmol/L葡萄糖处理HUVECs 3 h、6 h、9 h、12 h和24 h能上调RIP3的蛋白水平,于9 h达最高峰;应用20μmol/L凋亡蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK预处理HUVECs 30 min促进RIP3表达;应用100μmol/L坏死性凋亡抑制剂necrostatin-1预处理HUVECs 1 h能抑制HG诱导HUVECs的细胞存活率降低,ROS过度生成及MMP丢失,但能升高cleaved caspase-3的蛋白水平。结论:坏死性凋亡介导高糖引起的人脐静脉内皮细胞损伤,但与内皮细胞凋亡存在负相关。