敲减microRNA-205靶向PTEN抑制食管癌细胞TE1的增殖并促进细胞凋亡

目的:探讨miRNA-205对食管癌细胞株TE1增殖和凋亡能力的影响及其作用机制.方法:实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和Western印迹检测正常食管黏膜细胞Het-1A和不同食管癌细胞株(KYSE70,TE12,TE1)中miRNA-205的mRNA及蛋白表达水平.转染miRNA-205抑制剂下调TE1细胞中miRNA-205的表达,采用CCK-8法和流式细胞术检测细胞增殖能力、细胞周期和细胞凋亡情况;Western印迹检测细胞增殖和细胞凋亡相关CDK2,cyclin D1,P21,Bcl-2,cleavedcaspase-3,caspase-3,p-Rb,Rb,p-Akt和Akt的蛋白表达水平.双荧光素酶报告基因分析法预测及验证其可能的靶基因.结果:MiRNA-205在各型食管癌细胞中高表达.沉默miRNA-205后,TE1细胞的增殖能力降低并表现为细胞周期阻滞,而细胞凋亡率显著升高(p＜0.05).同时细胞中cyclin D1,CDK2,bcl-2,p-Rb及p-Akt的蛋白表达水平均显著降低,p21及cleaved-caspase-3的蛋白表达水平显著升高.双荧光素酶报告基因分析显示PTEN是miRNA-205的可能作用靶点,TE1中共转染miRNA-205抑制剂和PTEN siRNA可部分逆转miRNA-205介导细胞增殖抑制及凋亡诱导作用.结论:沉默miRNA-205可靶向PTEN抑制食管癌细胞株TE1的增殖,并促进其凋亡,提示miRNA-205可作为食管癌诊疗的一个潜在作用靶点.     

miRNA-25对人食管鳞状细胞癌细胞株TE1增殖的影响

目的:探讨过表达/沉默微小RNA-25(microRNA-25,miRNA-25)对人食管鳞状细胞癌细胞株TE1增殖能力的影响及其作用机制。方法:RT-PCR检测各临床样品组织中miRNA-25的表达水平。建立miRNA-25过表达/沉默的TE1细胞株,采用CCK-8法、Brd U实验和流式细胞术检测TE1细胞增殖能力的变化及细胞周期状态;Western blot法和RT-PCR法检测细胞周期调控因子细胞周期蛋白E1(cyclin E1)和细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)的蛋白与mRNA表达水平。结果:miRNA-25在食管黏膜组织中具有特异性表达并在TE1细胞中呈高表达。CCK-8法和Brd U实验结果显示过表达miRNA-25的TE1细胞的增殖能力显著增加(P0.05),而沉默miRNA-25抑制TE1细胞的增殖;流式细胞术检测结果显示过表达miRNA-25可明显促进TE1细胞从G0/G1期向S期转换,沉默miRNA-25则抑制其转换。同时Western blot和RT-PCR实验结果显示过表达miRNA-25后,cyclin E1和CDK2的蛋白和mRNA表达水平均显著增加(P0.05),沉默miRNA-25后则显著减少(P0.05)。结论:miRNA-25能够促进人食管鳞状细胞癌细胞株TE1的增殖,其作用机制可能与促进细胞周期转换及上调cyclin E1和CDK2的表达水平有关,提示miRNA-25可作为治疗食管鳞状细胞癌的一个潜在靶点。     

ATF4对皮肤癌细胞增殖的影响及相关机制

目的：探讨沉默/过表达ATF4对人皮肤癌细胞增殖的影响及其相关作用机制。方法：Western blot技术检测不同类型皮肤癌细胞中ATF4的蛋白表达水平。构建ATF4沉默/过表达的A431皮肤癌细胞株,采用CCK-8法、克隆形成实验和流式细胞术检测A431细胞增殖能力的变化及细胞周期分布;Western blot技术检测细胞周期调控因子cyclin D1、cyclin E、P21和p-Rb/Rb的蛋白表达水平。结果：ATF4在3种不同类型的皮肤癌细胞中均呈高表达。CCK-8法和克隆形成实验结果显示沉默ATF4的A431细胞存活率和增殖能力均显著降低(P<0.05),而过表达ATF4可促进A431细胞的增殖;流式细胞仪检测结果显示沉默ATF4可明显抑制A431细胞从G0/G1期向S期转换,过表达ATF4则促进其G1/S转换。同时Western blot实验结果显示沉默ATF4后,cyclin D1、cyclin E和p-Rb的蛋白水平均显著降低,而P21的蛋白表达显著增加(P<0.05),过表达ATF4后则cyclin D1、cyclin E和p-Rb的蛋白水平显著增加,而P21的蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论：ATF4能够促进人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431的增殖,其潜在作用机制可能与促进细胞周期G1/S转换及影响相关周期调控因子的表达有关,提示AT F 4可作为治疗皮肤癌的一个潜在作用靶点。     

miRNA-181a对多发性骨髓瘤细胞增殖和迁移的作用

目的:通过沉默人多发性骨髓瘤细胞株RPM18226中miRNA-181a的表达,观察RPM18226细胞的增殖、迁移和细胞周期的变化,并探讨其可能的作用机制。方法:实时荧光定量PCR检测多发性骨髓瘤患者和健康者血清标本中miRNA-181a的表达水平;转染miRNA-181a inhibitor后,CCK-8法与集落形成实验检测细胞的增殖能力,划痕实验检测细胞的迁移能力,流式细胞术检测细胞的周期变化,Western blot法检测cyclin D1、p-PI3K和pAkt蛋白水平的变化。结果:多发性骨髓瘤患者血清中miRNA-181a呈高表达,显著高于正常人;转染miRNA-181a inhibitor后,RPM18226细胞的存活率和集落形成能力下降,迁移能力降低,G_0/G_1期细胞比例明显减少,S期细胞比例增多,cyclin D1蛋白表达显著低于正常对照组,PI3K和Akt的磷酸化水平明显低于正常对照组。结论:沉默miRNA-181a的表达能够抑制RPM18226细胞的增殖,并降低细胞的迁移能力,可能与细胞周期及PI3K/Akt信号通路有关。     

MicroRNA-483-3p对人神经胶质瘤细胞的作用

目的:探讨microRNA(miRNA)-483-3p对人神经胶质瘤细胞A172生长和迁移能力的影响及潜在作用机制。方法:实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-q PCR)检测人肾胚细胞系HEK-293和不同神经胶质瘤细胞株(A172、U251和SHG44)中miRNA-483-3p的表达水平。转染miRNA-483-3p抑制序列(miRNA-483-3p inhibitor)下调A172细胞中miRNA-483-3p的表达,采用CCK-8法和流式细胞术检测细胞活力和周期分布;Transwell实验检测细胞的迁移;Western blot检测周期相关调控因子及上皮-间充质转化相关蛋白的水平。双萤光素酶报告基因分析法预测及验证其可能的靶基因。结果:miRNA-483-3p在各型神经胶质瘤细胞中高表达。沉默miRNA-483-3p后,A172细胞的活力下降并呈现出明显的周期阻滞,且细胞迁移率也显著降低。同时细胞中cyclin D1、周期蛋白依赖性激酶4、磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白、N-cadherin及vimentin的蛋白表达水平均显著降低,E-cadherin和β-catenin的蛋白表达水平显著升高。双萤光素酶报告基因分析显示Smad4是miRNA-483-3p的可能作用靶点,A172细胞共转染miRNA-483-3p inhibitor和Smad4 siRNA可部分逆转miRNA-483-3p介导的细胞增殖及迁移抑制。结论:沉默miRNA-483-3p可通过靶向Smad4抑制神经胶质瘤细胞株A172的生长及迁移。     

过表达转录因子BACH2对人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞活力及凋亡的影响

目的:探讨BTB与CNC同源基因2(BACH2)过表达对人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞CCRFCEM活力和凋亡的作用。方法:将人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞CCRF-CEM分为3组:对照组、空载体组和BACH2过表达组,通过脂质体转染法将BACH2过表达载体转入BACH2过表达组的CCRF-CEM细胞。采用qPCR检测CCRF-CEM细胞和正常人外周血单个核细胞(PBMC)中BACH2的mRNA表达差异,CCK8法检测CCRF-CEM细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡水平,免疫荧光染色观察细胞中BACH2和细胞周期蛋白D3(cyclin D3)表达的变化,Western blot检测细胞中cyclin D3、Bcl-2及caspase-3的蛋白表达水平。结果:CCRF-CEM细胞中BACH2的mRNA表达水平显著低于PBMC(P0.05)。与对照组比较,BACH2过表达组CCRF-CEM细胞活力显著减弱(P0.05),凋亡率显著升高(P0.05),cyclin D3和Bcl-2表达水平显著降低(P0.05),而caspase-3表达水平显著升高(P0.05)。结论:人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞中BACH2呈低表达,过表达BACH2可抑制人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞的活力,并诱导其凋亡。     

miR-130a对大鼠脑基底动脉平滑肌细胞活力和凋亡的影响

目的:探讨微小RNA(miR)-130a对大鼠脑基底动脉平滑肌细胞(basilar arterial smooth muscle cells,BASMCs)生物学行为的影响及可能的作用机制。方法:采用real-time PCR法检测大鼠BASMCs在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作用下miR-130a的表达水平。转染miR-130a inhibitor下调BASMCs中miR-130a的表达,采用CCK-8法和流式细胞术检测BASMCs活力、细胞周期及凋亡情况;Western blot检测细胞周期及凋亡相关调控因子细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、p21、p-Rb、Bcl-2和cleaved caspase-3/caspase-3的蛋白水平。Real-time PCR及Western blot检测检测生长阻滞特异性同源盒蛋白(Gax)的表达情况。结果:AngⅡ可促进BASMCs中miR-130a的表达,而抑制Gax的表达。miR-130a inhibitor可部分抑制AngⅡ增加BASMCs细胞活力的效应,并上调Gax的表达。此外,下调miR-130a后细胞早期凋亡率显著增加(P0.05);同时细胞中cyclin D1、CDK2、Bcl-2和p-Rb的蛋白水平均显著降低,p21及cleaved caspase-3的蛋白水平显著升高(P0.05)。结论:沉默miR-130a可上调BASMCs中Gax的表达,进而影响细胞周期及凋亡相关因子的表达,从而抑制细胞活力,并促进其凋亡,提示miR-130a可作为高血压脑血管重构的一个潜在诊疗靶点。     

RNAi沉默CD59对急性T系白血病Jurkat细胞株增殖的影响

目的运用RNAi慢病毒沉默CD59的表达,观察其对急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞株增殖、凋亡的影响。方法构建CD59 RNAi-EGFP融合蛋白慢病毒载体,转染急性T系白血病Jurkat细胞株,筛选出稳定转染的细胞系,空病毒组为阴性对照,未处理的Jurkat细胞系作为空白对照;荧光显微镜和流式细胞仪观察各组的细胞转染效率;ELISA检测各组细胞CD59的表达情况;RT-PCR检测各组CD59基因以及凋亡相关基因Bcl-2/Bax m RNA的表达;CCK8表达检测细胞增殖效率的改变;流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。结果荧光显微镜和FCM观察转染效率在90%以上;ELISA结果显示实验组细胞CD59蛋白表达降低;RT-PCR结果显示实验组CD59、Bcl-2 m RNA表达水平降低(P0.05),Bax m RNA表达水平升高(P0.05);CCK8结果显示实验组细胞增殖效率明显降低(P0.05);流式细胞仪结果显示沉默CD59的表达能够促进细胞凋亡(P0.05)。结论沉默D59基因表达可抑制急性T系白血病Jurkat细胞株的增殖能力并诱导细胞凋亡,为临床急性T系白血病的治疗提供了新靶标、新思路。     

紫草素对卵巢癌细胞SKOV3/DDP顺铂耐药的逆转作用

目的:探讨紫草素是否逆转卵巢癌细胞SKOV3/DDP的顺铂耐药效应及其作用机制。方法:采用CCK-8法确定紫草素和顺铂的最佳作用条件,流式细胞术检测细胞的周期分布及凋亡率;Western blot检测周期及凋亡相关调控因子细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、P18、p-Rb、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平。结果:CCK-8实验结果显示,相较于单用顺铂,联合使用紫草素对顺铂耐药卵巢癌细胞SKOV3/DDP的生长抑制作用较为显著。此外,联用紫草素和顺铂可显著抑制细胞周期G_1/S转化,并增加细胞早期凋亡率。Western blot结果显示,相较于顺铂处理组,紫草素和顺铂联用组的cyclin D1、CDK2、p-Rb及Bcl-2的蛋白水平显著降低,而P18、Bax及cleaved caspase-3的蛋白表达显著增加。结论:紫草素可逆转卵巢癌SKOV3/DDP细胞的顺铂耐药效应,其作用机制可能与影响细胞周期及凋亡相关因子的表达,进而抑制细胞活力促进细胞凋亡相关。     

Knockdown of WISP1 inhibit proliferation and induce apoptosis in ALL Jurkat cells

WISP1, a Wnt-induced secreted protein, has been found to have anticancer activity. ALL is a leading cause of death. Here we investigate the WISP1 effects on ALL Jurkat cells. Cell viability was assessed by CCK-8. Cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry. Mitochondrial membrane potential (MMP) was monitored using TMRM. Generation of reactive oxygen species (ROS) was quantified using DCFH-DA. Western blot was used to detect the expression of cell proliferation and apoptosis related genes. The results showed that knockdown of WISP1 significantly inhibited proliferation of Jurkat cells. Parallelly, cell cycle distribution was increased at G1 phase and apoptotic rate was induced after WISP1 knockdown. Furthermore, knockdown of WISP1 induced apoptosis of Jurkat cells was also associated with loss of MMP and generation of ROS. Western blot results showed that the protein expression p-AKT, PCNA, CDK1, P-ERK, CDK2, VEGF, VEGFR2 and Bcl2 were decreased, while the expression of Bax was up-regulated. In conclusion, WISP1 plays an important role in proliferation and apoptosis of Jurkat cells in mitochondria dependent pathway, the specific mechanisms need further study.     

HOXB7基因沉默对人胃癌细胞活力、迁移和侵袭的影响

目的:探讨靶向沉默HOXB7基因对人胃癌SGC-7901细胞活力、迁移和侵袭作用的影响及潜在机制。方法:设计靶向HOXB7的siRNA,然后瞬时转染胃癌SGC-7901细胞,实时荧光定量PCR和Western blot法检测siRNA靶向沉默的效果。MTT法检测细胞的活力,Western blot法检测细胞周期相关蛋白CDK4和cyclin D1蛋白的表达水平,Transwell小室侵袭实验检测SGC-7901细胞的侵袭能力,实时荧光定量PCR和Western blot法检测胃癌SGC-7901细胞PTEN和VEGF的表达水平以及p-AKT的蛋白水平。结果:胃癌组织中HOXB7基因在mRNA和蛋白水平的表达均显著高于对照组织。siRNA可有效靶向沉默SGC-7901细胞中HOXB7的表达,且沉默HOXB7表达后SGC-7901细胞活力明显下降,同时细胞周期相关蛋白CDK4和cyclin D1的表达亦下调。靶向沉默HOXB7可明显抑制SGC-7901细胞中AKT的磷酸化水平,抑制胃癌细胞的侵袭转移,同时下调VEGF的表达水平,抑制胃癌组织中的肿瘤血管生成。结论:HOXB7作为一个癌基因,可上调细胞周期相关蛋白CDK4、cyclin D1和侵袭相关分子VEGF的表达,上调AKT的磷酸化水平,进而抑制PTEN的功能,促进胃癌细胞SGC-7901的生长、迁移和侵袭能力。     

胆固醇缺乏对Jurkat细胞增殖的影响

利用间接免疫荧光染色、荧光探针标记、免疫细胞化学染色及免疫印迹等实验方法 ,从细胞增殖转化功能、细胞膜脂质流动性、蛋白酪氨酸激酶 (PTK )活性以及细胞周期调控蛋白表达的变化等方面探讨了胆固醇缺乏对Jurkat细胞的功能影响及其分子机制。结果显示 :经去脂血清培养基培养的Jurkat细胞加洛伐他丁处理 3d后 ,细胞膜脂流动性明显增大 ,细胞生长速度明显下降 ,细胞增殖受抑 ,PTK活性及细胞周期素D1(cyclinD1)、周期素依赖性激酶 4 (CDK4 )蛋白的表达明显降低 ,加入低密度脂蛋白可以部分逆转上述变化。结果提示 ,无论是内源性还是外源性胆固醇的缺乏都能使Jurkat细胞膜脂流动性发生变化 ,细胞PTK活性下降 ,cyclinD1、CDK4蛋白表达降低 ,推测这一变化与细胞增殖受抑有直接关系     

蛇六谷提取物抑制K562细胞增殖并诱导分化的作用

目的:探讨蛇六谷提取物(TuAKe)抑制人慢性髓系白血病K562细胞增殖和诱导分化的作用机制。方法:不同浓度的TuAKe处理K562细胞,MTT比色法和半固体集落形成实验检测K562细胞的增殖能力;瑞氏-姬姆萨染色观察细胞形态;流式细胞术检测分化相关抗原CD11b、CD14和CD42b的阳性表达率;Western blot法检测细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白E1(cyclin E1)和红系分化核转录因子GATA-1的蛋白表达水平。结果:TuAKe能够抑制K562细胞增殖,改变细胞形态,抑制K562细胞进入S期,并阻滞在G_2/M期,提高分化相关抗原CD11b、CD14和CD42b阳性表达率,上调GATA-1蛋白表达,同时下调CDK2和cyclin E1蛋白表达(P0.05)。结论:TuAKe可能通过调控细胞周期抑制K562细胞增殖,同时诱导K562细胞多向分化。     

miRNA-326调控胃癌细胞活力和凋亡的机制及其在胃癌组织中的表达及临床意义

目的:探讨微小RNA-326(miRNA-326)调控胃癌细胞活力和凋亡的机制及其在胃癌组织中的表达及临床意义。方法:采用RT-qPCR检测miRNA-326在55例胃癌组织中的表达情况,并分析其与临床病理特征的关系。以胃癌细胞BGC-823为研究对象,RT-qPCR检测miRNA-326在细胞中的表达;将BGC-823细胞随机分为正常对照组(未转染)、mimic-NC组(转染mimic阴性对照)和miRNA-326 mimic组(转染miRNA-326 mimic),以脂质体转染法上调miRNA-326表达后,CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测基质金属蛋白酶9(MMP-9)、p21、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、Bcl-2和cleaved caspase-3的蛋白水平,RT-qPCR检测cyclin D1的mRNA表达,双萤光素酶报告基因检测法验证CCND1 (cyclin D1的基因)是否是miRNA-326的靶基因。结果:miRNA-326在胃癌组织中的表达明显低于癌旁组织(P 0. 05),其表达与肿瘤大小、淋巴结转移、分化程度及临床分期均有显著相关性(P 0. 05),而与患者的年龄和性别无关;此外,还与患者生存率密切相关(P 0. 05)。miRNA-326在BGC-823细胞中的表达明显低于正常胃黏膜GES-1细胞(P 0. 05)。与正常对照组相比,mimic-NC组细胞中miRNA-326的表达无明显变化,而miRNA-326 mimic组细胞中miRNA-326的表达明显升高(P 0. 05)。与正常对照组相比,miRNA-326 mimic组细胞活力明显减弱,而细胞凋亡增强(P 0. 05);此外,与正常对照组相比,miRNA-326 mimic组细胞中MMP-9、cyclin D1、Bcl-2蛋白及cyclin D1 mRNA表达下降,而p21和cleaved caspase-3的蛋白水平上升(P 0. 05)。然而,mimic-NC组与正常对照组相比,各检测指标的差异均无统计学显著性。与mimic-NC+miR-326 mimics组相比,转染pmiR-CCND1-WT质粒细胞的萤光素酶活性降低(P 0. 05),而转染pmiRCCND1-Mut质粒的萤光素酶活性无改变。结论:miRNA-326在胃癌组织中低表达,可能通过靶向调控CCND1表达而促进细胞活力并抑制细胞凋亡。