钙信号早期干预对大鼠心肌细胞钙调素依赖性蛋白激酶信号途径及细胞凋亡的影响

通过建立肥大心肌细胞模型，研究钙通道阻滞剂对心肌细胞钙调素依赖性蛋白激酶II （calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII）的表达及钙离子浓度的变化对钙泵、ATP凋亡信号调节激酶（apoptosis signal-regulation kinase1 ASK1）、细胞活力及细胞凋亡率的影响，深入了解钙离子拮抗剂在心肌细胞肥大过程中的作用。通过早期应用钙离子拮抗剂，可以明显改善CaMKII信号系统的活性，保持心肌细胞内钙稳态，抑制心肌细胞的凋亡。     

钙／钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ对心肌细胞钙循环的影响

在心衰、心肌肥厚和心肌缺血等情况下,心肌细胞钙离子循环常出现障碍,导致心脏电-机械活动异常,临床发现心律失常和心源性猝死常和钙循环异常有关.钙调素和钙/钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ(CaMKII)通过调节钙循环的各个环节来影响心肌细胞信号传导和兴奋-收缩偶联,在心衰或心肌肥厚等病理条件下细胞内表达升高.对其深入研究有利于了解这些病理情况下心律失常发生的机制.     

钙/钙调素依赖的蛋白激酶II对心肌细胞钙循环的影响

在心衰、心肌肥厚和心肌缺血等情况下 ,心肌细胞钙离子循环常出现障碍 ,导致心脏电 机械活动异常 ,临床发现心律失常和心源性猝死常和钙循环异常有关。钙调素和钙 /钙调素依赖的蛋白激酶II(CaMKII)通过调节钙循环的各个环节来影响心肌细胞信号传导和兴奋 收缩偶联 ,在心衰或心肌肥厚等病理条件下细胞内表达升高。对其深入研究有利于了解这些病理情况下心律失常发生的机制。     

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ通过介导凋亡加重H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的:探讨钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(Ca~(2+)/calmodulin-dependent protein kinase II,Ca MKII)在H9c2心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤中的作用。方法:H9c2心肌细胞随机分为4组:正常对照(control)组、Ca MKII特异性抑制剂KN-93(1μmol/L)对照(KN-93)组、H/R组和KN-93+H/R组,其中KN-93组及KN-93+H/R组先用1μmol/L KN-93预处理2 h后,再进行其它处理。倒置显微镜观察各组H9c2心肌细胞的形态变化,CCK-8法检测各组H9c2心肌细胞的活力,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒检测各组培养基中LDH的活性,Western blot法检测Ca MKII及其底物受磷蛋白(phospholamban,PLN)的磷酸化水平以及凋亡相关蛋白cleaved caspase-3的表达,TUNEL染色和流式细胞术观察细胞凋亡。结果:与control组相比,KN-93组各项指标均无显著性差异;H/R组细胞皱缩,大量死亡,细胞活力明显降低,培养基中LDH活性明显升高(P0.01),Ca MKII及PLN的磷酸化水平和cleaved caspase-3的蛋白水平显著增加(P0.01),TUNEL染色阳性细胞数和流式细胞凋亡率显著增加(P0.01);1μmol/L KN-93干预H/R可明显改善细胞形态,增加细胞活力,降低培养基中LDH活性(P0.01),减少Ca MKII和PLN的磷酸化水平以及cleaved caspase-3的蛋白水平(P0.05),降低TUNEL染色阳性细胞数和流式细胞凋亡率(P0.01)。结论:Ca MKII通过介导细胞凋亡参与H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤。     

Rock可能通过抑制PI3K/Akt通路促进缺氧诱导的心肌细胞凋亡

 目的:通过建立体外心肌细胞缺氧模型,观察Rho相关的卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK）在不同缺氧时点的表达,探讨其在心肌细胞凋亡中的作用。 方法: （1） 原代培养SD乳鼠心肌细胞,并用抗α-横纹肌肌动蛋白免疫组化法进行鉴定。（2）利用缺氧液和缺氧盒,建立心肌细胞缺氧模型,分别缺氧培养1 h、3 h、6 h、9 h,以正常氧培养的心肌细胞作为对照。（3）用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡,MTT检测细胞存活率,Western blotting检测ROCK-1、ROCK-2、caspase-3活化片段、PI3K和p-PI3K的表达情况。 结果: （1）缺氧1 h、3 h、6 h、9 h后,心肌细胞凋亡率分别为(8.76±1.51)%、(15.36±2.34)%、(26.50±3.43)%、(41.96±4.22)%,与对照组［2.60±0.34)%］比较均有显著差异（P<0.01）;存活率分别为(93.20±4.12)%、 (86.14±3.10)%、(75.53±7.25)%、(60.21±6.75)%,与对照组［（97.60±1.12)%］比较均有显著差异（P<0.05）。（2）ROCK-1和ROCK-2缺氧1 h即开始升高,3~6 h表达达高峰,9 h开始回落,且均明显高于对照组（P<0.05）。（3）Caspase-3在缺氧1 h开始逐渐活化,在随后观察的时点内持续处于活化状态,与对照组比较均有显著差异（P<0.01）。（4） p-PI3K在缺氧1 h后开始升高,3 h达高峰,6 h开始回落,9 h表达基本消失,各时点比较差别有统计学意义（P<0.05）。 结论: ROCK-1和ROCK-2在缺氧后表达逐渐升高,与细胞凋亡的过程相一致。ROCK可能通过抑制p-PI3K信号途径,促进缺氧心肌细胞凋亡。     

瘦素抑制H_2O_2诱导的大鼠心肌细胞凋亡

目的:观察瘦素(leptin)对H2O2诱导的大鼠心肌细胞凋亡的影响并探讨其作用机制。方法:应用脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记(TUNEL)法观察瘦素对H2O2诱导的大鼠心肌细胞H9c2凋亡的影响;应用Western blotting法观察瘦素、H2O2对caspase-3、胞外信号调控激酶(ERK)活性的影响。结果:(1)瘦素对H2O2诱导的H9c2细胞凋亡具有显著的抑制作用(与对照组比较P0.01),该作用可被ERK激酶抑制剂PD98059所阻断。(2)H2O2明显抑制ERK活性;而瘦素可激活ERK并部分阻断H2O2诱导的caspase-3激活。结论:瘦素对H2O2诱导的H9c2细胞凋亡具有抑制作用,其机制可能与其激活ERK信号途径有关。     

左旋卡尼汀对缺氧/复氧诱导的子鼠心肌细胞凋亡的影响

目的：探讨左旋卡尼汀（L-carnitine）对缺氧/复氧（I/R）诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。方法： 采用原代培养大鼠子鼠心肌细胞作为模拟缺血再灌注损伤实验模型，实验分3组：①正常对照组（control）；②I/R组:缺氧120 min,复氧240 min;③L-carnitine组：I/R前2 h加用L-carnitine设4个浓度梯度。观察各组细胞经I/R损伤后，细胞内超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量的变化情况，并用流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡率。结果： I/R组SOD活性低于对照组，MDA含量、细胞凋亡率均高于对照组，与control组相比均有显著差异(P＜0.05)；在L-carnitine用药组，SOD活性高于I/R组，MDA含量、细胞凋亡率均显著高于I/R组，P＜0.05。结论： 左旋卡尼汀对I/R损伤诱导的子鼠心肌细胞凋亡有抑制作用，其作用在一定范围内呈剂量依赖关系。     

脂联素激活AKT抑制H2O2诱导的大鼠心肌细胞凋亡

目的: 观察脂联素(adiponectin)对H₂O₂诱导的大鼠心肌细胞(H9c2)凋亡的影响并探讨其作用机制。方法: 应用脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记(TUNEL)法观察脂联素对H₂O₂诱导的H9c2细胞凋亡的影响;应用Western blotting法观察脂联素对Akt和caspase-3活性的影响。结果: 脂联素对H₂O₂诱导的H9c2细胞凋亡具有显著的抑制作用(P<0.01)。脂联素直接激活Akt并增加了H₂O₂诱导的Akt活性,对H₂O₂诱导的caspase-3激活有显著抑制作用(P<0.01)。 Akt上游激酶PI3K的特异抑制剂LY294002 不但增加了H₂O₂诱导的H9c2细胞凋亡率,而且消除了脂联素的抗凋亡作用。结论: 脂联素对H₂O₂诱导的H9c2细胞凋亡具有抑制作用,其机制可能与其激活PI3K/Akt通路、抑制caspase凋亡信号通路有关。     

环状RNA Lrp6调控过氧化氢诱导的H9c2心肌细胞凋亡

目的:探究环状RNA Lrp6(circLrp6)对过氧化氢(H2O2)诱导的H9c2心肌细胞凋亡的影响.方法:通过Sanger测序和RNase R酶切验证circLrp6的环状结构;细胞荧光原位杂交分析circLrp6的亚细胞定位;通过RT-qPCR检测H2O2处理的H9c2细胞和缺血再灌注损伤的小鼠心脏组织中cir...     

HO-1/CO系统抑制AngⅡ诱导的大鼠心肌细胞凋亡

目的 探讨血红素氧合酶-1/一氧化碳(HO-1/CO)系统对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的大鼠心肌细胞凋亡的影响.方法 原代培养新生Wistar大鼠心肌细胞,随机分为:对照组、AngⅡ组、AngⅡ+氯化血红素(hemin)(HO-1诱导剂)组和AngⅡ+锌原卟啉-9(ZnppIX)(HO-1抑制剂)组.用real-time PCR及Western blot检测心肌细胞HO-1mRNA和蛋白的表达,比色法测定细胞培养上清液中碳氧血红蛋白(COHb)含量,流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 AngⅡ组心肌细胞HO-1 mRNA、蛋白、COHb含量和细胞凋亡均明显高于对照组(P＜0.05),AngⅡ+hemin组HO-1mRNA、蛋白、COHb含量进一步升高(P＜0.05),而细胞凋亡回降(P＜0.05),但仍高于对照组(P＜0.05),AngⅡ+ZnPPIX组仅细胞凋亡湿著升高(P＜0.05),其他指标无显著变化.结论 HO-1/CO系统对AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡具有抑制作用.     

ROCK通过抑制PI3K/Akt通路促进高糖诱导的心肌细胞凋亡

目的:探讨Rho相关卷曲螺旋激酶(ROCK)是否通过调控PI3K/Akt信号通路参与高糖诱导的原代心肌细胞凋亡。方法:培养原代Wistar乳鼠心肌细胞,用α-横纹肌肌动蛋白(α-SCA)免疫组化法进行鉴定;建立心肌细胞高糖模型,采用5.5、33和40 mmol/L葡萄糖作用于细胞48 h。采用MTT法检测细胞活力;RT-qPCR检测各组心肌细胞中ROCK1和ROCK2的表达水平;流式细胞术检测各组心肌细胞的凋亡水平;Western blot检测ROCK1、ROCK2、cleaved caspase-3、Bcl-2、PI3K、Akt和p-Akt的蛋白水平;为了证实ROCKs对PI3K/Akt信号通路的调控作用,将细胞分为对照组(5.5 mmol/L葡萄糖处理细胞)、高糖组(33 mmol/L葡萄糖处理细胞)和高糖加Y27632(ROCK抑制剂)组,Western blot检测ROCK1、ROCK2、PI3K、Akt和p-Akt的蛋白水平。结果:高糖培养48 h后,33和40 mmol/L葡萄糖组细胞相对活力分别为(79.71±2.43)%和(68.41±7.49)%,与对照组相比显著降低...     

H2O2-stimulated Ca2+ influx via TRPM2 is not the sole determinant of subsequent cell death

Activation of transient receptor potential melastatin 2 (TRPM2), a non-selective, Ca²⁺-permeable cation channel, is implicated in cell death. Channel opening is stimulated by oxidative stress, a feature of numerous disease states. The wide expression profile of TRPM2 renders it a potentially significant therapeutic target in a variety of pathological settings including cardiovascular and neurodegenerative diseases. HEK293 cells transfected with human TRPM2 (HEK293/hTRPM2) were more vulnerable to H₂O₂-mediated cell death than untransfected controls in which H₂O₂-stimulated Ca²⁺ influx was absent. Flufenamic acid partially reduced Ca²⁺ influx in response to H₂O₂ but had no effect on viability. N-(p-Amylcinnamoyl) anthranilic acid substantially attenuated Ca²⁺ influx but did not alter viability. Poly(adenosine diphosphate ribose) polymerase inhibitors (N-(6-oxo-5,6-dihydro-phenanthridin-2-yl)-N,N-dimethylacetamide, 3,4-dihydro-5-[4-(1-piperidinyl)butoxy]-1(2H)-isoquinolinone and nicotinamide) reduced Ca²⁺ influx and provided a degree of protection but also had some protective effects in untransfected controls. These data suggest H₂O₂ triggers cell death in HEK293/hTRPM2 cells by a mechanism that is in part Ca²⁺ independent, as blockade of channel opening (evidenced by suppression of Ca²⁺ influx) did not correlate well with protection from cell death. Determining the underlying mechanisms of TRPM2 activation is pertinent in elucidating the relevance of this channel as a therapeutic target in neurodegenerative diseases and other pathologies associated with Ca²⁺ dysregulation and oxidative stress.     

H2O2诱导骨骼肌卫星细胞凋亡及法舒地尔的保护作用

背景：骨骼肌卫星细胞是成体骨骼肌中位于肌细胞膜和基膜之间具有增殖分化潜能的肌源性干细胞,研究表明骨骼肌卫星细胞的有效性及安全性,但是移植后的干细胞成活率极低,极大的限制了骨骼肌卫星细胞的应用。 目的：观察过氧化氢(H₂O₂)对大鼠骨骼肌卫星细胞凋亡的影响以及法舒地尔的保护作用。 方法：取体外培养的骨骼肌卫星细胞,随机分为正常对照组,H₂O₂组,H₂O₂⁺法舒地尔组(法舒地尔组),采用流式细胞仪检测细胞凋亡率,ELISA法检测白细胞介素4、肿瘤坏死因子a的浓度,Western blot检测Bax蛋白的表达。 结果与结论：同H₂O₂组相比,法舒地尔组凋亡发生率明显下降(P < 0.05),Bax蛋白水平表达明显降低(P < 0.05),白细胞介素4、肿瘤坏死因子a的分泌显著减少(P < 0.05)。结果提示,法舒地尔抑制Rho激酶信号途径发挥抗凋亡保护作用,其机制可能与减少Bax蛋白的表达有关。      

丹参单体通过下调粘着斑激酶诱导H2O2刺激的肝星状细胞凋亡

目的: 研究丹参单体IH764-3对H₂O₂刺激的肝星状细胞(HSCs)凋亡的诱导作用以及此过程中粘着斑激酶(FAK)的变化。方法: 通过直接细胞计数法测定HSCs增殖;光学显微镜及透射电镜技术观察凋亡细胞的形态学改变,并应用膜联蛋白(Annexin-V)/碘化丙啶(PI)联合标记法检测HSCs的凋亡率;运用RT-PCR方法观察FAKmRNA表达。结果: H₂O₂具有刺激HSCs增殖的作用;丹参单体IH764-3能够诱导H₂O₂刺激的HSCs凋亡,并呈剂量依赖关系:10mg/L、20mg/L、30mg/L及40mg/LIH764-3干预48h后各组凋亡率分别为6.35%、9.28%、15.10%、19.69%,而H₂O₂组为2.30%;30mg/LIH764-3干预HSCs不同时间(12h、24h、48h)的凋亡率分别是6.73%、10.34%、15.10%,呈时间依赖关系;RT-PCR分析表明FAK基因表达强度在加入IH764-3后2h即明显下调,10mg/L,20mg/L,30mg/L及40mg/L组分别比H₂O₂组低了68.71%、71.00%、86.72%、95.16%。结论: 丹参单体IH764-3可以诱导H₂O₂刺激的HSCs凋亡,下调FAKmRNA表达是其诱导HSCs凋亡的机制之一。     

G蛋白偶联受体75信号通路在20-羟二十烷四烯酸诱导乳鼠心肌细胞凋亡中的作用

目的:探讨G蛋白偶联受体75(G-protein-coupled receptor 75,GPR75)介导的PLC/PKC信号通路在20-羟二十烷四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acid,20-HETE)诱导的乳鼠心肌细胞凋亡中的作用.方法:采用慢病毒转染敲减乳鼠心肌细胞GPR75基因表达...     

shRNA沉默 ROCK1和ROCK2 表达对缺氧诱导的大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的: 探讨Rho相关的卷曲蛋白激酶(ROCK1)和ROCK2在缺氧诱导的大鼠心肌细胞凋亡中的作用。方法: 原代培养大鼠心肌细胞,并用抗α-横纹肌肌动蛋白免疫组化法进行鉴定。将ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA瞬时转染细胞,48 h后给予缺氧6 h处理。实验分为5组:(1)空白对照组;(2)缺氧组;(3)缺氧+阴性对照shRNA组;(4)缺氧+ROCK1-shRNA组;(5)缺氧+ROCK2-shRNA组。用倒置显微镜观察心肌细胞搏动频率与节律;用全自动生化分析仪测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量;用MTT检测细胞存活率;用流式细胞仪检测细胞凋亡率;用Western blotting检测ROCK1和ROCK2的表达,并检测caspase-3和p-PI3K的表达情况。结果: 鉴定证实大鼠心肌细胞原代培养成功。缺氧损伤后心肌细胞搏动频率较对照组明显减慢,搏动幅度减弱,节律不规整(P<0.01),而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用(P<0.05或P<0.01)。全自动生化分析仪检测发现,缺氧能导致细胞培养液LDH含量升高(P<0.01),而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用(P<0.01)。MTT检测发现,缺氧能导致心肌细胞存活率降低(P<0.05),而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用(P<0.05)。流式细胞仪检测发现,缺氧能导致心肌细胞凋亡率升高(P<0.01),而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用(P<0.05或P<0.01)。Western blotting检测发现,ROCK1-shRNA的转染能降低ROCK1的表达(P<0.05), ROCK2-shRNA的转染能降低ROCK2的表达(P<0.01);缺氧能导致caspase-3表达升高(P<0.05)、p-PI3K表达降低(P<0.01),ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用(P<0.05或P<0.01)。结论: ROCK1和ROCK2表达下调能抑制缺氧损伤导致的大鼠心肌细胞凋亡,其机制与抑制caspase-3活化和增强p-PI3K的表达有关。     

9型腺相关病毒介导RNA干扰抑制p65基因表达对血管紧张素Ⅱ诱导H9c2细胞凋亡的影响

目的:以9型腺相关病毒(AAV9)介导的RNA干扰抑制大鼠心室肌H9c2细胞中p65基因表达,研究其在血管紧张素II(Ang II)诱导下对H9c2细胞凋亡的影响,并阐明其可能机制。方法:分别将r AAV9-eGFP及r AAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA按转染复数(MOI)=4×106vg/cell转染至H9c2细胞,在荧光倒置显微镜下观察e GFP的阳性表达情况,采用流式细胞术检测其转染效率,并用Western blot法分析p65的表达情况。CCK-8法检测病毒对H9c2细胞活力的影响。流式细胞术分析各组细胞的凋亡情况。结果:病毒转染48 h后e GFP开始有表达,并且表达强度随着时间延长而增加,第5天达最高值,此时流式细胞术检测转染率为(52. 7±1. 9)%。与空白组相比,转染病毒后H9c2细胞的活力无明显变化。静息状态下H9c2细胞的NF-κB p65有一定活性,给予Ang II刺激后NF-κB p65的活性明显增高,而转染r AAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA可有效抑制NF-κB p65的活性。流式细胞术检测发现Ang II刺激组的凋亡程度明显高于空白组,而r AAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA组的细胞凋亡明显受到抑制。结论:通过r AAV9介导的RNA干扰能有效抑制H9c2细胞NF-κB p65基因的表达;抑制p65基因表达对H9c2细胞活力无明显抑制,但能减少Ang II诱导下的细胞凋亡。