血管生成素4对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的影响

 目的：观察血管生成素4（Ang-4）对脂多糖(LPS）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）损伤的影响,并探讨其可能的作用机制。方法：EnVision法免疫组化鉴定HUVECs。LPS诱导细胞损伤,不同剂量的Ang-4干预。显微镜下观察细胞形态,MTT法检测细胞活力,ELISA法检测von Willebrand因子（vWF）和肿瘤坏死因子（TNF-α）含量,real-time PCR检测Toll样受体4（TLR4）、核因子κB（NF-κB） p65和TNF-α mRNA含量变化。结果：免疫组化示胞浆内人Ⅷ因子相关抗原呈阳性;与正常组比,LPS组细胞增殖活力降低（P<0.01）,vWF及TNF-α分泌增多(P<0.01),且TLR4、NF-κB p65和TNF-α mRNA表达升高(P<0.01);Ang-4（100 μg/L）组可恢复细胞活力,降低vWF及TNF-α含量(P<0.01),抑制LPS所致TLR4、NF-κB p65和TNF-α mRNA的表达(P<0.01)。结论：Ang-4可拮抗LPS诱导的HUVECs损伤,这可能与抑制TLR4-NF-κB p65-TNF-α信号通路的活化有关。     

白细胞介素-13对肾小球系膜细胞炎症反应的拮抗作用

目的:探讨白细胞介素-13(IL-13)对肾小球系膜细胞(MC)炎症反应的调节作用。方法:ELISA法测定体外培养MC上清中TNF-α浓度。流式细胞术检测MC膜表面ICAM-1表达。逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)评估MCTNF-αmRNA及ICAM-1mRNA表达。结果:未受刺激的MC无TNF-αmRNA及其蛋白表达。经脂多糖(LPS)(10mg/L)刺激后,MC可高表达TNF-αmRNA及其蛋白。IL-13浓度为1μg/L、10μg/L时显著抑制LPS诱导MC表达TNF-αmRNA及其蛋白。IL-13(0.1μg/L)无抑制作用,IL-13(100μg/L)时完全抑制LPS诱导MC分泌TNF-α。无任何刺激时,MC低表达ICAM-1。TNF-α(100μg/L)诱导MC高表达ICAM-1mRNA及其蛋白。IL-13(10μg/L)和TNF-α(100μg/L)共作用MC,各时点均显示IL-13对TNF-α诱导MC表达ICAM-1mRNA及蛋白有抑制作用。结论:IL-13既抑制LPS刺激MC分泌TNF-α,也抑制TNF-α诱导MC表达膜糖蛋白ICAM-1。提示IL-13能从多个环节抑制MC的炎症反应。     

TLR4激动对内皮细胞粘附功能的影响及阿托伐他汀的干预研究

目的：观察Toll样受体4（TLR4）激动对脐静脉内皮细胞（HUVECs）氧化低密度脂蛋白受体LOX-1的调节和对单核细胞与HUVECs粘附率的影响，以及LOX-1在内皮细胞粘附功能中的作用，并观察阿托伐他汀的干预作用方法：RT-PCR方法检测TLR4、LOX-1 mRNA表达水平，流式细胞术检测TLR4、LOX-1蛋白表达水平，细胞计数法计算单核细胞与HUVECs粘附率。结果：脂多糖(1 mg/L) 孵育24 h上调HUVECs TLR4、LOX-1 mRNA和蛋白的表达，增加单核细胞与HUVECs粘附率,抗LOX-1抗体部分抑制LPS介导的单核细胞与HUVECs粘附率的增加，阿托伐他汀（10 μmol/L）抑制脂多糖介导的上述效应。结论：TLR4激动上调LOX-1表达及增加内皮细胞粘附功能，LOX-1在LPS介导的单核内皮细胞粘附功能中起部分作用，阿托伐他汀可能通过抑制TLR4表达及TLR4 介导的LOX-1表达而发挥其内皮细胞保护作用。     

油酸调节人血管平滑肌细胞TLR4的增殖活性及炎性因子的表达

目的 探讨油酸对人主动脉血管平滑肌细胞TLR4及炎性因子表达的调节作用.方法 MTT法检测细胞增殖活性;实时荧光定量PCR法检测TLR4及炎性因子mRNA的表达;Western blot法检测细胞TLR4蛋白表达,ELISA法检测炎性因子蛋白含量.结果 油酸促进人主动脉血管平滑肌细胞增殖活性,增加油酸浓度,抑制细胞增殖.油酸上调TLR4、IL-6、IL-8和MCP-1 mRNA表达最大幅度为6.5、7.4、7.4和7.1倍.IL-6、IL-8和MCP-1蛋白表达最大上调幅度为2.16、1.93和2.06倍.200 μmol/L组TLR4蛋白表达的吸光度值为(1.70±0.62),与对照组(0.29 ±0.22)比较P＜0.05.LPS组TR4、IL-6、IL-8和MCP-1的表达明显增加(P＜0.05).结论 油酸促进人主动脉血管平滑肌细胞TLR4及炎性因子mRNA及蛋白表达.     

蝮蛇毒血小板抑制因子减轻LPS诱导的内皮细胞损伤

目的:探讨蝮蛇毒血小板抑制因子(AHV-PI)对体外脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)损伤的影响及其作用机制。方法:体外培养HUVECs,运用LPS(1 mg/L)诱导HUVECs炎症损伤模型,实验分为空白对照组、LPS组、AHV-PI组和AHV-PI+LPS组。MTT比色法检测HUVECs的活力,倒置显微镜观察HUVECs的形态变化,筛选出AHV-PI最适浓度为5 mg/L。流式细胞术检测细胞凋亡;免疫组化法观察胞内组织型纤溶酶原激活物(T-PA)以及纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)表达情况;ELISA法检测HUVECs上清液中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和组织因子(TF)含量;免疫荧光染色检测胞核内NF-κB亚基p65激活转位情况。结果:LPS组细胞明显梭形化,长宽比增大,呈成纤维细胞状,胞浆出现颗粒样物质。AHV-PI浓度低于5 mg/L时对HUVECs的活性和形态没有明显影响,但可减轻LPS引起的HUVECs的活力抑制和形态改变。与对照组比较,LPS组上清液中TF和ICAM-1含量升高,胞内T-PA和PAI-1表达减少;与LPS组相比,AHV-PI+LPS组上清液中TF和ICAM-1的含量显著降低,细胞内T-PA和PAI-1表达增多,细胞核内NF-κB p65表达减少。结论:AHV-PI能减轻HUVECs损伤,其保护机制与抑制细胞因子分泌及NF-κB活化有关。     

Caveolin-1在17β-雌二醇对抗脂多糖诱导的血管平滑肌细胞MCP-1表达中的作用

目的:旨在观察小窝蛋白-1(caveolin-1)在17β-雌二醇(E2)抑制脂多糖(LPS)诱导的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)分泌单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)中的作用。方法:原代培养VSMCs,以不同浓度E2(10-9-10-6mol/L)干预LPS诱导的MCP-1的分泌,ELISA法检测MCP-1生成的变化。分别使用caveo-lin-1的阻断剂β-甲基环糊精(β-MCD)以及特异性caveolin-1 siRNA抑制caveolin-1表达,W estern b lotting法检测caveolin-1蛋白表达的变化。结果:LPS浓度和时间依赖地诱导MCP-1的表达,不同浓度E2(10-9-10-6mol/L)抑制LPS诱导的MCP-1的表达;分别使用β-MCD以及caveolin-1 siRNA抑制caveolin-1的表达,能抑制LPS诱导的MCP-1的表达,而E2(10-6-10-9mol/L)又可以抑制caveolin-1的表达。结论:E2抑制LPS诱导的血管平滑肌细胞MCP-1的表达,caveolin-1是这一抑制作用的中间环节。     

MEK1/2在脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞ICAM-1表达中的作用

目的：探讨MEK1/2在脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）ICAM-1表达中的作用。 方法： 用不同浓度LPS或LPS加MEK1/2特异性抑制剂PD98059和HUVECs孵育不同时间后，分别采用RT-PCR和Western blotting检测ICAM-1 mRNA和蛋白的表达。 结果： LPS呈时间-浓度依赖性地上调HUVECs ICAM-1 mRNA和蛋白的表达。LPS预处理后2 h，HUVECs ICAM-1 mRNA和蛋白的表达即开始升高，LPS(100 μg·L-1)作用后6 h,ICAM-1 mRNA和蛋白的表达基本达到高峰；PD98059(10 μg·L-1)可显著抑制LPS(100 μg·L-1)诱导6 h的ICAM-1 mRNA和蛋白的表达，抑制率分别为54.4%和44.9%（P<0.01 vs LPS）。 结论： 调控MEK1/2通路可能为内毒素休克诱导血管内皮损伤的防治提供新的策略。     

硫化氢抑制大鼠急性心肌缺血引起的细胞炎症反应

 目的：探讨硫化氢（H2S）能否抑制大鼠急性心肌缺血引起的细胞炎症反应。方法：结扎大鼠左冠状动脉前降支4 h,引起心肌缺血损伤。健康雄性SD大鼠随机分为假手术组（sham）、缺血组（ischemia）以及硫氢化钠(NaHS) 5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L组。NaHS组分别于心肌急性缺血2 h时更换为5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L NaHS灌流液。缺血后4 h记录心功能变化。实时荧光定量PCR检测离体心肌组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和ICAM-1 mRNA表达;Western blotting检测离体心肌组织中NF-κB的表达。结果：Ischemia组离体心肌功能下降（与sham组相比P<0.01）,NaHS组离体心肌功能比ischemia组明显改善（P<0.05或P<0.01）。Ischemia组离体心肌组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和ICAM-1 mRNA表达显著增强,IL-10 mRNA表达显著降低（与sham组相比P<0.01）;NaHS组离体心肌组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和ICAM-1 mRNA表达比ischemia组明显降低,NaHS 10 μmol/L,20 μmol/L组离体心肌组织中IL-10 mRNA表达比ischemia组明显升高（P<0.05或P<0.01）。与sham组相比,ischemia组NF-κB表达显著增加（P<0.01）,而NaHS 10 μmol/L和20 μmol/L组NF-κB的表达明显低于ischemia组（P<0.05或P<0.01）。结论：H2S可通过阻断NF-κB相关信号通路的转导,抑制炎症反应,明显改善大鼠急性心肌缺血损伤。     

米诺环素调控P2X7受体抑制BV-2细胞活化的研究*

 目的：探索P2X7受体在米诺环素(Mino)抑制脂多糖（LPS）刺激的BV-2细胞活化中的作用。方法：将体外培养的BV-2细胞分为5组：空白对照组、LPS处理组、LPS+ 0.1 μmol/L Mino组、LPS+ 1 μmol/L Mino组和LPS+ 10 μmol/L Mino组。分组处理8 h后行real-time PCR检测P2X7受体mRNA表达;处理24 h后观察各组细胞形态学变化,Western blotting检测P2X7受体蛋白表达,取细胞培养液上清行ELISA检测TNF-α和IL-1β的分泌情况。结果：经LPS处理后,BV-2细胞P2X7受体mRNA及蛋白的表达均升高,细胞培养液上清的TNF-α和IL-1β表达升高,同时伴有形态学的改变,而0.1～10 μmol/L Mino能抑制这一趋势,差异有统计学意义（P<0.01）。 结论： Mino抑制BV-2细胞活化的机制可能与抑制P2X7受体的活性相关。     

烟酸姜黄素酯抑制LP S 诱导的HUVECs分泌炎性细胞因子与内质网应激

目的探讨烟酸姜黄素酯(NC)对LPS诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分泌细胞因子的影响及其作用机制。方法体外培养HUVECs,用不同浓度NC孵育HUVECs 24 h。Western blot检测AMPK的磷酸化;用siRNA沉默磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)表达后,观察其对脂多糖(LPS)诱导NF-κB p65磷酸化、黏附分子表达、细胞培养上清中TNF-α和MCP-1分泌,以及内质网应激标志分子IRE-1、eIF2α和CHOP表达水平的影响。结果 10～20μmol/L NC处理HUVECs 24 h后,AMPK的磷酸化水平显著增高(P0.05),同时p65磷酸化有所减轻。沉默AMPK后,NC对NF-κB的抑制效应明显减弱(P0.05)。同时,NC处理后,LPS所致ICAM-1,VCAM-1和E选择素等黏附分子表达明显降低(P0.05),单核巨噬细胞THP-1与HUVECs的黏附作用也明显减轻,培养上清中TNF-α和MCP-1明显减少(P0.05)。siRNA沉默AMPK后,上述效应有所减弱(P0.05)。NC处理后可下调LPS所致的内质网应激标志分子IRE-1、eIF2α和CHOP的表达水平。而干扰AMPK表达后,可明显削弱NC对这些分子的抑制效应(P0.05)。结论 NC可抑制LPS诱导HUVECs表达和分泌黏附分子及细胞因子,并在一定程度上抑制内质网应激,其机制可能与激活AMPK有关。     

阿米福汀对苯并[a]芘诱导腹主动脉瘤形成的作用

目的:研究阿米福汀对苯并[a]芘(Ba P)诱导C57BL/6J小鼠腹主动脉瘤(AAA)形成的作用,并探讨相关机制。方法:体外培养RAW264.7单核巨噬细胞,分为正常对照组,溶剂对照组(即DMSO组),Ba P组,低剂量(1μmol/L)阿米福汀组,中剂量(5μmol/L)阿米福汀组及高剂量(25μmol/L)阿米福汀组,应用Western blot法检测体外培养的RAW264.7单核巨噬细胞基质金属蛋白酶(MMP)-9、MMP-12、TNF-α、NF-κB表达。48只C57BL/6J小鼠(8月龄,雄性)随机分为对照组、模型组(AngⅡ+Ba P组)、低剂量(50 mg/kg)阿米福汀组、高剂量(100 mg/kg)阿米福汀组。6周后取腹主动脉察看标本形态;行HE、Masson染色观察血管形态结构;测定腹主动脉的血管周长。Western blot、免疫组化法评价腹主动脉组织中的巨噬细胞浸润情况及MMP-9、MMP-12、TNF-α、NF-κB的表达。结果:Western blot发现Ba P刺激使巨噬细胞MMP-9、MMP-12、TNF-α、NF-κB的表达升高,而阿米福汀对此有显著抑制作用,且呈剂量依赖性(P0.05)。动物实验可见对照组成瘤率为0,高剂量阿米福汀组成瘤率为16.67%,与模型组(58.33%)和低剂量阿米福汀组(33.33%)相比显著降低(P0.05)。免疫组化结果显示高剂量阿米福汀组腹主动脉壁的巨噬细胞浸润程度及TNF-α、MMP-9、MMP-12、NF-κB的表达较模型组和低剂量阿米福汀组相比显著下降(P0.05)。Western blot实验结果证实高剂量阿米福汀组腹主动脉壁TNF-α、MMP-9、MMP-12、NF-κB的表达较模型组和低剂量阿米福汀组相比显著下降(P0.05)。结论:阿米福汀可以抑制Ba P诱导的巨噬细胞的活化,同时可以抑制Ba P诱导的小鼠腹主动脉瘤发生、发展,其机制可能跟抑制NF-κB途径、巨噬细胞浸润及MMPs、TNF-α的表达有关。     

血管紧张素-(1-7)通过抑制TLR4激活和坏死性凋亡的相互作用对抗高糖引起的H9c2心肌细胞损伤

目的:研究血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]能否通过抑制Toll样受体4(TLR4)激活和坏死性凋亡的相互作用对抗高糖(HG)引起的H9c2心肌细胞损伤。方法:应用Western blot检测心肌细胞受体相互作用蛋白3(RIP3;反映坏死性凋亡的指标)和TLR4的表达水平;CCK-8法测定心肌细胞存活率;用试剂盒检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性;ELISA检测细胞培养液中白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌水平;双氯荧光素染色法测定细胞内活性氧簇(ROS)水平;罗丹明123染色法测定线粒体膜电位(MMP)。结果:HG(35 mmol/L葡萄糖)作用H9c2心肌细胞24 h可使RIP3的表达水平明显升高,应用30μmol/L TAK-242(TLR4抑制剂)和HG共处理心肌细胞24 h可抑制HG对RIP3的上调;另一方面,HG可上调TLR4的表达,100μmol/L坏死性凋亡的特异性抑制剂necrostatin-1(Nec-1)和HG共处理心肌细胞24 h可抑制HG对TLR4的上调;而1μmol/L Ang-(1-7)和HG共处理心肌细胞24 h能同时抑制HG对RIP3和TLR4的上调。此外,1μmol/L Ang-(1-7)、30μmol/L TAK-242或100μmol/L Nec-1与HG共处理心肌细胞均能对抗HG引起的心肌细胞损伤,细胞存活率升高,LDH活性降低,ROS生成和MMP丢失减少,同时IL-1β和TNF-α的分泌减少。结论:Ang-(1-7)通过抑制TLR4激活和坏死性凋亡的相互作用对抗高糖引起的H9c2心肌细胞损伤。     

蜂胶水提物对血管内皮细胞黏附分子表达的影响

目的:采用TNF-α诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUCECs)活化,观察蜂胶水提物(WEP)对血管内皮细胞黏附分子表达的影响,从而探讨蜂胶抗动脉粥样硬化的作用及其机制。方法:用50μg/L TNF-α诱导体外培养HUVECs损伤,用50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L WEP分别进行干预6 h、12 h、24 h,利用流式细胞仪检测HUVEC表面ICAM-1和VCAM-1表达。结果:与对照组比较,模型组ICAM-1和VCAM-1荧光强度明显升高(P0.01)。与模型组比较,100 mg/L WEP组和200 mg/L WEP组ICAM-1和VCAM-1荧光强度明显降低(P0.01)。不同浓度WEP组ICAM-1和VCAM-1荧光强度随WEP浓度的增加下调。析因分析结果显示,用200 mg/L WEP和氟伐他汀钠(FS)联合预处理组与单一药物预处理组比较,ICAM-1和VCAM-1活性明显降低(P0.01)。结论:WEP能够减少ICAM-1和VCAM-1的表达,且在一定的范围内,有随WEP浓度升高和作用时间延长效应增强的趋势。WEP与FS联合用药,对抑制ICAM-1和VCAM-1表达有协同作用。     

抗衰老Klotho蛋白对高糖作用下血管内皮细胞的保护作用

目的:研究抗衰老Klotho蛋白对高糖作用下血管内皮细胞的保护作用及其作用机制。方法:体外培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs),设置PBS对照组、5.5 mmol/L葡萄糖组、33.3 mmol/L葡萄糖组、0.1μmol/L Klotho+33.3 mmol/L葡萄糖组、1μmol/L Klotho+33.3 mmol/L葡萄糖组和10μmol/L Klotho+33.3 mmol/L葡萄糖组。使用MTT法检测各组细胞活力;同时检测各组细胞培养上清中丙二醛(MDA)的含量以及乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)的活性;流式细胞术检测各组细胞中活性氧(ROS)含量变化;ELISA检测各组细胞培养液中一氧化氮(NO)、内皮素1(ET-1)和细胞间黏附分子1(ICAM-1)的浓度变化;Western blot法检测各组细胞中核因子κB(NF-κB)蛋白的表达。结果:与PBS对照组相比,33.3 mmol/L葡萄糖能够显著降低HUVECs的细胞活力,增加细胞中ROS的含量,增加细胞培养上清中LDH活性和MDA含量,降低SOD和GSH的活性,同时降低NO分泌,诱导ET-1、ICAM-1分泌及细胞中NF-κB蛋白的表达(P0.05)。不同浓度Klotho蛋白和33.3 mmol/L高糖同时作用HUVECs时,细胞活力逐渐上升,ROS和MDA含量以及LDH活性逐渐下降,SOD和GSH活性则逐渐上升,同时NO分泌增加,ET-1、ICAM-1分泌及NF-κB蛋白表达显著下降(P0.05)。结论:抗衰老Klotho蛋白能够提升高糖作用下HUVECs的细胞活力,减少高糖诱导的ROS生成及氧化损伤,恢复HUVECs的正常分泌功能,并通过减少NF-κB蛋白表达发挥抗损伤作用。     

青蒿素减轻LPS诱导的肠上皮细胞屏障功能损伤的实验研究

目的:探究青蒿素对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的大鼠肠上皮IEC-6细胞屏障功能损伤的影响。方法:体外培养IEC-6细胞,随机分为5组:对照组、LPS(100 mg/L)组和LPS+青蒿素(30、50和100μmol/L)组,MTT法检测各组细胞毒性变化,ELISA检测各组细胞分泌炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平的变化,电阻仪检测肠上皮细胞跨上皮电阻(TER),酶标仪检测单层细胞对辣根过氧化物酶(HRP)的通透性,RT-qPCR和Western blot检测各组细胞紧密连接蛋白(ZO-1、claudin-1和occludin)以及TLR4/My D88/NF-κB mRNA和蛋白表达的变化。结果:LPS与青蒿素在本实验浓度范围对IEC-6细胞均无毒性。与对照组相比,LPS处理下,细胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6水平以及TLR4/My D88/NF-κB的mRNA和蛋白表达明显增加,ZO-1、claudin-1和occludin的mRNA和蛋白表达降低。而青蒿素干预下,细胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6水平以及TLR4/My D88/NF-κB mRNA和蛋白表达明显降低,ZO-1、claudin-1和occludin的mRNA和蛋白表达升高(P0.05),均呈现浓度依赖性。结论:青蒿素可能通过抑制TLR4/My D88/NF-κB通路减轻LPS诱导的肠上皮细胞屏障功能损伤。     

咪唑克生对体外血脑屏障炎症模型通透性的影响

目的:观察咪唑克生(idazoxan,IDA)对体外血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)炎症模型的通透性、紧密连接蛋白ZO-1表达和分布及基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)和MMP-9抑制物——金属蛋白酶组织抑制物-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)表达的影响。方法:采用培养7 d的小鼠脑微血管内皮细胞株b.End3建立体外BBB模型,采用TNF-α(10 nmol/L)处理24 h诱导BBB炎症模型,并对BBB炎症模型分别采用IDA 50、100、200μmol/L预处理6 h以观察IDA对BBB炎症模型的作用。通过检测异硫氰酸荧光标记的葡聚糖通过率来确立模型的通透性,采用Western blot法检测紧密连接蛋白ZO-1的表达,通过免疫荧光法观察ZO-1的分布情况,并通过RT-PCR法检测MMP-9/TIMP-1的表达。结果:培养7 d的b.End3细胞汇合成稳定的单层连接,有较好的屏障功能,而采用TNF-α处理24 h后诱导的BBB炎症模型的通透性明显升高,紧密连接蛋白ZO-1在膜上的表达明显减少、不连续,Western blot法显示ZO-1蛋白表达水平明显下降,MMP-9的表达明显升高;而采用IDA 50、100、200μmol/L预处理6 h能明显降低其通透性,增加ZO-1蛋白的表达和改善ZO-1的分布异常,降低MMP-9的表达,其中200μmol/L IDA作用最明显,差异有统计学意义(P0.01)。结论:IDA能够直接作用于脑血管内皮细胞,降低TNF-α诱导的体外BBB炎症模型MMP-9的表达,增加紧密连接蛋白ZO-1的表达、修复紧密连接ZO-1的异常分布,从而改善其异常增高的通透性。     

ATP敏感性钾通道的开放通过抑制TLR4/NF-κB通路对抗高糖引起的H9c2心肌细胞损伤和炎症

目的:探讨开放ATP敏感性钾通道(K_(ATP)通道)能否抑制Toll样受体4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)通路对抗高糖(HG)引起的H9c2心肌细胞损伤和炎症。方法:应用Western blot测定TLR4和NF-κB p65的蛋白水平;应用ELISA法检测细胞培养液中白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平;采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)测定心肌细胞存活率;罗丹明123染色荧光显微镜照相法测定线粒体膜电位(MMP);双氯荧光素染色荧光显微镜照相法测定细胞内活性氧簇(ROS)水平;Hoechst 33258核染色荧光显微镜照相法检测凋亡细胞数量。结果:H9c2心肌细胞经HG(35 mmol/L葡萄糖)处理24 h,胞内TLR4和磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)的蛋白水平明显增加,100μmol/L K_(ATP)通道开放剂二氮嗪(DZ)预处理30 min可抑制HG对TLR4和p-NF-κB p65蛋白水平的上调作用;此外,30μmol/L TAK-242(TLR4抑制剂)和HG共处理心肌细胞24 h也可减轻HG对p-NF-κB p65的上调作用。另一方面,100μmol/L DZ预处理有明确的心肌保护作用,可抑制HG引起的细胞毒性、炎症反应、线粒体损伤、氧化应激和细胞凋亡,使细胞存活率升高,并减少IL-1β和TNF-α分泌水平、MMP丢失、ROS生成及凋亡细胞数量;而30μmol/L TAK-242或100μmol/L PDTC(NF-κB抑制剂)共处理心肌细胞24 h也可发挥和DZ相类似的作用,能抑制HG引起的上述损伤和炎症反应。结论:开放K_(ATP)通道可通过抑制TLR4/NF-κB通路对抗HG引起的H9c2肌细胞损伤和炎症。     

C反应蛋白对人外周血CD14单核细胞TLR4信号转导的影响

目的: 观察C反应蛋白(CRP)对CD14⁺单核细胞Toll样受体4(TLR4)表达的影响,以探讨CRP在急性冠脉综合征(ACS)致炎机制中的作用。方法: 不同浓度(5、25、50、100 mg/L)和不同作用时间(6、12、24、48 h)的CRP刺激正常人外周血CD14⁺单核细胞,或者不同浓度TLR4抑制剂预先干预CD14⁺单核细胞后,再给予CRP刺激。应用流式细胞仪检测细胞表面TLR4蛋白的表达,定量PCR方法检测TLR4 mRNA和髓样分化蛋白2(MD-2)mRNA表达,ELISA检测刺激前后细胞上清液肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、金属蛋白酶9(MMP-9)水平。结果: CRP可剂量依赖和时间依赖地增加CD14⁺单核细胞表达TLR4和MD-2,高浓度TLR4抑制剂可完全阻断CRP对TLR4、MD-2的影响。TNF-α、IL-6、MMP-9与TLR4、MD-2也呈现相同的变化。结论: CRP可激活正常人CD14⁺单核细胞TLR4信号转导途径,并诱导产生TNF-α、IL-6、MMP-9,提示CRP可作为病原相关分子模式(PAMP),通过TLR4模式受体介导而产生炎症反应,参与动脉粥样硬化形成,促进ACS炎症的发展。