汉坦病毒诱导人脐静脉内皮细胞HSP70的表达及意义

目的: 研究人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)感染汉坦病毒(Hantavirus, HTV)后应激反应的规律及意义。方法: 采用免疫细胞化学染色法和核酸分子原位杂交, 检测热休克蛋白 70(HSP70)的表达; 用RT --PCR观察HSP70mRNA水平变化的规律。结果: HTV感染HUVEC后, 免疫细胞化学染色法可检出HSP70呈高表达, 原位杂交发现细胞质内有HSP7mRNA的阳性信号。感染后不同时间点RT- PCR的结果表明与对照组相比较, HSP70mRNA的水平在感染后迅速升高并持续高表达 (P<0. 05 )。结论: HTV可诱导HUVEC高表达HSP70。HSP70可能具有抑制病毒复制和保护内皮细胞的作用。     

雌激素对人脐静脉内皮细胞HSP27表达的影响

目的：观察人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）中热休克蛋白27（HSP27）表达在雌激素（estrogen,E）诱导下的改变。方法：分别用10–9 M、10–8 M、10–7 M雌二醇（estradiol,E2）以及10–6 M雌激素受体拮抗剂他莫昔芬（tamox ifen）处理HUVEC后,采用Western blot法和RT-PCR法检测HUVEC中HSP27蛋白和m RNA的表达水平。结果：与对照组相比,无论是蛋白水平还是m RNA水平,10–9 mol/L E2对HUVEC中HSP27表达没有明显影响;10–8、10–7 mol/L E2诱导HUVEC中HSP27表达逐渐增加（P〈0.05）;而HUVEC与10–6 M他莫昔芬、10–7 M雌二醇共同孵育,其HSP27水平和单纯10–7 M雌二醇处理相比明显减少（P〈0.05）。结论：外源性E2能诱导HUVEC中HSP27的表达,呈剂量依赖性。他莫昔芬能阻断E2的这种上调HSP27的作用,提示雌激素诱导内皮细胞HSP27的表达依赖ER。     

硫化氢通过调节Sirt1/eNOS信号通路延缓人脐静脉内皮细胞衰老

目的:我们既往研究已证实外源性硫化氢能够延缓内皮细胞衰老,本研究拟进一步探讨沉默信息调节因子1(Sirt1)与内皮型一氧化氮合酶(e NOS)系统对硫化氢抗内皮细胞衰老作用的影响。方法:建立葡萄糖(33 mmol/L)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)衰老模型,根据细胞活力、衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色阳性率和纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)的表达水平评估HUVECs衰老;同时采用RNA干扰技术抑制Sirt1蛋白表达,检测e NOS表达及衰老相关指标。结果:HUVECs经高糖处理后,细胞活力减低,SA-β-Gal阳性细胞比例增加,PAI-1表达增高,Sirt1及e NOS表达均明显减少(P0.05);与高糖处理组比较,100μmol/L硫氢化钠(硫化氢供体)处理组的细胞活性增加,SA-β-Gal染色阳性细胞比例及PAI-1蛋白表达显著下降,Sirt1及e NOS蛋白表达增加,NO含量增加(P0.05)。与硫化氢处理组比较,Sirt1 siRNA处理后e NOS表达减少,PAI-1表达增加,SA-β-Gal染色阳性细胞数目增多,NO含量减少(P0.05或P0.01)。结论:硫化氢通过上调Sirt1、增加e NOS表达而促进NO的合成,从而抵抗高糖诱导的HUVECs衰老。     

SIRT1/eNOS/NO通路在人参皂苷Rb1抗内皮细胞复制性衰老中的作用

目的:观察人参皂苷Rb1延缓人脐静脉内皮细胞(HUVECs)复制性衰老的作用,并探讨SIRT1/e NOS/NO通路在其中的作用机制。方法:建立原代HUVECs复制性衰老模型,根据细胞形态的变化、衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色阳性率和纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)的表达水平评估HUVECs衰老情况;采用real-time PCR方法和Western blot法检测沉默SIRT1前后衰老细胞中e NOS和PAI-1的mRNA和蛋白表达,并检测细胞上清NO的含量。结果:累积细胞群体倍增水平(CPDL)为16的HUVECs可作为复制性衰老模型; 80μmol/L人参皂苷Rb1处理后衰老细胞内SIRT1和eNOS的mRNA及蛋白表达水平增加,NO含量增加(P 0. 05),而PAI-1的mRNA和蛋白表达水平下降(P 0. 05);沉默SIRT1后,衰老细胞内e NOS的mRNA及蛋白表达减少,PAI-1的mRNA及蛋白表达增加,NO含量减少(P 0. 05);与SIRT1沉默组比较,在沉默SIRT1基础上加用人参皂苷Rb1后,e NOS和PAI-1表达水平及NO的含量未见明显变化。结论:人参皂苷Rb1可通过调控SIRT1/e NOS/NO通路延缓HUVECs复制性衰老。     

尼古丁促人脐静脉内皮细胞凋亡

目的研究不同浓度尼古丁对人脐静脉内皮细胞的促凋亡作用及作用机制。方法体外培养人脐静脉内皮细胞,根据尼古丁浓度分组为10-6、10-7和10-8mol/L组及对照组。尼古丁作用24 h后,用CCK-8法检测细胞增殖,Annexin V-FITC荧光双染色法检测细胞凋亡。Western blot检测Bax、Bcl-2和PARP-1蛋白表达,对其作用机制进行研究。结果与对照组相比,10-6、10-7mol/L尼古丁组细胞增殖活性下降(P0.05);凋亡数目增多(P0.01)。促凋亡蛋白Bax的表达量增加(P0.01);抑凋亡蛋白Bcl-2表达明显减少(P0.01);PARP-1表达增加(P0.01)。结论一定浓度的尼古丁对血管内皮细胞具有促凋亡作用,加速动脉粥样硬化性疾病的发生发展。     

糖化白蛋白对人脐静脉内皮细胞MCP-1表达的影响及其机制研究

目的:探讨糖化白蛋白对内皮细胞中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达的影响及其机制。方法:将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)与不同浓度的糖化白蛋白共同培养,并用糖基化产物抑制剂氨基胍(AG)和抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)干预。分别用免疫细胞化学和夹心ELISA方法测定细胞MCP-1的表达,硫代巴比妥酸法和黄嘌呤氧化酶法测定细胞内丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性。结果:糖化白蛋白促进HUVECs合成和分泌MCP-1。免疫细胞化学显示,HUVECs暴露于50mg/L糖化白蛋白后,随作用时间的延长(4 h、8 h、12h),MCP-1的表达增高(P0.01),分别为对照组的1.3、1.9和2.8倍(P0.01);糖化白蛋白能引起细胞内超氧化物歧化酶活性下降(P0.05)和丙二醛含量升高(P0.01)。氨基胍和N-乙酰半胱氨酸能抑制糖化白蛋白刺激内皮细胞表达MCP-1(P0.01),N-乙酰半胱氨酸能抑制糖化白蛋白对内皮细胞内超氧化物歧化酶和丙二醛的影响(P0.05)。结论:糖化白蛋白可刺激人类内皮细胞表达MCP-1,糖化白蛋白刺激MCP-1表达与其诱导细胞内氧化应激有关。     

人脐静脉内皮细胞受剪切力作用后原癌基因c-fos和c-myc蛋白的表达

本文的研究目的是揭示不同的流动剪切力对体外培养的人脐静脉内皮细胞c-fos和c-myc蛋白表达的不同影响。我们利用平行板流动小室装置控制剪切力大小和持续时间。然后用免疫组织化学方法对受剪切力作用后的内皮细胞进行染色并进行图像分析。得以一些重要结果。c-fos蛋白表达在静态时非常低，4dynes/cm^2和10dynes/cm^2的剪应力都可诱导c-fos蛋白水平迅速增加，尤其是10dynes/cm^2的剪应力。并随时间的增加而增加，到1.0h达到高峰，随后下降，2.5h时接受基础水平。c-myc蛋白在静态时表达也非常低，经剪切力作用后缓慢增加，c-myc蛋白水平明显较c-fos低，而且剪应力为4dynes/cm^2和10dynes/cm^2两种情况对c-myc蛋白表达的影响基本无差异。其高峰在1.5h。随后下降，在2.5h时接受基础水平。结果表明人脐静脉内皮细胞c-fos蛋白表达具有对剪切力大小和时间的依赖性；c-myc蛋白表达具有时间依赖性。     

人参皂苷Rb1对白消安诱导人脐静脉内皮细胞表达PAI-1、TF和TGF-β1的影响

目的：探讨人参皂苷Rb1对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的保护作用机制。方法：体外培养HU—VECs，分别用白消安（BU）和人参皂苷Rb1干预，以RT—PCR、实时荧光定量PCR以及ELISA方法检测其PAI-1、TF和TGF—β1 mRNA和蛋白的表达。结果：60mg／LBU使HUVECs PAI-1、TF和TGF—β1蛋白水平明显增高及mRNA表达显著增强，80mg／L人参皂苷Rb1则可明显抑制BU对HUVECs的这种作用。结论：BU可能通过激活TGF—β1信号转导途径而上调PAI-1及TF的表达，增强HUVECs促凝活性；人参皂苷Rb1则可能通过抑制这一途径降低PAI-1及TF表达，保护HUVECs，纠正其高凝、低纤溶活性的异常状态。     

尼古丁对人脐静脉内皮细胞凋亡及坏死的影响

目的不同浓度尼古丁对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）凋亡及坏死的影响。方法用CD34以免疫组织化学法鉴定HUVECs。通过3种不同浓度的尼古丁（3、30、300 ng/ml）刺激HUVECs 24 h后,用流式细胞仪检测其凋亡及坏死率。结果低浓度尼古丁促进细胞凋亡最强,而随着尼古丁浓度的增加,细胞凋亡率反而逐渐降低,各组差异具有统计学意义（P〈0.05）;此外,随着尼古丁浓度增加,细胞坏死率也日益增多,各组差异具有统计学意义（P〈0.05）。细胞坏死率与尼古丁浓度呈正相关（r=0.675）。结论尼古丁对HUVECs凋亡的影响具有浓度依赖性,细胞坏死率与尼古丁浓度呈正相关。     

焦油和尼古丁对人脐静脉内皮细胞ICAM-1表达的影响

目的:观察焦油和尼古丁对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)细胞间粘附分子-1(ICAM-1)在表达的影响.方法:体外分离培养HUVECs,分别与不同浓度焦油(终浓度分别为1mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L和不同浓度尼古丁终浓度分别为(10-9 mol/L、10-7 mol/L、10-5 mol/L、10...     

小凹蛋白-1在脐静脉内皮细胞CaR介导NO生成中的作用和机制

目的: 探讨小凹蛋白-1(Cav-1)在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)钙敏感受体(CaR)介导NO生成中的作用和机制。方法: 利用转染技术将构建的 Cav-1 干扰质粒(Cav-1 shRNA)转染入HUVECs,随机分为:(1) 对照组;(2)CaR激动剂 (精胺)组;(3) 精胺+Ca²⁺组;(4) CaR负性变构调节剂(Calhex231)+精胺组;(5) Calhex231+精胺+Ca²⁺组;(6) 非律平(filipin)+精胺组;(7) filipin+精胺+ Ca²⁺组;(8)空质粒 (vehicle)+精胺+Ca²⁺组;(9) Cav-1 shRNA+精胺组;(10) Cav-1 shRNA+精胺+Ca²⁺组。Western blotting检测Cav-1 shRNA转染后HUVECs中CaR和Cav-1蛋白表达,通过NO荧光探针DAF-FM DA负载HUVECs检测细胞内NO的生成;并在提供充足底物的条件下检测细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性。结果: Cav-1 干扰后,Cav-1蛋白表达降低,同时 CaR的膜蛋白表达降低(P<0.05),CaR的浆蛋白表达无变化(P>0.05)。无论细胞外为零钙液或含钙液时,精胺(2 mmol/L)刺激CaR时均引起eNOS活性和NO含量增加(P<0.05),其中细胞外液为含钙液时,eNOS活性和NO含量增加较细胞外为零钙液时更明显(P<0.05),Calhex231 (1 μmol/L)可阻断(细胞外为零钙液)或降低(细胞外液为含钙液) 精胺介导的上述作用 (均P<0.05);此作用亦可被filipin (1.5 mg/L)或 Cav-1 基因沉默减弱(细胞外液为含钙液) (均P<0.05)。结论: HUVECs中Cav-1对CaR介导的NO生成有促进作用,其机制可能与Cav-1影响CaR膜定位及对激动剂反应性有关。     

小凹蛋白-1下调人脐静脉内皮细胞外钙敏感受体介导的钙内流的作用机制

 目的：研究小凹蛋白-1(Cav-1) 对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)细胞外钙敏感受体(CaR)介导钙内流的作用机制。方法：取2~3代HUVECs,采用细胞膜穴样凹陷(caveolae)结构破坏剂非律平（filipin）和甲基-β-环糊精(MβCD)及Cav-1基因沉默,配合CaR激动剂精胺（spermine）和负性变构调节剂Calhex 231。Fura-2/AM负载检测细胞内Ca2+浓度(［Ca2+］i)。Western blotting检测HUVECs中Cav-1以及CaR蛋白表达,免疫共沉淀技术检测Cav-1和CaR相互作用。用蔗糖密度梯度离心的方法提取并鉴定caveolae,Western blotting检测caveolae的标志蛋白Cav-1和浮舰蛋白1（flotillin-1）及CaR表达。 同时检测胞膜、胞浆和高尔基体标志蛋白：转铁蛋白受体(TfR)、β-肌动蛋白（β-actin）和β-外被体蛋白（β-COP）。检测富含Cav-1膜(CEM)区、非caveolae I区 (NCF I)和II区(NCF II)的Cav-1和CaR表达。结果：（1）细胞外液为含钙液时,Calhex 231完全阻断精胺刺激引起的［Ca2+］i升高(P<0.05),MβCD 可加强精胺升高［Ca2+］i的作用(P<0.05)。不同浓度MβCD 处理后各组Cav-1和CaR相互作用的差异无统计学意义(P>0.05);（2）免疫共沉淀结果显示,各组Cav-1和CaR蛋白表达的差异无统计学意义(P>0.05);（3）与control组比较,spermine+Ca2+组 、filipin+spermine+ Ca2+组和 MβCD+spermine+Ca2+组CEM区的 Cav-1和CaR蛋白表达均降低(P<0.05), NCF I区的 Cav-1和CaR蛋白表达增加(P<0.05),NCF II 区Cav-1蛋白表达增加(P<0.05),而CaR蛋白表达的差异无统计学意义(P>0.05)。结论：在HUVECs中,Cav-1和CaR共定位于同一caveolae区,同时Cav-1对CaR介导的Ca2+内流有下调作用,其机制可能与Cav-1抑制CaR膜定位、促使其向非caveolae区转位及减弱其对激动剂的反应性有关。     

伞枝犁头霉在体外诱导人血管内皮细胞凋亡

目的 研究伞枝犁头霉对人脐静脉血管内皮细胞活性的影响及其机制.方法 采用锥虫蓝染色法分析不同时间段伞枝犁头霉对人血管内皮细胞存活率的影响.细胞凋亡检测试剂盒在荧光显微镜下分析伞枝犁头霉诱导人血管内皮细胞的凋亡情况.流式细胞仪定量检测伞枝犁头霉诱导人血管内皮细胞在不同时间段的凋亡情况,并观察caspase-3抑制剂对凋亡反应的影响.用Western blot法检测伞枝犁头霉引发人血管内皮细胞caspase-3在不同时间段活化情况.结果 锥虫蓝染色法显示伞枝犁头霉以时间依赖的方式抑制人血管内皮细胞的存活率.伞枝犁头霉在共培养第12小时开始抑制人血管内皮细胞存活率(P=0.001).荧光显微镜显示伞枝犁头霉诱导人血管内皮细胞发生凋亡,而并非坏死.流式细胞仪分析显示伞枝犁头霉以时间依赖的方式诱导人血管内皮细胞发生凋亡反应.凋亡细胞在共培养第12小时显著增高(P=0.0036).Caspase-3抑制剂几乎可以完全逆转伞枝犁头霉诱导的凋亡反应.Western blot法显示伞枝犁头霉引起人血管内皮细胞caspase-3活化随时间逐渐增强.结论 伞枝犁头霉在体外试验中可以诱导人血管内皮细胞发生凋亡.该凋亡信号的传导是通过caspase级联反应.     

脂联素抗人脐静脉内皮细胞氧化损伤的作用研究

目的:研究脂联素（APN）对过氧化氢(H2O2)诱导人脐静脉内皮细胞 (HUVECs) 脂质过氧化的影响。方法：采用Annexin V-FITC标记后流式细胞检测方法观测H2O2引起的细胞凋亡情况。用硫代巴比妥酸微量法测定丙二醛(MDA),黄嘌呤氧化酶法测总超氧化物歧化酶(SOD),可见光法测过氧化氢酶(CAT）。体外自由基捕捉实验检测APN对超氧阴离子和羟自由基的清除率。结果：APN能明显抑制H2O2引起的细胞凋亡。APN预处理HUVECs后,H2O2（200 μmol/L,6 h）所致的细胞膜脂质过氧化反应明显减弱,MDA产生减少,CAT和SOD活性增加,但仅以APN孵育HUVECs对SOD和CAT活性没有明显的影响。结论：结果表明APN对超氧阴离子和羟自由基有明显的清除效果。APN通过抗脂质过氧化发挥抑制细胞凋亡,保护血管内皮细胞抵抗损伤的作用。     

肢体缺血预适应减轻人脐静脉内皮细胞的氧化应激损伤

 目的: 探讨肢体缺血预适应对氧化应激损伤的血管内皮是否具有保护作用。方法: 人脐静脉内皮细胞分为5组:对照组不加任何处理;模型组给予过氧化氢损伤2 h;早期肢体缺血预适应组、晚期肢体缺血预适应组和假肢体缺血预适组这3组分别用5%大鼠早期肢体缺血预适应血清、晚期肢体缺血预适应血清和假肢体缺血预适应血清孵育12 h,再用过氧化氢损伤2 h。检测细胞凋亡情况,培养液中乳酸脱氢酶的活性,内皮细胞表面黏附分子的mRNA水平,血红素氧合酶1的mRNA和蛋白表达情况。结果: 大鼠早期肢体缺血预适应和晚期缺血预适应血清可以减轻人脐静脉内皮细胞氧化应激所导致的细胞死亡,减少乳酸脱氢酶的释放,减少内皮细胞表面黏附分子的表达,并能增加血红素氧合酶1的mRNA和蛋白的表达。结论: 肢体缺血预适应可以减轻血管内皮细胞的氧化应激损伤。     

LPS、TNF-α、IL-1β对人脐静脉内皮细胞COX-2表达的影响

目的:探讨LPS、TNF-α、IL-1β对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)环氧合酶2(COX-2)表达及前列腺素(PGs)的影响。方法:在分离培养的HUVEC细胞给予LPS、TNF-α、IL-1β刺激24h后,采用原位杂交、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化检测HUVECCOX-2mRNA及蛋白的表达并观察了培养液前列腺素(PGs)的变化。结果:静息状态的HUVEC表达极少量的COX-2;受炎性刺激后,HUVEC大量表达COX-2mRNA及蛋白,同时伴有PGs的升高。结论:结果提示,静息状态下HUVEC表达极少量的COX-2,炎性刺激可诱发COX-2高表达和PGs升高,因此内皮细胞可通过COX-2的调节参与炎症反应。