葛根素对RAW264.7细胞破骨分化的影响

背景：葛根素是葛根中含有的一种黄酮类衍生物,其可以预防骨质疏松、促进新骨生成,有望成为治疗骨质破坏相关疾病的潜在药物。目的：观察葛根素对RAW264.7细胞破骨分化能力的影响,探究Notch信号通路在其中的调控作用。方法：将RAW264.7细胞分5组干预培养：对照组加入DMEM高糖培养基;破骨诱导组加入破骨诱导培养基(含巨噬细胞集落刺激因子与核因子κB受体活化因子配体的DMEM高糖培养基);低、中、高浓度葛根素组分别加入含10,25,50μmol/L葛根素的骨诱导培养基。培养7 d后,采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色及F-actin染色评估破骨细胞形成情况,RT-PCR检测破骨细胞形成相关基因的表达,Western blot及RT-PCR检测Notch信号通路相关指标表达。结果与结论：(1)抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示,与对照组比较,破骨诱导组破骨细胞形成能力升高(P <0.01);与破骨诱导组比较,低、中、高剂量葛根素组破骨细胞形成能力降低(P <0.05,P <0.01),且呈浓度依赖性;(2)F-actin染色显示,与对照组比较,破骨诱导组出现边界清晰的F-actin环...     

促进细胞内胆固醇流出抑制单核细胞源性泡沫细胞凋亡

目的：研究细胞内胆固醇流出对单核细胞源性泡沫细胞凋亡的影响。 方法： 用50 mg/L ox-LDL与RAW264.7细胞共同孵育建立泡沫细胞模型，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率，油红O观察细胞内脂滴的形成情况，用［3H］-胆固醇标记法检测细胞内胆固醇流出率，HPLC检测细胞内胆固醇含量。 结果： 用50 mg/L ox-LDL与RAW264.7细胞共同孵育48 h后，细胞内形成大量脂滴，细胞内胆固醇酯含量由(6.8±3.6)mg/g升至(101.7±4.5)mg/g,细胞凋亡率由8.14%升至42.6%（P<0.05）。HDL3处理组和β-环糊精处理组细胞内仅见少量脂滴，胆固醇流出率由（5.2±2.1）%分别升至（36.7±4.6）%和（42.2±3.1）%，细胞凋亡率由42.6%分别降至14.3%和12.0%（P<0.05）。 结论： HDL3、β-环糊精均可通过促进巨噬细胞内胆固醇流出从而抑制ox-LDL诱导的泡沫细胞凋亡。     

罗格列酮对RAW 264.7细胞源性泡沫细胞炎症反应及SOCS1和SOCS3表达的影响

 目的:观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）配体罗格列酮是否能够调节泡沫细胞促炎/抗炎反应以及细胞因子信号抑制物1（SOCS1）和细胞因子信号抑制物3（SOCS3）的表达。方法:采用ELISA法测定泡沫细胞培养液中肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白细胞介素(IL)-6和IL-10的水平,并计算TNF-α/IL-10和IL-6/IL-10的比值。采用RT-PCR及Western blotting技术分别观察RAW 264.7细胞源性泡沫细胞SOCS1和SOCS3 mRNA及蛋白的表达。结果:RAW 264.7细胞源性泡沫细胞组细胞培养液中TNF-α、IL-6和IL-10的水平以及TNF-α/IL-10和IL-6/IL-10的比值均明显高于对照组（control）组。而罗格列酮加入泡沫细胞培养液24 h后,TNF-α、IL-6和IL-10的浓度以及TNF-α/IL-10和IL-6/IL-10的比值均明显低于泡沫细胞组。Control组和泡沫细胞组只有少量SOCS1和SOCS3 mRNA及蛋白的表达,罗格列酮作用于泡沫细胞后SOCS1和SOCS3 mRNA及蛋白的表达均明显高于control组和氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)组。结论: 罗格列酮上调泡沫细胞SOCS1和SOCS3的表达,抑制泡沫细胞分泌TNF-α、IL-6和IL-10,调节了泡沫细胞促炎/抗炎反应。     

脂自噬通过减少巨噬细胞脂质含量抑制泡沫细胞形成

目的:观察泡沫细胞形成不同时间脂自噬的水平,探讨脂自噬是否参与调节泡沫细胞脂质含量从而抑制泡沫细胞的形成。方法:体外培养THP-1单核细胞,采用佛波酯诱导THP-1单核细胞48 h分化成为巨噬细胞,再用50 mg/L氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导形成泡沫细胞。油红O染色脂质观察泡沫细胞形成,计算脂质含量;采用胆固醇含量测定试剂盒测量泡沫细胞内的总胆固醇(TC)和游离胆固醇(FC)含量,计算胆固醇酯(CE)含量及CE/TC比值;胆固醇外流试剂盒检测泡沫细胞的胆固醇外流率;Western blot检测自噬相关蛋白5(Atg5)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)和P62的表达。荧光染料分别标记脂滴(LD)和LC3抗体,激光共聚焦显微镜检测细胞中LD与LC3的共定位以确定脂自噬水平,再分别采用自噬诱导剂雷帕霉素(Rap)和阻断剂3-甲基腺嘌呤(3MA)干预泡沫细胞,观察细胞内脂自噬水平、胆固醇含量及胆固醇外流的变化。结果:50 mg/L oxLDL作用24 h后细胞内LD大量聚集,CE/TC比值大于50%,泡沫细胞形成。泡沫细胞形成24 h内胆固醇外流率升高,在48 h胆固醇外流率下降(P&...     

RAW264.7细胞自噬相关circRNA检测及分析

目的探讨环状RNA（circRNA）表达谱在RAW264.7细胞自噬模型中的差异表达及其在细胞自噬过程中的调控作用。方法利用雷帕霉素（rapamycin, RAPA）和3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine, 3-MA）分别作用于小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞,建立自噬诱导模型和自噬抑制模型;提取各组细胞总RNA,基于高通量测序技术获得差异表达的circRNA;运用生物信息学分析对circRNA可能结合的微小RNA（miRNA）及其可能参与自噬的分子通路进行预测。结果在RAPA组和3-MA组中呈现相反表达趋势的circRNA共有42个,差异显著的前5个circRNA分别是circRNAmmu_circ₀000353、mmu_circ₀001704、mmu_circ₀013108、mmu_circ₀001528和mmu_circ₀015842,分别对其结合匹配值较高的...     

溶血卵磷脂对巨噬泡沫细胞胆固醇外流的影响

目的：探讨溶血卵磷脂（LPC）对巨噬泡沫细胞胆固醇外流的影响，为动脉粥样硬化（AS）的防治研究提供理论依据。方法：分离培养小鼠腹腔巨噬细胞，密度梯度超速离心法分离人血浆低密度脂蛋白（LDL），乙酰化后形成乙酰化低密度蛋白（AcLDL),用AcLDL负载巨噬细胞使之形成巨噬泡沫细胞模型。用酶学荧光法检测细胞胆固醇外流，用乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒检测培养基中LDH活性来反映LPC的细胞毒性。结果：LPC处理巨噬泡沫细胞24h后，培养基中胆固醇含量明显高于对照组（1．7－4倍），细胞内胆固醇含量明显低于对照组。且LPC引起细胞胆固醇外流增加同时，培养基中LDH活性并没有明显差异。结论：在10－80μmol/L剂量范围内，LPC可以剂量依赖性地促进巨噬泡沫细胞胆固醇外流，且这一效应与LPC的细胞毒性之间没有关系。     

溶血卵磷脂对巨噬泡沫细胞胆固醇外流的影响

目的:探讨溶血卵磷脂(LPC)对巨噬泡沫细胞胆固醇外流的影响,为动脉粥样硬化(AS)的防治研究提供理论依据。方法:分离培养小鼠腹腔巨噬细胞,密度梯度超速离心法分离人血浆低密度脂蛋白(LDL),乙酰化后形成乙酰化低密度脂蛋白(AcLDL),用AcLDL负载巨噬细胞使之形成巨噬泡沫细胞模型。用酶学荧光法检测细胞胆固醇外流,用乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒检测培养基中LDH活性来反映LPC的细胞毒性。结果:LPC处理巨噬泡沫细胞24h后,培养基中胆固醇含量明显高于对照组(1.7-4倍),细胞内胆固醇含量明显低于对照组。且LPC引起细胞胆固醇外流增加同时,培养基中LDH活性并没有明显差异。结论:在10-80μmol/L剂量范围内,LPC可以剂量依赖性地促进巨噬泡沫细胞胆固醇外流,且这一效应与LPC的细胞毒性之间没有关系。     

肥大细胞改变THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇含量及抑制胆固醇流出

目的：以THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞为研究对象，探讨肥大细胞（MC）对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量、分配和流出的影响及机制。方法： THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞在MC颗粒释放物存在或缺乏下与高密度脂蛋白3（HDL₃）共育。高效液相色谱检测泡沫细胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)和酯化胆固醇(EC)含量，用液体闪烁计数器检测细胞内胆固醇流出，运用逆转录聚合酶链反应检测三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的mRNA水平，采用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测HDL₃及apoA-Ⅰ的降解。结果： MC组泡沫细胞内TC、FC明显高于对照组（TC对照组为527.3 mg/g，MC组为917.9 mg/g）；EC/TC比值低于对照组（7.6% vs 47.5%）；细胞内胆固醇流出少于对照组(26.92％±2.6％ vs 40.98％±3.4％,P<0.05)；而泡沫细胞ABCA1的mRNA水平与对照组无明显差异。MC颗粒释放物处理HDL₃后，聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，约有28%的apoA-Ⅰ被降解，在分子量26 kD左右处出现了新的条带，产生了1个26 kD的小多肽。结论：肥大细胞可通过降解HDL₃及apoA-Ⅰ抑制细胞内胆固醇流出而增加细胞内胆固醇蓄积，这个作用与ABCA1表达无直接关系。     

平滑肌源性泡沫细胞模型的制备

目的：研究动脉粥样硬化发生和发展的机制及用于抗动脉粥样硬化药物筛选的细胞疾病模型。方法；离体状态下，培养的猪主动脉平滑肌细胞在含１５ｍｇ·Ｌ＾－１氧化低密度脂蛋白（ＯＬＤＬ）的Ｍ１９９培养基中培养７２ｈ，使之转变为平滑肌源性泡沫细胞。     

氧化低密度脂蛋白及溶血卵磷脂对巨噬泡沫细胞胆固醇外流的影响

目的:观察氧化低密度脂蛋白(OxLDL)及其成分溶血卵磷脂(LPC)对小鼠腹腔巨噬泡沫细胞胆固醇外流的影响及其机制的初步探讨。方法:(1)以载脂蛋白AI(apoAI)分别诱导OxLDL和乙酰化低密度脂蛋白(AcLDL)负载小鼠腹腔巨噬细胞所形成的巨噬泡沫细胞, 观察其胆固醇外流情况。(2)分离正常及apoE基因缺陷(E⁰)小鼠腹腔巨噬细胞, 以AcLDL负载形成巨噬泡沫细胞, 分别以LPC及apoAI作为诱导物, 观察其胆固醇外流情况。结果:(1)apoAI能引起AcLDL组巨噬泡沫细胞胆固醇大量外流, 而OxLDL组外流明显受阻。(2)LPC能引起正常组小鼠腹腔巨噬泡沫细胞胆固醇外流, 且呈剂量效应关系, 但E⁰组未见明显外流;apoAI能引起两组的胆固醇外流, 且外流量显著高于LPC。结论:(1)OxLDL能造成胆固醇外流途径受阻。(2)LPC能促进巨噬泡沫细胞胆固醇外流, 可能主要通过apoE途径来进行。     

载脂蛋白A-Ⅰ对三磷酸腺苷结合盒转运体A1的影响

目的：以THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞为研究对象，观察载脂蛋白A-I对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出和三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的影响,从而探讨载脂蛋白A-I对动脉粥样硬化(As)发生发展的影响。方法:用液体闪烁计数器检测细胞内胆固醇流出, 高效液相色谱分析细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量, 运用逆转录-多聚酶链反应和Western 印迹分别检测ABCA1 mRNA 与ABCA1蛋白的表达,用流式细胞术检测细胞平均ABCA1荧光强度。 结果:载脂蛋白A-I引起THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞总胆固醇、游离胆固醇与胆固醇酯呈时间依赖性减少, 而ABCA1蛋白质水平、细胞平均ABCA1荧光强度以及细胞内胆固醇流出呈时间依赖性增加,但ABCA1 mRNA没有明显变化。巯基蛋白酶抑制剂(leupeptin 和ALLN)增加ABCA1蛋白质水平,而其它蛋白酶抑制剂(pepstatin A、aprotinin及phosphoramiddon)不增加ABCA1蛋白质水平,蛋白体抑制剂(lactacytin)和溶酶体抑制剂(NH4Cl)也不影响ABCA1蛋白质水平。 结论:巯基蛋白酶可降解THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1蛋白质,而载脂蛋白A-I可阻碍巯基蛋白酶降解ABCA1蛋白质,从而提高THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1 蛋白质水平, 增加细胞内胆固醇流出, 降低细胞内胆固醇聚积。     

黄芪多糖对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的影响

目的：以THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞为研究对象，观察不同浓度黄芪多糖对胆固醇流出和ABCA1基因表达的影响。方法：将THP-1细胞诱导分化成泡沫细胞，用不同浓度黄芪多糖对其干预24 h，γ计数仪检测胆固醇流出，RT-PCR及流式细胞仪检测ABCA1的表达。结果：黄芪多糖呈剂量依赖性（10-100 mg/L）促进胆固醇流出；增加ABCA1的表达。结论：黄芪多糖可能通过增加ABCA1的表达而促进胆固醇流出。     

miRNA-33对Hcy干预RAW264.7巨噬细胞衍生的泡沫细胞表达ABCA1/ABCG1的影响

目的:研究同型半胱氨酸(Hcy)是否通过微小RNA-33 (miRNA-33)抑制三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)和三磷酸腺苷结合盒转运体G1(ABCG1)的表达,从而降低胆固醇逆转运(RCT)效率。方法:复制RAW264.7巨噬细胞经氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导为泡沫细胞的模型,油红O染色确定模型是否复制成功,用LipofectamineTM2000将miRNA-33 mimics和miRNA-33 inhibitor分别转染入细胞内,再给予5 mmol/L的Hcy干预24 h后进行实验;用油红O染色观察细胞内脂滴情况;real-time PCR和Western blot检测ABCA1和ABCG1的mRNA和蛋白表达水平;液体闪烁计数法检测细胞内胆固醇流出率;高效液相色谱分析细胞内胆固醇含量。结果:(1)与空白对照组相比,miRNA-33 mimics组细胞内脂滴含量增加,ABCA1和ABCG1的mRNA和蛋白表达量降低(P 0.05),细胞内胆固醇含量逐渐增加(P 0.05),细胞内胆固醇流出率逐渐减少(P 0.05);(2)与空白对照组相比,miRNA-33 inhibitor组检测结果与miRNA-33 mimics组的结果相反,差异具有统计学意义(P 0.05);(3)空白对照组、miRNA-33 mimics-NC组和miRNA-33 inhibitor-NC组3组间相比,所有检测结果的差异均无统计学显著性。结论:Hcy可间接通过诱导miRNA-33表达而抑制ABCA1和ABCG1的蛋白表达,降低RCT效率。