Rip2诱导人胰腺癌细胞自噬和凋亡的交互作用及机制研究

目的:探讨受体相互作用蛋白2(Rip2)诱导人胰腺癌细胞自噬和凋亡的交互作用及其机制。方法:用jetPRIME将pEGFP-C2空质粒和pEGFP-Rip2重组质粒分别转染至人胰腺癌Panc-1细胞。用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用于过表达Rip2的细胞,流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot检测凋亡相关蛋白的表达;比色法检测caspase-8、-9、-3的活性。此外,用caspases抑制剂Z-VAD-FMK作用于过表达Rip2的细胞,Western blot检测自噬相关蛋白及PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白的表达;透射电子显微镜观察自噬体的数量及形态。结果:(1)pEGFP-Rip2组细胞凋亡率显著高于对照组和pEGFP-C2组(P<0. 05),而pEGFP-Rip2+3-MA组细胞凋亡率进一步升高(P<0. 05);与pEGFP-Rip2组比较,pEGFP-Rip2+3-MA组细胞Fas、Bax和胞浆细胞色素c(Cyt-c)蛋白表达水平显著升高(P<0. 05),Bcl-2蛋白表达水平则显著下降(P<0. 05);pEGFP-...     

lncRNA-CCAT1通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路对宫颈癌HeLa细胞自噬的影响

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)结肠癌相关转录因子1(CCAT1)对宫颈癌HeLa细胞自噬的影响及其可能作用机制.方法:培养宫颈癌HeLa细胞,将CCAT1过表达质粒pcDNA3.1-CCAT1转染至HeLa细胞中,采用qRT-PCR检测转染后细胞中CCAT1的表达水平;CCK8法检测细胞增殖活性;单丹磺酰戊...     

NVP-BEZ235诱导多囊肾大鼠胆管上皮细胞自噬的机制研究

 目的:探讨PI3K/Akt/mTOR双靶点抑制剂NVP-BEZ235诱导多囊肾(polycystic kidney,PCK)大鼠胆管上皮细胞自噬的作用。方法:免疫组化法检测p-mTOR和p-Akt在PCK大鼠胆管上皮细胞中的水平。WST-1比色法检测NVP-BEZ235对胆管细胞活力的抑制作用以及LC3、Beclin 1基因沉默和自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)对细胞活力的影响。蛋白免疫印迹法检测NVP-BEZ235对PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白及自噬标志蛋白LC3和Beclin 1的变化。结果:p-mTOR和p-Akt在PCK大鼠胆管上皮细胞中显著升高,NVP-BEZ235可明显抑制胆管上皮细胞的活力,且呈浓度和时间依赖性改变(P<0.05);NVP-BEZ235明显抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的水平;并上调自噬标志蛋白LC3 II/LC3 I比值和Beclin 1蛋白的表达水平。LC3、Beclin 1基因沉默和3-MA均可明显减弱NVP-BEZ235对细胞活力的抑制作用(P<0.01)。结论:NVP-BEZ235可抑制PCK大鼠胆管上皮细胞的活力,其机制与自噬密切相关。     

Rip2诱导人胰腺癌细胞自噬及其机制研究

目的:研究受体相互作用蛋白2(Rip2)是否诱导人胰腺癌细胞株Panc-1发生自噬及其作用机制。方法:用jet PRIME转染试剂将空质粒pEGFP-C2和重组质粒pEGFP-Rip2分别转染入Panc-1细胞,不做处理的细胞为对照组。转染后培养细胞48 h,采用Western blot检测Rip2、自噬相关蛋白[beclin-1和微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)]及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关蛋白的表达;透射电子显微镜观察自噬体的数量。结果:转染pEGFP-Rip2的细胞Rip2蛋白表达显著增加。与对照组和pEGFP-C2组相比,pEGFP-Rip2组细胞的beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著升高(均P0.01);在透射电子显微镜下观察发现,pEGFP-Rip2组细胞内自噬体的数量明显多于对照组和pEGFP-C2组。pEGFP-Rip2组细胞的p-Akt和p-mTOR蛋白水平明显低于对照组和pEGFP-C2组(均P0.01),而总Akt和mTOR的蛋白水平变化不明显。结论:过表达Rip2可诱导Panc-1细胞发生自噬,其作用机制可能与Rip2抑制PI3K/Akt/mTOR通路的活化有关。     

PI3K/Akt/mTOR信号通路在巨噬细胞自噬及动脉粥样硬化斑块不稳定中的作用

 目的：探讨磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路在巨噬细胞自体吞噬以及动脉粥样硬化斑块不稳定中的作用。方法：利用Akt抑制剂康士得（20 μmol/L）、mTOR抑制剂雷帕霉素（10 nmol/L）及mTOR-siRNA（30 nmol/L）体外处理小鼠RAW 264.7 巨噬细胞株 48 h后,透射电镜观察巨噬细胞自噬体的变化,细胞免疫荧光法及Western blotting法检测微管相关蛋白LC3-II表达,实时荧光定量qRT-PCR和Western blotting法检测Akt、mTOR及自噬相关蛋白Beclin 1的表达,ELISA检测巨噬细胞分泌炎症因子水平。体内实验中, 24只雄性新西兰兔给予球囊损伤+ 1%胆固醇喂养8周,然后随机分为对照组、康士得（1.0 mg·kg-1·d-1）组和雷帕霉素（0.5 mg·kg-1·d-1）组,每组8只,干预4周。血管内超声（IVUS）检测斑块的影像学特征,透射电镜观察斑块中巨噬细胞超微结构的改变,免疫荧光法检测微管相关蛋白LC3-II表达,免疫组织化学法检测巨噬细胞Akt和mTOR的蛋白表达。 结果：与对照组比较,康士得、雷帕霉素及mTOR-siRNA干预巨噬细胞后,透射电镜下观察到自噬体明显增多,微管相关蛋白LC3-II和自噬相关蛋白Beclin 1的表达水平明显上调,而Akt及mTOR 的mRNA及蛋白表达水平明显减少,巨噬细胞分泌的IL-10明显降低,而IFN-γ的分泌显著增加。体内实验： IVUS显示,与对照组比较,康士得组及雷帕霉素组的外弹性膜面积（EEMA）、斑块面积（PA）及斑块负荷（PB）明显减少,透射电镜下观察到巨噬细胞中自噬体增加,组织免疫荧光法示LC3-II明显增加,HE染色显示斑块纤维帽的厚度明显增加,内、中膜厚度显著减低,组织免疫组化染色显示巨噬细胞RAM-11及p-mTOR染色显著减少。结论：选择性抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路能诱导巨噬细胞自噬,减少斑块巨噬细胞的浸润, 抑制炎症反应进而稳定动脉粥样硬化易损斑块。     

荷叶碱通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路促进自噬减少巨噬细胞泡沫化的机制研究

目的:探讨荷叶碱对泡沫细胞形成的影响及其可能的分子机制。方法:体外培养人单核-巨噬细胞系THP-1,利用氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导建立泡沫细胞模型,同时用5、10和20μmol/L荷叶碱进行干预。采用油红O染色观察细胞内脂质沉积;用试剂盒测定细胞总胆固醇含量;通过Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、P62、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)蛋白水平,免疫荧光检测自噬流,透射电镜检测自噬小体,评估细胞内自噬水平及自噬相关通路的变化。利用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制细胞自噬,观察荷叶碱是否通过调控自噬抑制泡沫细胞形成。结果:与正常对照组相比,Ox-LDL组细胞内脂质沉积和总胆固醇含量显著增加。与Ox-LDL组相比,荷叶碱组细胞内脂质沉积和总胆固醇含量显著减少,自噬流显著增强,自噬小体增多;3-MA处理后,荷叶碱抑制细胞泡沫化的作用被削弱。荷叶碱降低p-mTOR和p-Akt蛋白水平。结论:荷叶碱可能通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt/mTOR通路促进自噬,减少细胞内脂质沉积,从而抑制泡沫细...     

PI3K/Akt信号通路及其抑制剂的研究进展

磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/丝氨酸-苏氨酸激酶（Akt）信号通路在信号转导的调控中扮演着重要角色,能调节细胞增殖、凋亡、代谢、运动、血管生成等生物过程。与其他信号通路相比,PI3K/Akt信号通路的组成部分更庞大,在肿瘤中更多见。目前已证实多种肿瘤中存在PI3K/Akt信号通路的超活化,对肿瘤细胞的存活、生长、运动、血管生成和代谢意义重大。因此,抑制PI3K和与通路相关的成分可能会使肿瘤生长受抑,使患者预后改善。PI3K/Akt信号通路抑制剂包括针对单一成分的抑制剂和双重抑制剂。目前大量的PI3K抑制剂已在临床前期研究中取得良好结果,有些已经在血液恶性肿瘤和实体肿瘤中进行了临床试验。在此综述中,我们简单的总结了PI3K-AKt通路的研究成果,讨论了PI3K抑制剂从临床前研究到临床研究的发展前景。     

白花丹醌对人结肠腺癌Caco-2细胞凋亡、自噬及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响

目的:探讨白花丹醌是否诱导人结肠腺癌Caco-2细胞凋亡和自噬及其对磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PKB/Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的影响.方法:体外培养Caco-2细胞,分别加入2.5、5、7.5、10、12.5和15μmol/L的白花丹醌作用12、24和36 h后,采用MTT...     

厄贝沙坦通过诱导自噬减轻db/db小鼠肝脏脂肪变

目的:探讨厄贝沙坦对db/db小鼠脂肪肝的影响及自噬在这一过程中的作用。方法:雄性db/db小鼠24只随机分为模型组和厄贝沙坦组,另选取12只db/m小鼠作为正常对照组。各组分别干预16周后,观察体重、肝指数、血脂、肝功能以及肝脏病理的变化,检测肝组织PI3K/Akt/m TOR信号通路及自噬相关蛋白Atg-7、beclin-1和LC3B的表达情况,并利用电镜观察肝脏自噬小体的变化。结果:与模型组相比,应用厄贝沙坦干预后,db/db小鼠的体重、肝指数、血脂、丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶与模型组相比显著降低(P0.05),肝脏病理改变明显减轻;肝组织p-PI3K、p-Akt和p-m TOR的表达明显减少,Atg-7、beclin-1和LC3B-Ⅱ的表达明显增加,肝脏自噬小体显著增多(P0.05)。结论:厄贝沙坦可能通过抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路,上调自噬相关蛋白Atg-7、beclin-1和LC3B-Ⅱ表达,进而促进肝细胞自噬,减轻db/db小鼠肝脏脂肪变。     

齐墩果酸诱导人白血病HL-60细胞凋亡及细胞周期阻滞

目的：探讨齐墩果酸诱导HL-60细胞凋亡作用及其对细胞周期的影响。方法：以HL-60细胞为研究对象，以不同剂量的齐墩果酸处理HL-60细胞12 h、24 h、48 h、72 h后，用MTT法观察HL-60细胞的生长抑制率；琼脂糖凝胶电泳测定DNA梯形条带；流式细胞仪分析HL-60细胞细胞周期的变化；同时用Western blotting 检测凋亡途径最终执行者caspase-3的表达。结果：齐墩果酸对HL-60细胞生长具有明显的抑制作用，其中80 μmol/L齐墩果酸作用48 h对HL-60细胞的抑制率达到50%以上，齐墩果酸诱导细胞凋亡呈明显的时间和剂量依赖性； HL-60经齐墩果酸处理48 h出现典型的DNA梯形条带；以80 μmol/L的齐墩果酸处理HL-60细胞12 h即可以使caspase-3的前体procaspase-3断裂为有活性的caspase-3；流式细胞技术检测结果表明HL-60细胞经齐墩果酸处理后细胞周期阻滞于G₁期，其中48 h和72 h分别达到63.24%和67.90%。结论：齐墩果酸可以诱导HL-60细胞凋亡，并使细胞阻滞于G₁期。     

穿心莲内酯对卵巢癌细胞株SKOV-3侵袭与凋亡的影响

目的:观察穿心莲内酯对卵巢癌细胞株SKOV-3侵袭与凋亡的影响并探讨初步的作用机制。方法:CCK-8法检测不同浓度(0、5、10、20和40μmol/L)的穿心莲内酯对SKOV-3细胞作用不同时间(12、24、36和48h)后,SKOV-3细胞存活率的变化;Transwell法与TUNEL法分别检测SKOV-3细胞侵袭能力与凋亡能力的变化;Western blot法检测p-PI3K、p-Akt与p-mTOR蛋白水平的变化。结果:CCK-8法检测结果显示,随着浓度增加与培养时间延长,穿心莲内酯对SKOV-3细胞存活率的抑制程度增强;采用20μmol/L穿心莲内酯培养SKOV-3细胞36h后,SKOV-3细胞的侵袭数明显降低,凋亡数明显增加(P0.05),p-PI3K、p-Akt与p-mTOR的蛋白水平明显降低(P0.05)。结论:穿心莲内酯能够抑制卵巢癌细胞SKOV-3的活力与侵袭能力,增强凋亡能力,这可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。     

抑制mel18表达增强桂皮醛诱导的HL60细胞分化

目的:研究下调mel18基因表达对桂皮醛(CA)诱导HL60细胞分化的影响。方法:用低浓度CA和反式维甲酸(ATRA)处理HL60细胞。用shRNAmel18质粒及对照质粒shRNALuc包装慢病毒,用病毒感染HL60细胞。低浓度CA和ATRA作用于病毒感染的HL60细胞,流式细胞术检测细胞周期和细胞表面分化抗原表达,Western blot法检测MEL18蛋白、cyclin D1、p27的表达和Akt的磷酸化水平。结果:低浓度CA和ATRA增加HL60细胞的粒细胞分化抗原CD11b表达,MEL18蛋白表达下降。shmel18病毒感染的HL60细胞(shmel18-HL60细胞)MEL18蛋白表达下降,而对照病毒感染的HL60细胞(sh Luc-HL60细胞)MEL18蛋白表达无明显变化。shmel18-HL60细胞的CD11b表达率明显增高,细胞阻滞于G1期;经低浓度CA处理后,shmel18-HL60细胞的CD11b表达率进一步增高。shmel18-HL60细胞Akt的磷酸化水平及cyclin D1表达明显下降,而p27表达则显著升高。结论:抑制mel18基因表达导致HL60细胞向成熟粒细胞方向分化,mel18基因可能通过PI3K/Akt信号途径调控cyclin D1和p27的表达,影响HL60细胞分化。而CA可能通过抑制mel18基因表达从而通过PI3K/Akt途径促进HL60细胞分化。     

黄岑苷对宫颈癌细胞株HeLa的放射增敏作用

 目的: 探讨黄岑苷对宫颈癌细胞株HeLa的放射增敏作用及机制。方法: MTT法检测不同浓度黄岑苷对HeLa细胞的活力抑制能力,并计算IC₅₀筛选实验药物浓度;克隆形成实验检测放射组与联合组在不同照射剂量下细胞的放射增敏作用;流式细胞术检测单药组、放射组与联合组的细胞周期变化;Western blot检测不同组细胞中Akt、p-Akt、Bad和p-Bad的蛋白水平。结果: 黄岑苷呈浓度依赖性抑制HeLa细胞的活力,IC₅₀为43.65 mg/L,采用20% IC₅₀浓度8 mg/L进行放射增敏实验。克隆形成实验结果显示8 mg/L黄岑苷联合放射治疗可使生存曲线左移,D0、Dq值显著小于放射组(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示黄岑苷阻滞HeLa细胞于G₂/M期。联合组细胞中p-Akt和p-Bad的蛋白水平均显著高于其它各组(P<0.05)。结论: 黄岑苷对HeLa细胞具有放射增敏作用,其机制可能与其阻滞细胞于G₂/M期和活化PI3K/Akt信号通路有关。     

芍药苷对APP/PS1小鼠的神经细胞保护作用及机制研究

目的:探讨芍药苷(paeoniflorin,PF)通过抑制细胞凋亡通路而产生神经细胞保护作用的机制。方法:分别选用15只5月龄雄性APP/PS1非显性小鼠作为正常对照组,15只5月龄雄性APP/PS1双转基因小鼠为模型组和15只5月龄雄性APP/PS1双转基因小鼠为给药组(5 mg/kg的PF腹腔注射)。采用水迷宫实验检测各组小鼠的学习和记忆能力。采用TUNEL荧光染色法检测脑内神经细胞凋亡情况。采用Western Blot检测脑内皮层及海马区PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、caspase-3、caspase-9、Bcl-2和Bax的蛋白表达水平,并用免疫组化分析caspase-3和caspase-9的蛋白表达水平及分布情况。结果:(1)与正常对照组相比,APP/PS1模型组小鼠的学习和记忆能力明显下降;与APP/PS1模型组相比,PF明显改善小鼠的学习和记忆能力。(2)与正常对照组相比,APP/PS1模型组小鼠脑内神经细胞凋亡明显增多,分布区域较广,而PF给药组小鼠凋亡细胞明显减少。(3)与APP/PS1模型组相比,PF给药组能显著下调促凋亡因子caspase-3、caspase-9和Bax的表达水平(P0.05),同时上调抑凋亡因子pPI3K、p-Akt和Bcl-2的表达水平(P0.05)。结论:PF可能通过激活PI3K/Akt通路而上调Bcl-2,下调caspase-9、caspase-3和Bax的蛋白表达水平,从而抑制神经细胞凋亡和保护神经细胞,以治疗神经退行性疾病。