结缔组织生长因子对肾小管上皮细胞转分化的调节机制

目的 观察结缔组织生长因子（CTGF）对体外培养的人肾小管上皮细胞转分化的直接影响,并探讨阻断内源性CTGF表达对转化生长因子- β1（TGF-β）诱导人肾小管上皮细胞转分化的干预效果,以阐明CTGF在肾小管上皮细胞转分化中的作用。方法 体外培养人近曲小管上皮细胞（HKC）。在观察CTGF对HKC的直接作用时,将HKC细胞分为三组：（1）对照组;（2）小剂量CTGF组：培养液中加入重组人CTGF（rhCTGF）,终浓度为2．5μg／L;（3）大剂量CTGF组：rhCTGF终浓度为5．0μg／L。在探讨CTGF在TGF-β诱导HKC转分化中的作用时,将细胞分为4组：（1）正常对照组;（2）TGF-β刺激组（培养液加入重组人TGF-β1蛋白,浓度为10．0μg／L）;（3）TGF-β1＋CTGF正义寡核苷酸（ODN）组（先以CTGF正义ODN转染HKC,再加TGF-β1刺激）;（4）TGF-β1＋CTGF反义ODN组（先以CTGF反义ODN转染HKC,再加TGF-β1刺激）。用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法测定HKC α-平滑肌肌动蛋白（α—SMA）和Ⅳ型胶原（col Ⅳ）mRNA水平的变化;间接免疫荧光方法检测HKC胞浆内α—SMA的表达;流式细胞仪检测α—SMA阳性细胞百分率;ELISA方法测定培养液上清中col Ⅳ的浓度。结果 不同浓度rhCTGF作用于HKC24h后,α-SMAmRNA水平显著升高（P〈0．01）,而colⅣmRNA表达水平明显下降（均P〈0．01）;刺激48h后,胞浆α—SMA表达明显增强,流式细胞仪测得三组细胞α-SMA阳性百分率依次为：2．4％、38．9％、65．5％（P〈0．01）;ELISA结果表明,rhCTGF抑制了colⅣ的分泌（P〈0．01）。TGF-β1可诱导HKC高表达CTGF和α-SMA。转染后6h,CTGF反义ODN可显著抑制HKC表达CTGF和α-SMA mRNA（P〈0．01）。转染后48h,CTGF反义ODN可明显抑制胞内α-SMA蛋白合成。结论 CTGF在体外能刺激肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞（MyoF）转分化,而CTGF反义ODN的导人可有效抑制TGF-β1诱导的转分化过程。因此,CTGF可能是调节肾小管上皮细胞转分化的重要因子。     

阿魏酸钠对TGF—β1诱导下肾脏成纤维细胞α-SMA、CTGF表达及细胞外基质合成的影响

目的观察阿魏酸钠（SF）对转化生长因子β1（TGF-β1）作用下肾成纤维细胞（NRK-49F）α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及结缔组织生长因子（CTGF）表达、细胞外基质（ECM）合成的影响,探讨其抗肾间质纤维化的效果及可能机制。方法体外培养NRK-49F细胞,利用MTT观察阿魏酸钠对TGF-β1诱导细胞活力的影响;实时荧光定量逆转录一聚合酶链反应（Real TimeRT—PCR）检测细胞α-SMA及CTGF mRNA的表达;免疫细胞化学法观察细胞α-SMA、CTGF蛋白表达的情况;ELISA法测定细胞上清Ⅰ型胶原（Col I）、纤维连接蛋白（FN）的表达。结果TGF-β1可以显著增加大鼠肾脏成纤维细胞活力、上调细胞α-SMA、CTGF在mRNA和蛋白水平的表达、增加ColI及FN的合成;阿魏酸钠能够减轻TGF-β1,的上述效应。结论阿魏酸钠可以在一定程度上抑制TGF-β1诱导的肾脏纤维化。     

曲尼司特对结缔组织生长因子刺激人肾小管上皮细胞胶原Ⅳ合成的影响

目的:研究曲尼司特(Tran)对重组人结缔组织生长因子(rhCTGF)刺激人肾小管上皮细胞(HKCs)胶原Ⅳ合成的影响,以探讨其抗肾小管间质纤维化的机制。方法:将培养的HKCs分为三组:⑴对照组;⑵rhCTGF(20ng/mL)干预组;⑶rhCTGF(20 ng/mL)+Tran(100μmol/L)干预组。MTT法检测Tran对HKCs的毒性,用倒置显微镜观察细胞形态的变化,用RT-PCR方法评价胶原Ⅳα1mRNA的表达改变,用免疫荧光镜和Western Blotting方法评价胶原Ⅳα1蛋白的表达水平。结果:rhCTGF刺激48 h后,HKCs由正常的卵圆形变为梭形,细胞内胶原Ⅳα1mRNA和蛋白的表达均明显增高(P<0.05),而rhCTGF+Tran干预组,HKC大部分为卵圆形,部分仍为梭形,胶原Ⅳα1mRNA和蛋白表达明显下降(P<0.05)。结论:曲尼司特可能通过抑制CTGF诱导的细胞外基质的合成,从而减轻肾纤维化,发挥其肾脏保护作用。     

肾间质纤维化发病机理与中药治疗研究进展

肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis,RIF）是各种慢性肾脏疾病进展为终末期肾衰竭共同的病变过程,病理特征为正常肾间质和肾小管结构被大量聚集的细胞外基质（ECM）所代替,如Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白（FN）、层黏蛋白（LN）等,ECM由成纤维细胞、‘肾小管上皮细胞和血管内皮细胞等细胞合成和分泌,     

京尼平苷对大鼠前列腺成纤维细胞增殖的影响

【目的】研究京尼平苷对大鼠前列腺成纤维细胞增殖的影响,并探讨其机制。【方法】培养SD大鼠前列腺成纤维细胞,取对数生长期的细胞随机分成4组：对照组、京尼平苷10mg/L、20mg/L和40mg/L组。不同浓度的京尼平苷孵育大鼠前列腺成纤维细胞48h后,采用MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,ELISA法测定Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原与转化生长因子β1（TGF-β1）蛋白的含量。【结果】与对照组比较,京尼平苷20mg/L和40mg/L可显著抑制大鼠前列腺成纤维细胞的增殖（P〈0.01）,促进其凋亡（P〈0.01）,同时减少TGF-β1的分泌和胶原的合成（P〈0.05或P〈0.01）。【结论】京尼平苷可抑制大鼠前列腺成纤维细胞的增殖,可能与其减少TGF-β1的分泌和胶原的合成、促进前列腺成纤维细胞的凋亡有关。     

CTGF-siRNA对低氧诱导肺成纤维细胞胶原合成的影响

目的 观察针对结缔组织生长因子(CTGF)的小干扰RNA(siRNA)对低氧诱导的人肺成纤维细胞胶原合成的影响.方法 应用siRNA表达载体介导的RNA干扰(RNAi)技术,将CTGF-siRNA表达质粒稳定转染人肺成纤维细胞MRC-5, 并将人肺成纤维细胞在低氧条件下(37 ℃, 5%CO2, 1%O2)培养1、2、4、6及12 h.采用定量PCR法测定CTGF及Ⅰ型胶原基因表达,并应用Western blot 法检测CTGF及Ⅰ型胶原蛋白表达变化.结果 低氧培养1 h后,人肺成纤维细胞即可刺激诱导CTGF mRNA表达,其升高水平可持续至6 h.而在CTGF-siRNA表达质粒稳定转染的MRC-5细胞内,低氧诱导的CTGF、Ⅰ型胶原基因及蛋白表达均降低(P<0.05).结论 针对CTGF的siRNA在体外可明显抑制低氧诱导的MRC-5肺成纤维细胞的胶原合成.     

辛伐他汀对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响

目的 研究羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-COA）还原酶抑制剂（职I）辛伐他汀（simvastatin）对输尿管梗阻大鼠（UUO）肾间质纤维化的影响及可能机制。方法 通过结扎单侧输尿管造成大鼠肾间质纤维化，随机分为假手术组、模型组和给药组，术后9天处死各组大鼠，取梗阻侧肾做组织学检查，HE染色，并用免疫组化方法检测肾组织中结缔组织生长因子（CTGF）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、胶原-Ⅳ（COL-Ⅳ）的水平。结果 模型组出现了明显的间质纤维化，给药组肾间质纤维化与模型组相比有所减轻，CTGF、α-SMA、COL-Ⅳ的水平也明显减低。结论 辛伐他汀可以影响细胞因子、抑制细胞增殖、减轻细胞外基质的积聚，从而减轻间质纤维化，发挥肾保护作用。     

结缔组织生长因子对支架中培养人牙龈成纤维细胞的作用

目的：探讨人牙龈成纤维细胞合成结缔组织生长因子对促进其分泌Ⅰ型胶原的作用。方法将人牙龈成纤维细胞与壳聚糖／明胶／卡拉胶支架材料复合培养,以培养基中是否加入抗结缔组织生长因子抗体分为实验组和对照组,采用ELISA法检测并比较两者培养孔中上清液Ⅰ型胶原和结缔组织生长因子的浓度。结果加入抗结缔组织生长因子抗体的实验组上清液中的Ⅰ型胶原含量和结缔组织生长因子含量均小于未加抗结缔组织生长因子抗体的对照组,差异有统计学意义（ P＜0．05）。结论人牙龈成纤维细胞与壳聚糖／明胶／卡拉胶支架复合培养时,可以通过分泌结缔组织生长因子来促进Ⅰ型胶原的产生。     

骨形态发生蛋白-7诱导人肾成纤维细胞间质-上皮转化的研究

目的 探讨骨形态发生蛋白-7(bone morphogenic protein-7,BMP-7)能否诱导人肾成纤维细胞出现间质-上皮的转化.方法 原代培养获得人肾间质成纤维细胞,传至第3代用于本实验.培养液中添加1 000 ng/L BMP-7 72 h后,观察细胞形态变化,MTT法检测细胞增殖,ELISA法测定上清Ⅰ胶原含量,Western blot分析E-cadherin和Pax2蛋白表达.结果 细胞与BMP-7孵育72 h后,出现细胞聚集类似小管细胞团块.与对照组相比,成纤维细胞增殖活性减低,Ⅰ型胶原分泌下降,上皮标志物E-cadherin和肾发生的标志分子Pax2表达增加.结论 肾成纤维细胞至少保持部分它胚胎时的印迹和可塑性,BMP-7可诱导人肾成纤维细胞呈现间质-上皮的转化.     

戈雷拉肽对单侧输尿管梗阻大鼠模型肾间质纤维化的保护作用

目的观察戈雷拉肽对肾间质纤维化（RIF）的保护作用。方法15只健康雄性SD大鼠随机分为假手术组（Ⅰ组）、单侧输尿管梗阻（UUO）模型组（Ⅱ组）及戈雷拉肽治疗组（Ⅲ组）。术后第15d摘取梗阻侧肾脏,通过Masson染色观察肾间质炎症细胞的数量及纤维化程度;免疫组织化学方法观察转化生长因子（TGF-β1）及结缔组织生长因子（CTGF）表达情况。结果模型组24h尿蛋白定量、肌酐、尿素氮高于假手术组及戈雷拉肽治疗组（P〈0．01）;戈雷拉肽治疗组24h尿蛋白定量、肌酐、尿素氮高于假手术组（P〉0．05）。与假手术组相比,模型组肾间质炎症细胞数量增多、RIF程度明显、TGF-β1、CTGF表达增强（P〈0．01）,戈雷拉肽治疗组与模型组相比,以上各项指标明显降低（P〈0．01）,高于假手术组（P〈0．05）。结论戈雷拉肽通过下调TGF-β1、CTGF表达、抑制肾间质成纤维细胞的增殖减轻RIF,保护肾脏功能。     

来氟米特对肝星状细胞增殖和胶原合成的影响

目的:研究来氟米特活性代谢物A771726对肝星状细胞(HSC)增殖和胶原合成的影响.方法:用链蛋白酶和胶原酶原位肝灌注、Nycodenz密度离心法分离大鼠HSC和Kupffer细胞,制备Kupffer培养上清液(KCCM),并以不同浓度、不同培养时间的CCl4损伤的KCCM作为刺激因素观察了A771726对HSC增殖(3H-TdR掺入法)和胶原合成(3H-Pro掺入法)的影响.ELISA法测定KCCM内TGF-β、TNF-α和IL-1含量.结果:HSC和Kupffer细胞得到较好的分离.CCl4损伤的KCCM显著增加HSC增殖和胶原合成,并且稀释度为1:2的KCCM在培养7 d时,对HSC增殖和胶原合成的刺激作用明显.A771726(0.001～10 μmol/L)对CCl4损伤的KCCM刺激HSC增殖和胶原合成有不同程度的抑制作用,并且A771726(0.001～10 μmol/L)明显抑制CCl4损伤KCCM内升高的TGF-β、TNF-α和IL-1水平.结论:CCl4损伤的KCCM可明显刺激HSC增殖和胶原合成,而A771726对此有明显的抑制作用,并且与其抑制致HSC激活的因子如TGF-β、TNF-α和IL-1分泌有关.     

Role of connective tissue growth factor in experimental radiation nephropathy in rats

Background Connective tissue growth factor （CTGF） is a potent fibrogenic cytokine which has been associated with progressive glomerulosclerosis and tubulointerstitial fibrosis. We investigated the role of CTGF on the progression of a rat model of radiation nephropathy. Methods The model of radiation nephropathy in rats was established as follows： control group （n=12）, underwent only laparotomy; irradiated group （n=-20）, underwent a laparotomy, then the rats were subjected to a single dose 25 Gy X-ray to the kidneys. The rats were followed up one, three, six and nine months after renal exposure to radiation. Results Renal dysfunction was noted early in irradiated rats. Histological analysis showed focal glomerular sclerotic lesions at an early stage after irradiation. Radiation-induced glomerular and tubulointerstitial injuries were particularly severe the sixth month after irradiation as compared to the control group （P 〈0.01）. By immunohistochemistry, increased expression of CTGF was noted in the irradiated kidneys, which began to increase from the first month after irradiation, and remained significantly higher at the sixth and ninth month after irradiation （P 〈0.01）. Upon Western blot analysis CTGF protein expression showed an increase in the radiation treated kidneys compared with the control rats. The expression of CTGF closely correlated with the progression of radiation nephropathy. The expression of α-smooth muscle actin, vimentin, type Ⅲ collagen and type Ⅳ collagen was also high in the irradiated kidney as compared to control rat kidneys （P 〈0.05）, and was most severe at the sixth and ninth month after irradiation （P 〈0.01）. By double immunostaining, CTGF expressing cells were found to be α-SMA-positive myofibroblasts and vimentin-positive tubular epithelial cells. Glomerular expression of CTGF closely correlated with the glomerular expression of a-SMA （r=0.628, P 〈0.01）, vimentin （r=0.462, P 〈0.05） and accumulation of type IV collagen （r=0.584,     

人工合成小分子多肽P16抑制大鼠肾小管上皮细胞纤维化的初步研究

目的 观察人工合成的与结缔组织生长因子(CTGF)同源的16个氨基酸小分子多肽(P16)能否与CTGF竞争性地和CTGF受体相结合,以阻止大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)转分化为肌纤维母细胞,并抑制细胞纤维化的发生.方法 以NRK-52E细胞株为实验对象,用异硫氰酸荧光素标记P16(FITC-P16),激光共聚焦显微镜观察P16和CTGF与细胞竞争性结合能力.用CTGF诱导NRK-52E细胞并加入P16竞争结合,通过细胞免疫荧光和RT-PCR分别在蛋白和基因水平上检测反映NRK-52E细胞向肌纤维母细胞转化的α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth action muscle protein, α-SMA)和反映NRK-52E细胞纤维化的胶原Ⅰ和Ⅳ.结果 CTGF能诱导NRK-52E细胞高表达α-SMA和胶原Ⅰ、Ⅳ.P16可与CTGF竞争性结合细胞表面的整合素аvβ3,并显著抑制CTGF诱导的α-SMA和胶原Ⅰ、Ⅳ高表达.结论 人工合成的小分子多肽P16可通过与CTGF竞争性结合于细胞表面,显著抑制CTGF的促细胞转分化和纤维化作用,可望成为抗纤维化治疗的一种新策略.     

PDGF与肝素对动脉SMCI,Ⅲ型前胶原mRNA表达及胶原蛋白合成？…

目的 研究,探讨血小板源生长因子（ｐｌａｔｅｌｅｔｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ,ＰＤＧＦ）和肝素对人主动脉平滑肌细胞（ｈｕｍａｎａｏｒｔａａｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅ,ｃｅｌｌ,ｈＡＳＭＣ）增殖,胶原蛋白的合成,分泌以及Ｉ,Ⅲ型前胶原ｍＲＮＡ表达和转移生长因子β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒβ－ＴＧＦ－β）ｍＲＮＡ表达的调节作用,方法＾３Ｈ－ＴｄＲ,＾３Ｈ－脯氨酸掺入及Ｎ     

内皮素1及内皮素受体A拮抗剂对人肾间质成纤维细胞的作用

目的 探讨内皮素1（ET－1）受体A拮抗剂（ETaRA）对人肾间质成纤维细胞（hRIF）的作用。方法 在体外培养的hRIF中进行如上试验：（1）MTT比色法检测细胞增殖情况。（2）逆转录多聚酶链反应法（RT－PCR）观察Ⅰ型胶原（ColⅠ）、转化生长因子β（TGF－β）、基质金属蛋白酶1（MMP－1）、金属蛋白酶组织抑制物1,2（TIMP－1,TIMP－2）mRNA表达的变化。结果 （1）ET－1（10^-11-10^-7mol/L,24h）可以促进hRIF增殖,10^-7mol/L增殖最显著（P＜0.05）,呈剂量相关;10^-7mol/L刺激8h,hRIF即明显增殖,24h达高峰（P＜0.01）。（2）ET－1（10^-11-10^-7mol/L,16h）可上调hRIFr ColⅠ、TGF-β、MMP-1、TIMP-1、TIMP-2mRNA表达,10^-7mol/L作用最显著（P＜0.05）,呈剂量相关。10^-7mol/L刺激hRIFs时,ColⅠmRNA在8h表达显著增加（P＜0.05）,24h达高峰;TGF－βmRNA在8h表达显著增加（P＜0.05）且达高峰;TIMP－1及TIMP－2mRNA在16h表达显著增加（P＜0.05）,24h达高峰;MMP－1mRNA在16h表达显著增加（P＜0.05）,且达高峰。（3）上述作用可特异地被ETaRA阻断。结论 ET－1可刺激hRIF增殖,并上调ColⅠ、TGF－β、MMP－1、TIMP－1、TIMP－2mRNA的表达,ETaRA可抑制上述反应。ET－1可能在上参与肾间质纤维化过程。     

氯沙坦对糖尿病肾病大鼠肾小球硬化的影响

目的:探讨氯沙坦对糖尿病肾病大鼠细胞外基质降解作用的机制.方法:采用链脲霉素(streptozotozin,STZ)诱导的糖尿病肾病大鼠模型,将大鼠随机分为正常组、模型组和氯沙坦组,16周后测血肌酐、尿素氮.对肾组织进行HE和Masson染色,计算肾小球硬化指数.Western免疫印迹测定肾脏Ⅳ型胶原和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的蛋白表达量,real time-PCR方法检测肾组织Ⅳ型胶原mRNA,转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)mRNA和CTGF mRNA的表达水平.结果:氯沙坦组血尿素氮、肾小球硬化指数及肾组织Ⅳ型胶原、CTGF蛋白表达均低于模型组(均P<0.05);Ⅳ型胶原mRNA,TGF-βJ mRNA及CTGF mRNA的表达水平均低于模型组(均P<0.05).结论:氯沙坦可能通过抑制TGF-βl和CTGF,减少Ⅳ型胶原积聚,减轻肾小球硬化.     

吡格列酮对肾小管上皮细胞转分化及CTGF表达的影响

目的 探讨吡格列酮能否负性调节转化生长因子β(TGF-β)诱导的肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞(TEMT),以及抑制TGF-β下游介质结缔组织生长因子(CTGF)表达,以阐明吡格列酮抗肾纤维化的作用及机制.方法 将体外培养的正常大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)分为空白对照组、TGF-β3 ng/mL诱导组、TGF-β3 ng/mL+DMSO组、不同剂量吡格列酮阻断组.应用倒置相差显微镜观察细胞形态,免疫组织化学、RT-PCR方法 定性及定量检测肌成纤维细胞特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA);RT-PCR方法 定量检测CTGFmRNA的表达;ELISA法测定培养细胞上清液中Ⅲ型胶原的含量.结果 ①TGF-β诱导组细胞从原来典型的上皮细胞形态转变为长梭形肌成纤维细胞形态;免疫组织化学染色见大量α-SMA阳性细胞,与对照组相比,α-SMAmRNA表达量增加(P＜0.05);CTGF mRNA表达量增加(P＜0.05);细胞培养上清液中Ⅲ型胶原的含量增加(P＜0.05).②吡格列酮阻断组明显抑制TGF-β诱导的NRK52E细胞形态学改变;各剂量组均能抑制TGF-β诱导的α-SMA mRNA、CTGF mRNA表达及Ⅲ型胶原分泌(P＜0.05),且呈剂量依赖(P＜0.05);③相关分析显示,CTGF mRNA与α-SMA mRNA、Ⅲ型胶原的分泌呈正相关(r=0.975,0.988,P均＜0.01).α-SMA mRNA与Ⅲ型胶原的分泌呈正相关(r=0.952,P＜0.01).结论 吡格列酮能够抑制TGF-β诱导的TEMT及Ⅲ型胶原的分泌,对肾间质纤维化具有负性调节作用;吡格列酮抑制TGF-β诱导的CTGF表达可能是其负性调节TEMT的机制之一.