原位核酸杂交在肿瘤分子病理学中的应用

近十年来,由于重组DNA技术取得了很大的进展,推动了分子病理学研究的深入开展,其主要标志之一,是原位核酸杂交技术的建立及其应用。该技术是依据多核苷酸链中碱基互补原理,利用特别制备的DNA或RNA探针(Probe),在光镜或电镜下高度特异的定位显示细胞内与探针具有同源互补性以靶核苷酸序列,从而可定经、定位乃至相对定量的研究各种靶基因片段的表达状况及其与宿主的组织与细胞病理形态学特征的关系。目前,这一技术的应用与发展十分迅速。本文拟就探针的制备,杂交方法以及在肿瘤学研究中的应用概况作一综述。     

基因转移与鼻咽细胞癌变的研究 Ⅱ.EB病毒基因插入宿主细胞的表达和基因产物

EB病毒引起鼻咽细胞癌变(始动因子)抑或对巴癌变的细胞起促进作用(促进因子),至今尚未有定论。不过癌前期增生细胞甚至正常鼻咽上皮细胞检出可能与细胞转化有关的EB病毒基因产物(EBNA)和EB病毒核酸的存在,是EB病毒在鼻咽癌变中起重要作用的线索。对于这种外加基因的进入方式,我们提出过不需通过病毒颗粒直接感染或细胞融合传递,可以通过DNA插入的基因转移方式进入宿主细胞。本文着重报导采用超声超滤方法和核酸原位杂交技术,分析EB病毒DNA的大分子和     

原位核酸杂交检测喉鳞状细胞癌人乳头状瘤病毒DNA

用生物素（Ｂｉｏｔｉｎ－１１－ｄｕｔｐ）经缺口翻译标记人乳头状瘤病毒（ＨＰＶ）６．１１．１６和３０亚型的ＤＮＡ探针，对４０例喉鳞状细胞癌石蜡切片进行原位核酸杂交。检出ＨＰＶＤＮＡ阳性结果为２３例（５７．５％），其中６例ＨＰＶ１１阳性（１５％），１４例ＨＰＶ１６阳性（３５％），３例ＨＰＶ３０阳性（７．５％），ＨＰＶ６全部阴性。对照实验组全部阴性。原位杂交阳性物质主要存在于癌细胞核内呈紫黑色阳性颗粒。实验结果表明，ＨＰＶ１１、１６、３０与喉鳞状细胞癌的发病有关，其中ＨＰＶ１６占优势。     

应用生物素标记探针对癌周肝硬变组织中HBV—DNA的原位分子杂交研究

在肝癌病因学的研究中,HBV感染与肝癌发生的关系最受到重视。许多资料显示,在乙肝及肝癌组织内有HBV-DNA的存在。然而,以往的此类研究多以Southern吸印法为主,难以获得HBV-DNA在单个肝细胞内的定位证据。本文应用晚近发展起来的原位分子杂交技术,对26例肝硬变组织中单个肝细胞内HBV-DNA的存在状态和分布特征进行了定位研究,讨论了可能的生物学意义,现报告如下。     

基因转移与鼻咽细胞癌变的研究——Ⅰ、检测DNA片段掺入的活靶细胞原位核酸杂交方法

近年,对癌变过程中外来基因的加入和癌基因被激活的研究领域受人们重视。过去我们曾报导一种分析基因转移方法,用只携带EB病毒基因而不产生病毒颗粒的Raji细胞的超声提取物,使正常细胞表达特异性EB病毒基因产物——核抗原,从而提出EB病毒基因转移和整合入宿主细胞的假说。 为了进一步探讨转化的淋巴细胞EB病毒基因能     

原位PCR法定位检测原发性肝细胞性肝癌组织中EB病毒核酸的临床意义

目的：定位检测肝癌组织中EB病毒核酸的存在与否。方法：以EB病毒持续感染细胞系B95-8细胞为模型，建立检测EB病毒EBNAl基因的原位PCR法；并对四川达州地区PCR阳性的肝癌标本进行定位检测。结果：证实EB病毒核酸存在于部分肝癌组织细胞中。结论：肝癌的发生与EB病毒感染可能相关。本研究结果提示不同病毒的某个基因共性区，可导致癌变。     

原位PCR法定位检测原发性肝细胞性肝癌组织中EB病毒核酸的临床意义

目的:定位检测肝癌组织中EB病毒核酸的存在与否.方法:以EB病毒持续感染细胞系B95-8细胞为模型,建立检测EB病毒EBNAl基因的原位PCR法;并对四川达州地区PCR阳性的肝癌标本进行定位检测.结果:证实EB病毒核酸存在于部分肝癌组织细胞中.结论:肝癌的发生与EB病毒感染可能相关.本研究结果提示不同病毒的某个基因共性区,可导致癌变.     

运用原位DNA末端标记法研究细胞凋亡对乳腺癌预后的影响

研究临床乳腺癌标本中细胞凋亡的发生情况,评价其在预测后在的意义。方法搜集９１例浸润性乳腺癌的石蜡组织切片,运用原位ＤＮＡ断裂位点的末端标记法,检测细胞凋亡,计算凋亡细胞占肿瘤细胞的百分比,求得凋亡指数。结果本组病例细胞凋亡发生率为９１．２％,凋亡指数分为两组：０～０．２１和０．２８～０．６２,凋亡指数高低与腋淋巴结转称相关（Ｐ＜０．０１）。生存率单因素分析中,凋亡指数高的病例,无病生存率（Ｐ＝０．００９５）及总生存率（Ｐ＝０．０３４８）均优于凋亡指数低的病例。但Ｃｏｘ模型多因素分析末能指示凋亡指数是一个独立的预后指标。结论在乳腺癌组织中,细胞凋亡是一种自发现象,其发生情况各有不同,研究初步提示了细胞凋亡在乳腺癌预后中的作用,了解了凋亡和腋淋巴结转移的相关性。     

反义核酸抑制靶基因表达对EB病毒转化细胞的生长控制研究

背景与目的：近年研究表明,EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV)潜伏性膜蛋白基因（latent membrane protein gene,LMP)在鼻咽癌的发生和发展中起着重要作用。本研究着重构建体外基因反义转录系统,研究反义LMPmRNA对EBV转化细胞基因表达的抑制作用。方法：构建和制备反义核酸单链有效的体外转录系统;设计和建立反义原位示踪技术,以探测正、反义链配对互补聚合体的定位;通过对EBV转化细胞系（C1936和B95－8）的反义控制,测定细胞生长的抑制率,观测转化细胞凝集表型;通过对EBV－LMP基因表达的检测和MTT吸收活性的测试,测定转化细胞在基因转录下调之后的生存状态。结果：构建成制备反义RNA的SP6／T7双向启动子的体外基因转录系统。反义工程产物AsLMPmRNA通过胞饮作用掺入转化细胞后,经原位示踪显示,正－反义链聚合物的封闭位点主要在mRNA前体剪接加工成熟的后阶段;转化细胞增殖能力下降（生长抑制率85．5％）,细胞转化的凝集表型受抑制,MTT吸收值显著降低,显示被反义控制的C1936和B95－8细胞系的生长受到严重的抑制。应用反义原位示踪系统（antisense tracing system in situ,ATSIS)显示,AsLMPmRNA有特定靶点和抑制效应。结论：本实验所建成的体外反义转录系统所制备的RNA反义工程产物（AsLMPmRNA),有特定的选择靶点作用和高效的生物活性（特定基因LMP表达负调节）。这为反义控制转化细胞和开发反义基因工程药物提供了重要依据。     

肿瘤促进物TPA对三株大鼠食管细胞的作用及其与细胞致瘤能力关系的研究

肿瘤促进物TPA(12—0—四癸酰基佛波—13—乙酸酯)是从巴豆中提取的。我国传统医学曾用它作泻药;现有研究证明,TPA是小鼠皮肤肿瘤促进物。本文研究TPA对三株大鼠食管上皮细胞株(RE149、REB_2和REB_2T)的作用,以及这一作用与细胞致瘤能力的关系。三株大鼠食管细胞中的RE149是非致瘤性细胞株,REB_2是前致瘤性细胞株,REB_2T是致瘤性细胞株。本研究比较了这三株细胞对TPA的不同反应性。结果表明,0.1—1200ng/ml范围内的TPA的作用不提高三株细胞的克隆形成率。10ng/ml TPA可诱导RE149细胞经历终末期分化和完全抑制增殖。与此相反,400—800ng/ml的TPA不能明显抑制细胞生长。由此可见,三株细胞对TPA的不同反应性与它们的致瘤能力密切相关。TPA可否用于临床鉴别肿瘤细胞和正常细胞值得进一步研究探讨。     

糖基转移酶反义核酸对人脑胶质瘤细胞SWO-38作用的分子机理

背景与目的:红细胞系列的鞘糖脂与很多人类肿瘤的生物学活性相关。α1,4半乳糖糖基转移(α1,4-galactosyltransferase,α1,4Gal-T)是红细胞系列鞘糖脂合成的特异的糖基转移酶。本实验目的是研究α1,4Ga反义寡核苷酸对脑胶质瘤细胞系SWO-38的作用及其分子机理。方法:人工合成α1,4Gal-T基因的反义寡核苷酸采用脂质体介导的基因转染方法将α1,4Gal-T基因反义核酸转入SWO-38细胞中。应用RT-PCR检测其对α4Gal-TmRNA表达的影响,应用克隆形成实验检测其对细胞增殖的作用,应用流式细胞术(FCM)和琼脂糖凝胶电检测细胞凋亡的发生,应用FCM检测细胞fas、p53、bax和bcl-2表达的变化。结果:细胞转染反义核酸后,经RT-P检测证实其α1,4Gal-TmRNA基因的表达下降;克隆形成实验显示细胞生长明显受到抑制(P<0.01);DNA电泳像呈凋亡表现;FCM检测表明,导入α1,4Gal-T基因反义核酸的SWO-38细胞凋亡明显增加(P<0.05),bcl-2蛋表达显著下降(P<0.01),而fas和bax蛋白表达显著提高(P<0.01),p53蛋白表达无显著变化。结论:α1,4Ga基因硫代反义核酸可诱导脑胶质瘤细胞系SWO-38细胞凋亡,其机理与fas、bcl-2和bax基因调控及其相互作用关。     

荧光双标记法对乳腺癌细胞雌激素和孕酮受体原位观察及其临床意义

乳腺癌雌激素(ER)和孕酮受体(PR)的分析对选择治疗方案及判断预后有一定的价值。本研究用4-亚氨基罗丹明荧光素-17β雌二醇(4NHRho)和?S(α氨基丙酸)异硫氰酸荧光素-孕酮(6NHPF)对乳腺癌细胞的ER和PR同时进行荧光标记观察,初步探讨了本方法的临床意义。     

应用比较性基因组杂交对中心母细胞-中心细胞性非何杰金淋巴瘤的分子细胞遗传学分析

自从Brill等(1925年)首次将中心母细胞-中心细胞淋巴瘤的滤泡型描述为全身性淋巴结与脾脏的巨淋巴滤泡增生症以及Symmers(1927年)将其描述为滤泡性淋巴结病伴脾肿大以来,本病已成为非何杰金淋巴瘤(NHL)中最清楚明确的一个类型。这一B细胞肿瘤在所有重要的分类系统中被视为一个独立的类型,如在Kiel分类中,称之为中心母细胞-中心细胞淋巴瘤的滤泡型,在Lukes/Collins分     

活化NK细胞对移植物抗癌效应的促进和对移植物抗宿主病的抑制作用

尽管异基因骨髓移植可引起致死性移植物抗宿主病(GVHD),但发现存活的患者往往可获得更佳的抗癌效果,被称为移植物抗癌效应(GVT).预防GVHD的主要办法是去除移植骨髓中残留的T细胞,但往往对骨髓植入不利并易复发肿瘤.由于大部分自发肿瘤为弱或无免疫原性,MHC非限制性杀伤则可能承担重要的抗癌任务.已知IL-2活化NK在体内具有抗癌效应,本研究又发现供者IL-2活化NK细胞可促进异基因骨髓植入并抑制异基因骨髓中残留的T细胞导致的GVHD,从而促使我们进一步观察IL-2活化NK细胞在荷瘤小鼠的异基因骨中对GVT和GVHD效应的影响.C57BL/6小鼠荷结肠癌MCA-38,该瘤静注后仅转移于肺部并形成肺结节.在小鼠荷瘤10天后行致死照射并行异基因BMT(来源于BABL/c鼠),由于小鼠骨髓含T细胞极少,故在异基因BMT同时静脉注入供者脾细胞以形成CVHD状态.     

外周血和鼻咽组织EB病毒DNA检测对鼻咽癌诊断和防控的临床观察

目的探讨外周血和鼻咽组织EB病毒DNA检测对鼻咽癌诊断和防控的临床意义以及鼻咽腔冲洗对防控鼻咽癌的价值。方法选取2010年12月至2012年4月55例鼻咽癌患者为观察组,抽取同期55例健康者为对照组,采用EB病毒DNA PCR荧光定量检测技术检测外周血和鼻咽组织EB病毒DNA,比较鼻咽癌患者与健康者外周血和鼻咽组织EB病毒DNA检测结果。对另外1组67例EB病毒抗体阳性而鼻咽活检结果为阴性者进行鼻咽腔冲洗,比较治疗前、后EB病毒抗体检测结果。结果观察组患者外周血、鼻咽组织中EB病毒DNA阳性检出率均高于对照组健康者,差异均有统计学意义(均P<0.01)。经鼻咽腔冲洗治疗后,EB病毒抗体阳性者检测转阴率为19.4%,患者临床症状明显改善。结论鼻咽组织EB病毒DNA检测有助于鼻咽癌的临床诊断,对EB病毒抗体阳性者进行鼻咽腔冲洗治疗对于鼻咽癌的防控具有重要意义。     

临床应用同种LAK细胞是否导致移植物抗宿主病的初步观察

应用V50血液成分分离系统分离正常人外周血淋巴细胞,在1000U/ml rIL-2条件下诱导LAK活性,然后以1×10~(10)细胞量输入患者体内,于输入前及输入后2月、6月分别测定患者外周血淋巴细胞对ConA的增殖反应、对IL-2的反应性及IL-2产量,结果表明上述指标在输入前后无显著差别,临床观察及皮肤活检均未观察到GVHD征象,提示同种LAK细胞的临床应用并未导致GVHD。     

荧光定量PCR法检测外周血淋巴细胞中EB病毒DNA含量对鼻咽癌诊断及预后的价值

目的　评价外周血淋巴细胞中EB病毒DNA含量对鼻咽癌诊断及预后的价值。方法　采用荧光定量PCR方法检测 52例鼻咽癌患者和 127例非鼻咽癌患者外周血淋巴细胞中EB病毒DNA含量。结果　鼻咽癌患者中EB病毒DNA的阳性率为 55 76% (29 /52),对照组阳性率为 8 66% (11 /127),阳性率差异有显著性P<0. 01。早期(Ⅰ、Ⅱ期)鼻咽癌患者EB病毒DNA含量与晚期 (Ⅲ、Ⅳ期 )比较有显著性差异(P<0 05)。结论　荧光定量PCR方法检测外周血淋巴细胞中EB病毒DNA含量在鼻咽癌的诊断上有极高价值,可作为判断疗效及监测病情的一种有效手段。     

双歧杆菌及其表面分子对MNNG致小鼠肠粘膜细胞DNA损伤的抑制作用

单细胞凝胶电泳是一种新近发展起来的快速、敏感地检测单个哺乳动物细胞ＤＮＡ断裂的技术。本文用单细胞凝胶电泳法检测了双歧杆菌及其表面分子———脂磷壁酸、细胞壁肽聚糖对Ｎ－甲基－Ｎ－硝基－Ｎ′－亚硝基胍（ＭＮＮＧ）致小鼠肠粘膜细胞ＤＮＡ损伤的抑制作用。结果双歧杆菌活菌、死菌、脂磷壁酸、细胞壁肽聚糖、双歧杆菌培养乏液在小鼠胃肠反复作用一段时间后，均具有抑制ＤＮＡ损伤的作用，以活菌、死菌作用最强，活菌作用强于死菌，脂磷壁酸和肽聚糖作用次之，二者间无显著性差异，培养乏液也有轻微作用。双歧杆菌及其表面分子的这种抑制ＤＮＡ损伤作用机理，可能是通过结合ＭＮＮＧ，并提高免疫监视功能清除ＭＮＮＧ结合物及ＤＮＡ损伤的细胞。     

酶联免疫斑点法检测鼻咽癌患者放疗前后T细胞对EB病毒肽段的特异性反应

目的 用酶联免疫斑点法（ELISPOT法）检测鼻咽癌患者放射治疗前后免疫反应性的变化,寻找与疗效相关的细胞免疫反应指标。方法 选择新疆医科大学附属肿瘤医院2007年6月~2008年12月由病理确诊的鼻咽癌初治患者41例,用ELISPOT法检测放射治疗前及治疗后3月患者外周血中CTL细胞对LMP1、LMP2 、EBNA1和EBNA3多肽反应性的差异,并分析其与近期疗效的关联性。结果 放射治疗后CR 36例,PR 4例,PD 1例;放射治疗后3月,外周血中对LMP1抗原多肽产生特异性反应的CTL细胞频数显著增加（P=0.004）,对LMP2 、EBNA1和EBNA3多肽反应性无统计学意义。不同疗效组之间放射治疗前后对LMP1抗原多肽产生特异性反应的CTL细胞频数差异有统计学意义。结论 鼻咽癌患者放射治疗前及放射治疗后3月,应用ELISPOT法,检测外周血LMP1抗原相关多肽的变化可能有助于临床疗效的判定,为今后个体化免疫治疗方案的实施提供实验室依据。     

阿糖胞苷增强白血病细胞B7分子表达及促进双功能抗体对靶细胞的杀伤

目的：研究阿糖胞苷(cytarabine,AraC)对白血病细胞共刺激分子B7表达的影响,以及联合双功能抗体antiCD3/antiPgp介导T细胞对耐药白血病细胞的杀伤作用。方法：应用流式细胞术检测白血病细胞株K562和多药耐药白血病细胞株K562/A02细胞经AraC刺激不同时间后B71、B72分子的表达,RTPCR方法检测B71mRNA、B72 mRNA的表达,MTT法检测经AraC刺激的K562和K562/A02细胞对T淋巴细胞增殖的影响。CytoTox 96非放射性细胞毒性分析检测AraC联合antiCD3/antiPgp微型双功能抗体对人外周血淋巴细胞杀伤K562和K562/A02靶细胞的影响。结果：经AraC刺激的K562和K562/A02细胞B71、B72分子的表达较对照组明显升高;MTT结果显示,经AraC刺激的K562和K562/A02细胞能促进T淋巴细胞增殖;AraC联合antiCD3/antiPgp双功能抗体在0.39∶1~25∶1效靶比范围内,随着效靶比的升高,介导T淋巴细胞对K562和K562/A02细胞的杀伤率随之提高,对高表达Pgp的耐药K562/A02细胞尤为明显。结论：AraC可上调白血病细胞B7分子的表达,从而增强antiCD3/antiPgp双功能抗体介导的T细胞对靶细胞的体外杀伤作用。