不同胎龄大鼠神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化的比较

背景:胚胎来源干细胞的分化潜能不仅受到诱导条件影响,也受来源胚胎胚龄的影响.目的:实验拟观察不同胎龄大鼠中脑神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化能力.设计:随机对照观察.单位:中山大学附属第一医院神经外科.材料:实验于2007-03/2007-09在中山大学附属第一医院实验室完成.成年孕SD大鼠30只,体质量350～400 g,由中山大学动物实验中心提供.许可证号码为SCXK(粤)2007-0034.实验过程中对动物处置符合动温桌硌П曜?DMEM/F12无血清培养液、B27添加剂、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、体积分数为0.1的胎牛血清为英国Gibco公司产晶;白细胞介素1α,白细胞介素11、胶质细胞源性神经营养因子购自美国R&D公司:白血病抑制因子购自英国PEPROTECH公司:酪氨酸羟化酶抗体购自美国Santa Cruz公司;巢蛋白抗体、微管相关蛋白2抗体及胶质纤维酸性蛋白抗体为美国CHEMICON公司产品.方法:①分别于大鼠孕10,12,14,16,18天摸球法随机选取6只,麻醉后处死孕鼠,无菌条件下剖腹取胚胎,分离中脑腹侧脑组织进行神经干细胞培养.在含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中分别培养不同胎龄大鼠脑神经干细胞,经传代扩增后,在含白细胞介素1α、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中向多巴胺能神经元分化.②诱导分化6 d后观察分化细胞生长情况并进行免疫细胞化学鉴定:酪氨酸羟化酶染色标记后通过流式细胞仪检测分化的多巴胺能神经元比率.主要观察指标:①不同胎龄大鼠神经干细胞诱导分化后生长情况及免疫细胞化学鉴定结果.②神经干细胞诱导分化后酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的比率.结果:①孕10,12,14,16,18 d胚胎大鼠中脑神经干细胞球在诱导分化液中贴壁生长,球内细胞从球体中央逐渐向外呈放射状生长,分化6天的细胞多数有1～2个长突起或有多个短突起.神经球经巢蛋白免疫细胞化学染色,大部分细胞胞浆染色呈阳性.②孕10,12,14,16,18 d胚胎大鼠中脑神经干细胞在诱导分化液中培养6 d后.流式细胞仪检测其诱导分化成酪氨酸羟化酶阳性细胞的比率分别为(10.3±2.5)%,(21.6±3.4)%,(16.7±2.8)%,(14.2±3.2)%,(8.9±1.8)%,各组间比较差异均有显著性意义(P<0.05),其中孕12 d大鼠中脑神经干细胞诱导分化成多巴胺能神经元比例最高.结论:不同胎龄大鼠中脑的神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化的能力不同,以孕12 d诱导分化成多巴胺能神经元比例最高.     

表皮生长因子对脑源性神经生长因子诱导体外培养大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的影响

目的:获得大量神经干细胞并且能够控制其向神经元定向分化可为进一步修复损伤大脑和治疗退行性神经系统疾病奠定种子细胞基础,实验观察了表皮生长因子对脑源性神经生长因子诱导神经干细胞向神经元分化过程中的影响.方法:实验于2007-08在中国医科大学神经解剖研究室完成.①材料:清洁级雄性成年SD大鼠3只,由中国医科大学实验动物部提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:无菌条件下分离大鼠脑海马组织,胰蛋白酶消化后采用无血清培养技术体外培养神经干细胞,传至第4代克隆球直径约为200 μ m时,滴加DMEM/F12 2?7 20μg/L表皮生长因子 20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子 条件培养液(细胞原代培养第7天的上清液的过滤液),进行单细胞克隆培养,传代的神经干细胞分成空白对照组、表皮生长因子组、脑源性神经生长因子组、表皮生长因子 脑源性神经生长因子组.空白对照组培养液为含体积分数0.1胎牛血清的DMEM/F12,其余3组培养液在此基础上分别加入各自对应的细胞因子培养1周,表皮生长因子浓度为20 μg/L,肺源性神经生长因子浓度为50 μg/L.③实验评估:传代后的克隆球进行神经干细胞免疫细胞化学染色鉴定.计数神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率,检测神经干细胞向神经元的分化情况.结果:①单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达.②与空白对照组神经干细胞分化为神经元的比例比较,表皮生长因子组有所降低:脑源性神经生长因子组、表皮生长因子 脑源性神经生长因子组均明显提高(t=2.309～2.779,P＜0.05),且后者提高幅度尤为显著(t=2.309,P＜0.05).结论:表皮生长因子可以提高脑源性神经生长因子诱导成年大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的比例.     

人脐静脉间充质干细胞体外诱导分化为神经元的可行性

目的:探讨来源于人脐静脉内皮及内皮下层间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的可行性,分析体外分离纯化、原代及传代培养的最佳条件,为神经组织修复选择理想的种子细胞来源.方法:实验于2006-04/12在辽宁医学院解剖学实验室完成.①对象:取正常健康产妇顺产或剖宫产的新生儿脐带20条,由辽宁医学院附属第一医院提供,产妇及其家属均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:无菌条件下用1 g/LⅠ型胶原酶消化脐静脉内皮及内皮下层,收集的细胞按5×107 L-1,1×108 L-1,5×108 L-1,1×109 L-1,3×109 L-1密度接种进行原代培养,待细胞80%融合时胰酶消化传代.取第2代细胞,诱导组经含有3 μmo/Lβ-巯基乙醇、20%胎牛血清的DMEM预诱导液处理后,换成含10 g/L二甲基亚砜、100 mmol/L丁化羟基茴香醚的无血清DMEM诱导液进行诱导.未诱导组将诱导液更换为无血清DMEM.③实验评估:记录原代培养过程中不同接种密度细胞贴壁所需时间.免疫细胞化学检测诱导前细胞表面抗原血管性血友病因子、CD166的表达及诱导后细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白的表达,倒置相差显微镜下计数阳性细胞分化率.结果:①不同接种密度细胞贴壁所需的原代培养时间比较:5×107 L-1组仅有1孔细胞贴壁呈克隆样生长,但培养至28 d时仍不能传代,其余培养孔均无细胞贴壁生长.与1×108 L-1组比较,5×108 L-1,1×109 L-1,3×109 L-1组细胞贴壁生长的原代培养时间均明显缩短(P < 0.05),且后3组比较差异无显著性意义(P > 0.05).②贴壁细胞表面抗原检测:CD166呈阳性,血管性血友病因子呈阴性.③诱导分化:诱导组脐静脉间充质干细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶呈阳性表达,不表达胶质纤维酸性蛋白.巢蛋白阳性细胞率为(9.5±1.2)%,神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率为(15.6±2.6)%.未诱导组以上3种标志均不表达.结论:①在体外可以成功分离培养获得人脐静脉内皮及内皮下层的间充质干细胞,其原代培养细胞的种植密度以5×108 L-1～ 1×109 L-1为佳.②细胞传2代后性质相对均一,基本无造血细胞和内皮细胞污染,达到纯化目的,具有间充质干细胞特点.③在化学诱导剂β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基茴香醚联合作用下,其可以向神经元样细胞分化.     

表皮生长因子培养条件下脑源性神经生长因子诱导大鼠海马神经干细胞向神经元分化的最佳浓度

背景：目前神经干细胞的定向分化是神经干细胞研究的热点。脑源性神经生长因子作为诱导剂可否诱导神经干细胞分化为神经元。目的：观察在表皮生长因子培养条件下,不同质量浓度脑源性神经生长因子对成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化的影响。设计：对比实验。单位：中国医科大学人体解剖学教研室。材料：实验于2007-08在中国医科大学神经解剖研究室完成。提取成年SD大鼠海马神经干细胞,无血清技术培养。清洁级成年SD大鼠3只,体质量200-250g,由中国医科大学实验动物部提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。实验过程中应用的表皮生长因子、脑源性神经生长因子均由R＆D公司提供。方法：①无菌条件下分离大鼠海马组织,用含碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、B27的无血清细胞培养技术体外培养神经干细胞。②取第4代神经干细胞,利用有限稀释法进行单细胞克隆培养。将单细胞克隆传代后的克隆球细胞进行神经干细胞的鉴定。克隆球细胞行巢蛋白免疫细胞化学染色,诱导分化1周后进行神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色。③单细胞克隆的神经干细胞脑源性神经生长因子诱导分化实验,根据脑源性神经生长因子质量浓度不同分成0μg/L浓度的对照组和50、100、150、200μg/L浓度的4个实验组,各组的培养液中均加入表皮生长因子,诱导分化1周后进行神经元特异性烯醇化酶免疫细胞化学染色,检测神经干细胞向神经元分化情况。主要观察指标：神经干细胞分化为神经元的比例。结果：①神经干细胞免疫细胞化学染色结果显示,单细胞克隆培养后克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。②50,100μg/L组脑源性神经生长因子组神经干细胞分化为神经元比例明显高于对照组、150,200μg/L脑源性神经生长因子组组（t=2.502-5.025,P〈0.05）;50,100μg/L脑源性神经生长因子组之间神经干细胞分化为神经元的比例差异不显著（P〉0.05）;对照组、150,200μg/L组3组间神经干细胞分化为神经元比例差异不显著（P〉0.05）结论：在20μg/L表皮生长因子培养条件下,脑源性神经生长因子促使神经干细胞向神经元分化的较佳质量浓度为50μg/L。     

人神经干细胞移植到缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑内的存活及分布

目的:新生儿缺氧缺血性脑病是导致脑性瘫痪的重要原因,至今缺乏有效疗法.将体外培养的人神经干细胞经脑室移植入缺氧缺血性脑损伤新生鼠,观察植入细胞在宿主脑内的存活、迁移及分化.方法:实验于2005-01/09在解放军海军总医院儿科实验室完成.①对象:神经干细胞来源于孕12周流产的人胎儿脑组织,孕妇签署知情同意书,符合医院伦理委员会规定.清洁级SD新生鼠80只,随机数字表法分为细胞移植组、模型对照组,40只/组,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:取人胚胎脑组织,机械分散法分离单个核细胞,接种于添加表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子的N2培养基中,获取生长旺盛的人神经干细胞球,制成单细胞悬液,浓度约为5.0×1011L-1,培养6 d后行PKH标记用于植入后示踪.两组新生鼠均建立缺氧缺血性脑损伤模型,造模后3 d,细胞移植组损伤侧脑室缓慢注入5 μL人神经干细胞悬液,模型对照组于相同部位注入等量生理盐水.③实验评估:取未经PKH标记的细胞球, 通过免疫细胞化学染色鉴定巢蛋白的表达及其向神经元、星形胶质细胞的分化情况.分别于细胞移植后1,2,4周及3个月,常规取脑组织,行免疫组织化学和荧光分析,观察植入后细胞存活及分布情况.结果:在造模及细胞移植过程中,因麻醉、出血细胞移植组新生鼠死亡5只,模型对照组死亡7只,存活率85%～90%.①神经干细胞的鉴定及分化:80%活细胞巢蛋白呈阳性表达,并可分化为神经元、星形胶质细胞.②神经干细胞植入后存活及分布情况:植入后1周,神经丝蛋白阳性细胞多位于损伤侧皮质及海马处,纹状体、脑干、小脑、嗅球也有少量分布.植入后2周,海马和皮质可见神经丝蛋白阳性细胞,胞体伸出的神经微丝更长,细胞数量与1周时基本相似.植入后4周及3个月时PKH阳性细胞数量明显减少.结论:在含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子的N2培养基中形成的人神经干细胞球,具有良好的增殖能力,可分化为神经元,移植至缺血缺氧新生鼠脑中能够向损伤区迁移,分布范围广.     

人脂肪组织源性干细胞分化为神经元样细胞的能力及可塑性

目的:脂肪组织源性干细胞分化为神经元样细胞并表达神经元信号已有报道.实验拟观察人脂肪组织源性干细胞定向诱导分化为神经元样细胞的可能性.方法:实验于2003-09/2005-06在沈阳脑科医院试验中心完成.腹部脂肪由沈阳市第一医院普外科提供,患者对实验知情同意,并经医院伦理委员会批准.提取人脂肪组织分离、原代培养、扩增脂肪组织源性干细胞,以免疫荧光化学染色方法鉴定细胞CD44,CD114,CD34的表达.取第二、三代细胞以PBS缓冲液冲洗后,用含有丁酸酯羟基茴香醚、KCL、丙戊酸、地塞米松、胰岛素的培养液诱导向神经细胞分化,采用免疫荧光化学染色方法鉴定神经元特异性烯醇化酶.结果:原代培养的脂肪组织源性干细胞为梭形散在细胞,培养至7 d左右细胞接近融合.荧光倒置显微镜下观察经免疫荧光染色,96.7%细胞呈CD44阳性, CD114抗体、CD34抗体呈阴性.神经元特异性烯醇化酶免疫荧光鉴定可见诱导后细胞出现类似轴突和树突样结构,有类神经元间网络形成,表达神经元特异性标志物神经元特异性烯醇化酶.结论:人脂肪组织源性干细胞可在体外扩增,在一定培养条件下,有分化为神经元样细胞的能力.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及成骨分化

目的建立大鼠骨髓间质干细胞（rat mesenchymal stern cells，rMSCs）体外分离、纯化及扩增的方法及诱导rMSCs向成骨分化，并进一步研究，提供理想的种子细胞。方法采用贴壁筛选法分离rMSCs，并通过不断传代进行纯化和扩增培养，检测rMSCs生长周期，绘制细胞生长曲线。检测碱性磷酸酶活性，钙结节的形成。结果rMSCs在体外分离培养扩增，rMSCs形态呈长梭形，细胞周期显示第3代MSCs约有81．48％的细胞处于G0／G1期，细胞生长曲线呈s形。经地塞米松、辟甘油磷酸钠、维生素C诱导的rMSCs，碱性磷酸酶染色呈阳性，并有钙结节形成。结论所建立的分离和培养方法获取的是rMSCs，具有rMSCs生物学特性，同时具有向成骨细胞分化的能力，是组织工程研究中良好的细胞来源，也为进一步研究提供了理想种子细胞。     

白细胞介素1β体外诱导鼠胚胎中脑神经干细胞的分化

目的:在神经干细胞移植治疗帕金森病过程中,有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的大量定向诱导分化尤为关键.以白细胞介素1β为诱导剂,观察鼠胚胎中脑神经干细胞向多巴胺能神经元的分化.方法:实验于2005-04/12在武汉大学医学院实验中心结构生物学实验室完成.①动物:清洁级孕12 d昆明鼠胚胎,由武汉大学医学院实验动物中心提供,动物质量合格证号为昆字2005,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:分离胎鼠脑膜,取中脑组织,胰蛋白酶消化,离心过滤后机械法传代.取传代培养5～7 d的神经球,按(20～30)个/cm2接种,白细胞介素1β组加入含200 ng/L白细胞介素1β、体积分数为0.1胎牛血清的DMEM/F12培养基进行诱导分化,空白对照组单纯加入体积分数为0.1胎牛血清的DMEM/F12培养基予以自然分化.③实验评估:诱导10～12 d,待80%细胞从神经球迁移出来并分化为单细胞时行免疫细胞化学鉴定,流式细胞术检测酪氨酸羟化酶阳性细胞率.结果:①免疫细胞化学鉴定:神经球细胞表达巢蛋白抗原,能分化为神经元特异性烯醇化酶、胶原纤维酸性蛋白阳性细胞.白细胞介素1β组可见酪氨酸羟化酶阳性细胞,胞体较大,圆形和椭圆形居多,酪氨酸羟化酶位于胞质及突起中,胞核无表达,突起呈酪氨酸羟化酶阳性神经元典型的串珠样形态.空白对照组酪氨酸羟化酶阳性神经元在数量、细胞成熟形态上均未达到白细胞介素1β组水平.②中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化的阳性率:白细胞介素1β组酪氨酸羟化酶阳性细胞率明显高于空白对照组(P < 0.01).结论:白细胞介素1β可明显促进中脑神经干细胞分化为数量足够、形态及功能成熟的多巴胺能神经元.     

创伤性脑组织匀浆对大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的影响

目的:骨髓间充质干细胞在脑组织匀浆诱导环境下可以转化为神经元样细胞,损伤脑组织匀浆的骨髓间充质干细胞培养液中,不仅有脑组织中提取的生长因子,而且有骨髓间充质干细胞分泌的多种生长因子,共同刺激骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化.实验观察了创伤后24 h和正常脑组织匀浆诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的差别.方法:实验于2007-03/08在河北医科大学解剖教研室细胞培养中心完成.①实验材料:体质量100~150 g的健康SD大鼠由河北医科大学实验动物中心提供,4~6周龄,清洁级.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:取1只 SD大鼠,麻醉后分离股骨和胫骨,用培养基冲洗骨髓腔,离心弃上清液,加入含体积分数为0.10胎牛血清的L-DMEM培养基重悬,接种于培养瓶培养并传代,于倒置显微镜下观察细胞形态.采用Gruncr改良法制作中度脑损伤大鼠模型,取伤后 24 h和正常大鼠脑组织匀浆,对体外培养的第3代骨髓间充质干细胞进行诱导.③实验评估:在倒置显微镜下观察细胞形态学变化,并应用免疫细胞化学技术检测细胞内神经元特异性烯醇化酶的表达,比较创伤后和正常脑组织匀浆两组诱导率差别.结果:骨髓间充质干细胞经创伤性脑组织匀浆培养基诱导24 h后,细胞的胞体变大,36 h后部分细胞分化,回缩成圆形或梭形,48 h后部分细胞可见两个或多个突起伸出,类似神经元.免疫细胞化学技术检测显示,创伤性脑组织匀浆培养基诱导组神经元特异性烯醇化酶阳性表达为(54.28±6.03)%,正常脑组织匀浆诱导分化率较前者低,神经元特异性烯醇化酶阳性表达为(32.76±3.25)%,细胞生长状态略差.结论:脑组织匀浆可诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化,创伤性脑组织匀浆可明显促进其分化.     

神经干细胞诱导分化为多巴胺能神经元与胚胎中脑多巴胺能神经元移植治疗帕金森病效果比较

目的:目前对于体外诱导分化的多巴胺能神经元的生物学功能、体内存活状况,以及与胚胎中脑多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠的疗效比较方面尚缺乏深入的研究.观察神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠的作用,并与胚胎中脑多巴胺能神经元组织移植治疗帕金森病大鼠的疗效进行比较.方法:实验于2006-06/2007-09在中山大学附属第一医院完成.①实验材料:健康成年雄性SD大鼠及孕14～15 d的SD大鼠由中山大学动物实验中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:在含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中培养胚胎大鼠中脑神经干细胞.经传代扩增后,在含白细胞介素1a、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中向多巴胺能神经元分化,并进行免疫细胞化学鉴定和流式细胞仪检测.参考Sauer和Lee等方法制备帕金森病大鼠模型,并将造模成功大鼠随机分组,每组9只:分化细胞组向每一坐标点注入1×1011 L-1神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元;胚胎中脑组注入 1×1011 L -1胚胎中脑多巴胺能神经元;手术对照组注入DMEM/F12细胞培养液.③实验评估:移植术后10、20、40、60 d诱发大鼠不对称旋转行为以观察治疗效果,并对移植区进行酪氨酸羟化酶免疫组织化学检测以了解移植细胞体内存活的情况.结果:①大鼠神经干细胞球在诱导分化液中呈贴壁生长,球内细胞从球体中央逐渐向四周分化扩展出形态各异的细胞.免疫细胞化学染色显示,分化细胞中含有酪氨酸羟化酶染色阳性细胞.流式细胞仪检测诱导分化6 d的细胞中酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的比率为(16.7±2.8)%.②移植后20 d分化细胞组大鼠的不对称旋转行为开始明显下降(P < 0.05).移植后40 d和60 d,分化细胞组大鼠的旋转圈数与胚胎中脑组比较差异不显著(P > 0.05).③分化细胞组和胚胎中脑组大鼠纹状体移植区有酪氨酸羟化酶染色阳性细胞,多数细胞位于移植针道边缘.结论:神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元与胚胎中脑多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠具有相同的疗效.     

脑源性神经营养因子对胎鼠神经干细胞向神经元方向分化的诱导

背景:神经元是中枢神经系统起主导功能的细胞,培养干细胞的最终目的是获得相应表型的神经元,从而促进中枢神经系统损伤的修复。但以往相关文献显示神经干细胞分化为神经元的比例不到30%。目的:以脑源性神经营养因子作为诱导分化剂,观察其对胎鼠源性神经干细胞向神经元方向分化的作用。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-06/2007-08在南京医科大学第一附属医院中心实验室完成。材料:清洁级孕14~17d的SD大鼠10只,诱导分化剂脑源性神经营养因子为Peprotech产品,胎牛血清为杭州四季青产品。方法:孕鼠处死后取出胚胎,剪碎后机械法体外分离培养神经干细胞,锥虫蓝染色计数,调整细胞密度为2×106,添加B27及碱性成纤维细胞生长因子,置于37℃、体积分数为0.05的CO2恒温箱中原代培养,待细胞克隆球明显增大、中央变暗时传代扩增。将培养所得的干细胞克隆球分为2组,诱导组添加体积分数为0.01的胎牛血清 20μg/L脑源性神经营养因子共培养,血清对照组仅添加体积分数为0.01的胎牛血清。主要观察指标:在倒置显微镜下观察细胞生长、贴壁和分化情况。诱导分化5d后,行神经元免疫组化鉴定,流式细胞仪检测神经元阳性细胞率。取原代培养未分化的神经干细胞及诱导分化3d的两组细胞,RT-PCR检测内源性bHLH基因MASH-1的表达。结果:原代培养可获得数十至数百个神经干细胞聚集在一起的神经克隆球,形态规则,立体感强;悬浮生长的克隆球经诱导分化后,逐渐失去其球状的立体外观,邻近克隆球发出的突起可相互连接,3d后即有神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞从克隆周围出现。培养的神经干细胞呈巢蛋白阳性表达,诱导分化后呈微管相关蛋白2阳性表达。与血清对照组比较,诱导组神经元阳性细胞率显著升高(χ2=16.0,P<0.05)。与未分化的神经干细胞比较,诱导组、血清对照组细胞MASH-1的表达均明显升高,且前者升高幅度明显强于后者(F=21.7,P<0.05)。结论:脑源性神经营养因子能促进神经干细胞向神经元方向分化,可能与内源性bHLH基因MASH-1的表达升高有关。     

抗坏血酸诱导新生鼠神经干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景:针对帕金森病进行细胞移植治疗的研究进程中,除寻求合适的细胞系外,如何将各种有分化潜能的细胞诱导为含量丰富、有功能的多巴胺能神经元尤为关键.目的:观察不同浓度抗坏血酸对神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-01/12在广西医科大学科学实验中心完成.材料:清洁级新生24 h内SD大鼠30只,由广西医科大学实验动物中心提供.抗坏血酸为Sigma产品.方法:取新生鼠脑组织,组织块胰蛋白酶消化法体外分离培养神经干细胞,传至第2代以5×108L-1密度接种.设立4组:空白对照组不给予抗坏血酸,仅加入含体积分数为10%的胎牛血清、2%B27的DMEM/F12培养基;剩余3组在此基础上分别加入50,100,200 μmol/L抗坏血酸进行诱导,10 d后终止诱导.主要观察指标:RT-PCR检测诱导后细胞酪氨酸羟化酶基因mRNA的表达,免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞,检测神经干细胞向多巴胺能神经元分化率.结果:各浓度抗坏血酸诱导组均得到795 bp的扩增片断,即均表达酪氨酸羟化酶mRNA.神经球具有自我更新和表达巢蛋白的能力,诱导分化后的细胞能表达神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞特异性抗原.与空白对照组比较,50,100,200 μ mol/L抗坏血酸诱导组酪氨酸羟化酶阳性细胞率均明显升高(P<0.05);且100,200 μ mol/L抗坏血酸诱导组升高幅度明显高于50 μ mol/L(P<0.05),100,200 μ mol/L抗坏血酸诱导组间比较无明显差异(P>0.05).结论:从新生鼠脑组织分离出的神经干细胞在体外具有自我更新、多向分化潜能及表达巢蛋白的能力.50～200 μ mol/L抗坏血酸均能促进神经干细胞向多巴胺能神经元分化,抗坏血酸浓度从100 μmol/L增加至200 μmol/L时酪氨酸羟化酶阳性细胞率无明显变化.     

全反式维甲酸诱导神经干细胞向神经元的分化

背景:目前研究证实全反式维甲酸在调控多种组织和细胞的增殖、生长发育、代谢以及维持内环境稳定等方面具有广泛生物学作用.目的:探讨全反式维甲酸诱导神经干细胞分化为神经元过程中的作用及其分子机制.设计、时间及地点:对照观察,体外细胞学实验,于2006-07/2007-06在上海同济大学附属医院实验室完成.材料:普通级孕13～14 d雌性SD大鼠6只,取胎鼠用于制备神经干细胞.诱导剂全反式维甲酸为Sigma公司产品.方法:取第3代神经干细胞,以2×108 L-1密度接种,分为全反式维甲酸诱导1 d,3 d,7d,10d组和空白对照组,各诱导组均加入1 μ mol/L全反式维甲酸,空白对照组仅加入等量生理盐水.主要观察指标:免疫荧光染色鉴定结果,计数分化为神经元的比例,应用半定量RT-PCR法检测维甲酸受体α mRNA的表达.结果:全反式维甲酸诱导后神经元特异性烯醇化酶染色呈阳性,细胞有多个细长突起,胞体呈绿色荧光,胞核呈蓝色荧光.与空白对照组比较,诱导3 d,7 d,10 d组神经元特异性烯醇化酶染色阳性细胞率均明显升高(P<0.05),且诱导7 d组达峰值.与空白对照组比较,各诱导组维甲酸受体α mRNA的表达量均明显升高(P<0.01).结论:全反式维甲酸能显著提高大鼠胚胎神经干细胞分化为神经元的比例,同时发现细胞维甲酸受体α mRNA的表达增加.     

人脐血源性间充质干细胞向心肌细胞的诱导分化(英文)

背景：与骨髓间充质干细胞相比，脐带血巾的细胞被视为“非常年轻”的细胞，其增殖和分化能力不会随着捐助者的年龄增加而减低，可能是一个极好的骨髓间充质干细胞的替代来源。目的：观察体外诱导脐血间充质干细胞分化成心肌细胞的特点。设计、时间及地点：观察性实验，于2005—03／2007—02在北京世纪坛医院完成。材料：收集获知情同意健康产妇脐血细胞。方法：分离单个核细胞，从中进一步分离间充质干细胞，传代培养至第3代，应用免疫荧光流式细胞仪标记间充质干细胞特异性抗原CD34，CD44和CD90。5-氮胞苷诱导分化4周后，免疫组织化学染色和反转录-聚合酶链反应分别检测心肌细胞标志物肌钙蛋白Ⅰ，GATA4和β-肌球蛋白重链的表达。主要观察指标：心肌细胞标志物肌钙蛋白Ⅰ，GATA4和β肌球蛋白重链的表达。结果：脐血源性间充质干细胞经5-氮胞苷诱导分化后，呈现成纤维细胞样形态和克降增殖特点。免疫分型与骨髓来源间质干细胞一致，且免疫组织化学染色和反转录-聚合酶链反可检测到肌钙蛋白Ⅰ，GATA4和β-肌球蛋白重链的表达。结论：脐血源性间充质干细胞能够被诱导分化成心肌样细胞，并显示为心肌细胞的表观特征。     

大鼠骨髓基质细胞体外培养向神经干细胞的诱导分化

目的:已证实骨髓基质细胞可分化为中胚层组织细胞,实验予进一步探讨体外分离培养的骨髓基质细胞向神经干细胞分化的可能性,以及是否能继续定向分化为神经细胞及神经胶质细胞,为神经系统疾病细胞移植治疗提供种子细胞.方法:实验于2007-02/09在泸州医学院神经生物学研究室进行.①动物:选择5只普通级SD大鼠,由泸州医学院实验动物中心提供,实验过程中对动物的处胃符合动物伦理学标准.②实验方法:大鼠戊巴比妥钠腹腔麻醉,取双侧胫骨和股骨,磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔.采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞,胰蛋白酶与EDTA联合消化,传至第4代,用含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μ g/L表皮生长因子、N2辅助因子的DMEM/F12培养液向神经干细胞诱导分化.③实验评估:观察原代、传代培养及诱导分化后的骨髓基质细胞生长情况和形态变化,采用SABC法进行免疫细胞化学榆测神经细胞特异性标志的表达.结果:①骨髓基质细胞形态观察:原代细胞接种l d后开始贴壁增殖,3 d后多数贴壁,贴壁细胞呈梭形或扁平形;10 d后90%细胞融合,以长梭形为主,突起粗大,形成网状、片状;传代后细胞贴壁速度加快,增殖能力更强,7 d左右达到融合.②诱导分化后细胞生长情况和形态变化:第4代骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化7 d,成球的细胞脱离瓶底,悬浮在细胞液中.将细胞离心弃上清,换成血清分化液后,细胞球逐渐贴壁,球周围很快发出突起,分化为星形胶质细胞样细胞、神经元样细胞及少突胶质细胞样细胞.③神经细胞特异性标志的表达:骨髓源性细胞球表达巢蛋白,呈棕黄色,为神经干细胞:从细胞球分化的细胞抗胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及半乳糖脑苷脂均呈阳性.结论:骨髓基质细胞能在体外诱导分化出神经干细胞,且骨髓源性神经干细胞可进一步定向分化为神经细胞及神经胶质细胞.     

人胚脑源性神经干细胞特性及免疫原性研究

目的:探讨人胚脑源性神经干细胞特性及免疫原性,为神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)移植治疗神经系统损伤奠定基础。方法:取孕14周流产胚胎,无菌分离制备大脑神经细胞悬液,用CD133标记的免疫磁珠分选NSC,提取NSCRNA,进行RT-PCR探测MHC-I,MHC-II类分子mRNA转录;用流式细胞术检测细胞表面MHC-I,MHC-II类分子的表达;用正常成人外周血单个核细胞与培养NSC共培养和MTT比色分析法观察淋巴细胞增殖反应;将NSC小鼠脑内接种,进行组织染色观察细胞移植部位的组织学变化。结果:新分离和传代的NSC均发生MHC-I,MHC-II类分子mRNA转录,MHC-I类分子在NSC表面的表达百分率为(5.66±0.37)%,NSC在体外能诱发淋巴细胞增殖反应,A值为1.09±0.48和1.15±0.29,与阴性对照比差异有显著性意义(P<0.05)。NSC小鼠脑内移植具有修复神经损伤作用,局部无淋巴细胞浸润和炎症。结论:人胚脑源性神经干细胞具有免疫原性,但直接脑内接种未发现引起明显的移植排斥反应。     

体外诱导人脐带间充质干细胞向胰岛β样细胞的分化

背景:体外实验中人们发现,常规诱导骨髓间充质干细胞分化的胰岛β样细胞由于种种原因限制了其进一步的应用.关于人脐带间充质干细胞是否可以成功诱导的胰岛β样细胞尚未见系统报道.目的:进一步验证人脐带间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的可行性.方法:采用胶原酶消化法分离人脐带细胞进行贴壁培养:传2代后,用高浓度葡萄糖(2s mmol/L)培养液DMEM(含体积分数为10%胎牛血清)以及碱性成纤维细胞和尼克酰胺诱导脐带间充质干细胞向胰岛β样细胞分化.倒置显微镜下观察间充质干细胞诱导后的形态变化,用胰岛β细胞特异染色方法双硫腙染色鉴定诱导后细胞游离锌离子浓度;免疫细胞化学鉴定诱导后细胞内是否储存有胰岛素.结果与结论:第2代脐带间充质干细胞经过高糖诱导后,间充质干细胞形成细胞团:并且形成了双硫腙染色阳性的细胞团:免疫细胞化学表明诱导后细胞内的细胞胰岛素染色阳性.结果表明人脐带分离出的间充质干细胞在体外可以定向诱导分化为胰岛β样细胞,这种胰岛β样细胞具有表达、储存胰岛素的功能.     

大鼠海马83 ku蛋白诱导神经干细胞向乙酰胆碱酯酶阳性神经元的定向分化

背景:神经干细胞的临床应用还尚待时日,现阶段需要解决如何诱导神经干细胞分化为特定表型的神经元以替代丢失、变性的神经元细胞.目的:探讨大鼠海马组织83 ku蛋白对神经干细胞向乙酰胆碱酯酶阳性神经元分化的作用.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2003-10/2008-04在南通大学医学院完材料:清洁级SD大鼠12只,17 d龄SD胎鼠多只,均由南通大学实验动物中心提供.方法:取6只正常大鼠及6只切割海马伞后14 d大鼠的海马组织制成匀浆,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,根据染色结果切取含有83 ku差异蛋白条带进行电洗脱,定量后调整蛋白浓度为300 mg/L.取胎鼠前脑组织,体外分离培养神经干细胞,设立3组:空白对照组加入单纯DMEM/F12无血清培养基;83 ku蚩白正常组、83 ku蛋白切割组分别加入含10 mg/L来自正常/割海马伞大鼠海码组织83 ku蛋白的DMEM/F12无血清培养基,诱导12 d.主要观察指标:用乙酰胆碱酯酶组织化学染色榆测神经干细胞分化为乙酰胆碱酯酶阳性神经元的情况.结果:诱导12d后,83 ku蛋白切割组乙酰胆碱酯酶阳性神经元较多,胞体大且分化较好,突起粗且长;83 ku蛋白正常组乙酰胆碱酯酶阳性神经元较少,胞体小,突起短;空白对照组仅见少量乙酰胆碱酯酶阳性神经元.组间乙酰胆碱酯酶阳件神经元数比较差异有显著性意义(P＜0.05),83 ku蛋白切割组＞83 ku蛋白正常组＞空白射照组.结论:大鼠海马组织中83 ku蛋白可成功诱导神经干细胞定向分化为乙酰胆碱酯酶阳性神经元.     

人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞及鉴定

目的探讨5-氮胞苷作为诱导剂体外诱导人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)分化为心肌样细胞,并对其进行鉴定。方法采用密度梯度离心法与贴壁培养法相结合分离培养hMSCs,以5-氮胞苷诱导第3代hMSCs,24h后继续培养,观察细胞形态学的变化;培养4周,采用免疫细胞化学法对分化的心肌样细胞特异性蛋白结蛋白、心肌肌钙蛋白I进行鉴定。结果培养7d后hMSCs贴壁呈集落生长,有成纤维细胞样外观;5-氮胞苷诱导7d后细胞呈梭形,排列方向渐趋一致,有肌管样结构形成,免疫细胞化学法检测人心肌特异性蛋白结蛋白、心肌肌钙蛋白I表达阳性,而未经诱导的相同培养时间的hMSCs中均未见表达。结论 hMSCs体外在5-氮胞苷诱导下可定向分化为心肌样细胞。