脂肪干细胞原代培养及其向表皮细胞诱导分化的研究

目的 探讨人脂肪干细胞(adipose-derivedstem cells,ADSCs)体外原代培养方法及诱导分化为表皮细胞的可能性.方法 利用酶消化法原代培养ADSCs,免疫细胞化学检测其相关表面抗原CD29、CD34、CD44、CD49d、CD80、CD106的表达;用表皮细胞诱导培养基对ADSCs进行体外诱导,观察细胞的生长情况及形态变化;对诱导前后两种细胞行细胞增殖活性及细胞角蛋白表达检测.结果 利用脂肪抽吸液成功培养出ADSCs,且能稳定传代;免疫组织化学染色证实有特定的干细胞表面标记物表达;对ADSCs成功进行了体外诱导培养,其细胞形态及蛋白表达均有向表皮细胞分化的倾向,并且仍具较高增殖活性.结论 利用酶消化法可在体外成功培养ADSCs,并能持续传代;ADSCs表达特定的干细胞表面抗原;ADSCs可成功进行体外诱导,有向上皮细胞分化的倾向.     

负载人骨形态发生蛋白-7基因的兔脂肪干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的 探讨人骨形态发生蛋白-7(hBMP-7)基因修饰对兔脂肪干细胞(ADSCs)成骨能力的影响. 方法 原代培养兔脂肪干细胞,免疫组织化学方法检测细胞表面抗原CD44、CD49d、CD106的表达,对细胞进行鉴定;阳离子脂质体介导hBMP-7基因转染ADSCs,绿色荧光蛋白表达观察转染效率、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测目的基因hBMP-7的表达;ALP定量测定,Western blot检测Ⅰ型胶原、骨钙素的表达,以评价转基因ADSCs向成骨细胞分化的情况. 结果 从兔脂肪组织中分离出来的ADSCs CD44、CD49d表达呈阳性,CD106表达呈阴性.RT-PCR检测筛选后的ADSCs稳定表达hBMP-7.转染后7、10、14 d ALP定量测定转染组明显高于未转染组,差异有统计学意义(P<0.05);成骨标志物Ⅰ型胶原、骨钙素的表达转染组明显高于未转染组.结论 从脂肪组织中分离出的ADSCs是一种较好的组织工程种子细胞.hBMP-7重组质粒转染ADSCs后表达目的蛋白,并诱导ADSCs向成骨细胞分化.     

Wnt-1重组腺病毒对人表皮干细胞分化的影响

目的 了解Wnt-1重组腺病毒对人表皮干细胞(ESC)分化趋势的影响.方法 将Wnt-1重组腺病毒导入人ESC(实验组)后,检测细胞直径及增殖情况、ESC多种分子标记物的表达、培养上清液中基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-7的含量.以正常ESC为对照组.结果 对照组、实验组ESC直径接近(P＞0.05).对照组ESC为(1.18±0.10)×106个/mL,实验组为(1.45±0.09)× 105个/mL,后者明显高于前者(P＜0.05).2组ESC分子标记物角蛋白5(K5)、K6、K7、K8、K14、CD44、癌胚抗原、雌激素受体、孕激素受体的表达量组间比较,差异均无统计学意义(P＞0.05);对照组K10表达量为0,实验组为(60±3)%;对照组K18为(13.8±1.7)%,实验组表达明显增强[(34.3±2.1)%.P＜0.05];对照组K19为(24.4±1.5)%,实验组减弱至(17.1±1.8)%(P＜0.05).实验组ESC培养上清液中MMP-2和MMP-7含量均明显高于对照组(P＜0.01).结论 Wnt-1重组腺病毒具有诱使人ESC向腺样上皮细胞分化的趋势.     

体外诱导人脐带间充质干细胞向汗腺细胞分化及其信号通路研究

目的 观察人脐带间充质干细胞(UCMSC)向汗腺细胞(SGC)分化的能力以及细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路在分化过程中的作用。 方法 (1)体外分离培养UCMSC和SGC,通过检测CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、细胞角蛋白7(CK7)、CK19、癌胚抗原(CEA)表达情况鉴定UCMSC,检测CK19、CEA表达情况鉴定SGC。(2)制作热损伤SGC模型,按随机数字表法将铺于Transwell培养板下层的UCMSC分为4组,均用汗腺培养液培养：对照组,培养液中不添加刺激因素;热损伤组,将热损伤SGC（每孔1×104个）接种于Transwell培养板小室与UCMSC间接共培养;热损伤+ EGF组,在热损伤组处理条件基础上,培养液中添加50 ng/mL EGF;热损伤+PD98059组,在热损伤组处理条件基础上,培养液中添加10 nmol/mL ERK信号通路特异性抑制剂PD98059。1周后,流式细胞仪检测各组UCMSC中CK7、CK19表达率,免疫组织化学法检测CK19、CEA表达情况并计算CEA表达率,蛋白质印迹法检测磷酸化ERK (pERK)表达水平。对数据行多组间单因素方差分析。 结果 (1) UCMSC高表达CD29、CD44、CD105,少量表达或不表达CD14、CD34、CD45、CK7、CK19、CEA;SGC中CEA和CK19均呈阳性表达,证实获得的2种细胞均为纯化细胞。(2)诱导培养1周后,热损伤组与热损伤+ EGF组UCMSC中CK7、CK19、CEA阳性表达率及pERK表达水平分别为(6.4±0.7)％、(5.7±0.3)％、(7.4±1.0)％、0.790±0.049与(14.3±1.0)％、(12.6±1.1)％、(17.6±2.3)％、1.200±0.032,均显著高于对照组的(2.2±1.5)％、（2.2±0.7）％、(3.3±0.7)％、0.640±0.026,F值分别为78.49、139.36、87.13、191.74,P值均小于0.01;热损伤+EGF组UCMSC 各指标水平显著高于热损伤组（F值为50.14～145.47,P值均小于0.01）;热损伤+PD98059组与对照组UCMSC各指标水平相近（F值为0.00～0.13,P值均大于0.05）。 结论 UCMSC在热损伤SGC的微环境中能够分化为SGC,ERK通路参与了UCMSC向汗腺细胞分化的过程。     

肉苁蓉含药血清诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的:研究补肾中药肉苁蓉含药血清对骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)定向分化的影响。方法:全骨髓培养法获得原代骨髓间充质干细胞,经胰酶消化传代培养至第4代,将第4代BMSCs以5×106接种于2块6孔板,每板3组孔,分为空白组、地塞米松组、肉苁蓉组,2 d后换液,加入诱导液。空白组加入含10%胎牛血清(FBS)的L-DMEM培养基继续培养,地塞米松组在基础培养基中加入诱导剂(含β甘油磷酸钠10 mmol/L,地塞米松0.1μmol/L,维生素C 50 mg/L),肉苁蓉组为含10%肉苁蓉含药血清的L-DMEM培养基。第10天取出1块6孔板做ALKP染色,另一6孔板于第20天做6孔板茜素红染色。结果:第10天肉苁蓉组及地塞米松组ALKP染色阳性,第12天可见白色钙结节,第20天茜素红染色阳性。结论:BMSCs在肉苁蓉含药血清诱导下可向成骨细胞分化,分别作为组织工程的种子细胞和诱导因子对治疗骨质疏松、骨折不愈合将有良好的前景。     

水蛭素通过上调VEGF/Notch1信号通路促进人骨髓间充质干细胞成骨分化

摘要：目的 观察水蛭素对人骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）成骨分化的影响。方法 BMSCs细胞分为正常培养的对照组、成骨诱导的诱导组以及加入不同浓度（1、10、20 ATU/mL）处理的水蛭素组。MTT检测细胞增值并筛选水蛭素最适作用浓度。流式细胞仪检测细胞凋亡。RT-PCR和Western blot分别检测成骨基因Runx2、Osterix、COL1A1的mRNA和蛋白表达。BCIP/NBT染色法检测细胞中的碱性磷酸酶水平。茜素红染色检测矿化结节。检测VEGF、Notch1、Jagged1和CBF1的mRNA和蛋白表达。结果 骨髓间充质干细胞经成骨诱导细胞增殖显著增加,中高浓度的水蛭素可以不同程度促进成骨诱导的BMSCs细胞增殖（P＜0.05）,并筛选出20 ATU/mL作为水蛭素的使用浓度。水蛭素抑制成骨诱导的BMSCs细胞凋亡,上调Runx2、Osterix、COL1A1的mRNA和蛋白表达,增加碱性磷酸酶水平,促进细胞中矿化结节的生成,并提升BMSCs细胞中VEGF、Notch1、Jagged1和CBF1的表达（P＜0.05）。结论 水蛭素可能通过上调VEGF/Notch1信号通路促进人骨髓间充质干细胞成骨分化。