基因转染骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜的实验研究

目的探索一种行之有效的方法增强细胞黏附力,加快组织工程心脏瓣膜的体外构建。方法通过纤维连接蛋白羧基端细胞结合域(FnCBD64)的原核表达、提取和纯化,构建FnCBD64基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64,并进行绵羊骨髓基质干细胞(BMSCs)的体外分离培养及生物学特性分析,制备去细胞猪主动脉瓣,在无菌条件下将脱细胞瓣叶圆片置入96孔板中(心室面向上),分别给予Fn、FnCTD64牛血清白蛋白(BSA)预先包埋,未预包埋作为对照组。细胞悬液接种,每只瓣叶种植细胞数为4×105个。在开始种植细胞的第8天取瓣叶进行细胞计数,电镜扫描MTT检测。结果对照组在经过脉动冲刷实验高流量液体的冲刷以后,其表面的骨髓间质干细胞几近完全脱落,电镜扫描下为裸露的瓣膜支架;而预涂FnCBD64组虽然经过高流量的流体冲刷,有稀疏的细胞残留,细胞间有瓣膜支架的结构;转染Ad.FnCBD64组瓣膜表面存留的细胞比预涂FnCBD64组明显多,某些部位细胞呈复层生长,细胞可见排列极性改变,有向活体内细胞转化的趋势。结论预涂FnCBD64和转染Ad.FnCBD64均能明显增强BMSCs在去细胞猪主动脉瓣叶及整体瓣膜上的黏附,而转染Ad.FnCBD64的效果更好。     

人骨形态发生蛋白7重组腺病毒的制备及在骨髓基质干细胞中的表达

目的:构建骨形态发生蛋白7(BMP-7)和绿色荧光蛋白(GFP)融合基因的重组腺病毒载体,并检测其在骨髓基质干细胞(BMSCs)的表达.方法:RT-PCR法获得BMP-7基因.将其克隆至pcDNA3.1/CT-GFP质粒中,PCR扩增hBMP-7/GFP融合基因片段,与线性化pAxCAwt腺病毒载体连接,转染大肠杆菌LE392,筛选重组腺病毒黏粒,大量扩增后与DNA-TPC共转HEK293细胞,获得重组腺病毒Ad.hBMP-7/GFP.用重组病毒液转染兔BMSCs细胞,免疫组化方法检测BMP-7的表达.结果:经过多聚酶链反应及酶切鉴定证明获得了BMP-7重组腺病毒基因组,并包装出重组腺病毒,滴度为4.4×108pfu/ml.荧光显微镜和免疫组织化学证明BMP-7在重组腺病毒转染后的BMSC细胞中得到了表达.结论:成功制备BMP-7重组腺病毒,为骨缺损局部基因治疗研究奠定基础.     

人骨形态发生蛋白-7腺病毒的构建及其在犬转染骨髓基质干细胞后的表达

目的探讨携带人骨形态发生蛋白-7(BMP-7)腺病毒构建方法以及其在犬转染骨髓基质干细胞中的表达情况。方法采用腺病毒表达系统体外构建携带BMP-7腺病毒的载体,转染人胚肾293细胞进行同源重组,利用BMP-7重组腺病毒转染犬骨髓基质干细胞,然后采用RT-PCR法检测BMP-7基因的表达。结果经过酶切鉴定证明获得了BMP-7转移质粒穿梭载体pTrack-BMP-7和BMP17重组腺病毒基因组,并包装出重组腺病毒,病毒滴度为3.6×10~(12)VP/ml。RT-PCR证明BMP-7在重组腺病毒转染后的犬骨髓间充质干细胞中得到了表达,转染效率约98%。结论 BMP-7重组腺病毒的成功构建与成功转染犬骨髓间充质干细胞以及其高效表达,为骨缺损与骨不连的基因治疗提供了实验依据。     

人碱性成纤维细胞生长因子腺病毒表达载体的构建及其在人脐静脉内皮细胞中的表达

目的:构建人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast cell growth factor,bFGF)腺病毒载体,并观察其在体外血管内皮细胞中的表达.方法:采用同源重组的方法,构建重组腺病毒Ad5-bFGF.携有绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)的Ad5腺病毒转染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),检测最佳转染复数.Ad5-bFGF体外转染HUVEC,免疫细胞化学法、Western印迹法检测bFGF蛋白的表达.结果:Ad5转染HUVEC的最佳转染复数为200,转染率为90%.免疫细胞化学法和Western印迹结果显示bFGF基因以Ad5为载体可以在HUVEC的胞质和胞核表达,并且表达量较未转染的HUVEC明显增加.结论:成功构建了携带bFGF基因的腺病毒载体,体外可以成功表达,为bFGF基因治疗及肿瘤发病机制的研究奠定了基础.     

腺病毒介导的血管内皮生长因子体外转染心肌细胞的研究

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)基因的重组腺病毒载体,并转染体外培养的心肌细胞,检测VEGF的表达.方法:将人源性的VEGF165cDNA正向插入到腺病毒载体PDC315,构建重组质粒,通过脂质体共转染293细胞,经同源重组获得携带人VEGF165基因的重组腺病毒,通过PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒,扩增并测定滴度后,体外转染培养的心肌细胞,利用ELISA、Western印迹分析等方法检测VEGF在心肌细胞中的表达.结果:人VEGF165cDNA成功地正向插入到PDC315载体中,以重组病毒基因组DNA为模板,同时扩增出了610bp的VEGF165cDNA基因片段,证实了所构建病毒的正确性,病毒滴度为2.8×108 pfu/ml,Ad VEGF165体外转染心肌细胞3 d后,在培养细胞的上清液及细胞内检测到了VEGF的表达.结论:成功构建了表达人VEGF 165基因的腺病毒载体,体外转染心肌细胞后能够满意表达VEGF,为基因治疗心肌缺血奠定基础.     

HBV-TR重组腺病毒载体的构建

目的: 构建乙肝病毒靶向核糖核酸酶(HBV targeted ribonuclease, TR)基因的重组腺病毒载体. 方法: 将HBV-TR基因及其对照组基因分别克隆入质粒载体pDC316得到pDC316/TR等穿梭质粒,然后将所得的穿梭质粒和辅助质粒pBHGlox(delta)E1, 3Cre以磷酸钙法共转染HEK293细胞得到重组腺病毒Ad/TR及对照组重组病毒,并以空斑形成实验(Plaque Assay)测定病毒滴度. 结果: 成功构建了HBV-TR重组腺病毒载体Ad/TR及其对照组病毒并获得了高滴度的病毒颗粒. 结论: HBV-TR重组腺病毒载体成功构建.     

人Ⅰ型补体受体重组腺病毒的构建和鉴定

目的 构建并鉴定CR1重组腺病毒，为有关基因转染研究作准备。方法 CR1目的基因经酶切插入pAxCAwt载体，构建成CR1—pAxCAwt重组粘粒。磷酸钙共沉淀法转染295细胞获取重组腺病毒。结果 GR1—pAxCAwt重组粘粒插入方向正确，所获腺病毒为复制缺陷型sCR，重组腺病毒。结论 采用的粘粒构建、转染方法可行，所获重组腺病毒可靠。     

aFGF重组腺病毒载体的构建、转染效率和使用安全性的初步研究

目的：旨在构建人酸性成纤维细胞生长因子（acidic fibrolast growth factor,aFGF）重组腺病毒载体，为基因转染的研究作准备。方法：将用于转染的重组粘粒和DNA－TPC混合后，以磷酸钙共沉淀法转染包装细胞293细胞，获取重组腺病毒。结果：重组腺病毒DNA经酶切鉴定为正确，所得重组腺病毒为E1缺陷型并带有aFGF基因，同时证明重组腺病毒体外转染效率高且使用安全，结论：此重组缺陷型腺病毒载体可用于体内基因治疗研究。     

endostatin基因重组腺病毒的构建及在人肺腺癌细胞的表达

目的 利用AdEasy系统构建鼠内皮抑素(ES)基因重组腺病毒Ad.ES,并观察其在人肺腺癌细胞SPCA-1的表达.方法 采用酶切、连接和转化等方法,将质粒pcDNA3.ES中的ES片段插入腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack.CMV,构建重组腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack.CMV.ES,经Pme Ⅰ酶切线性化后与含腺病毒基因骨架的质粒载体pAdEasy-1在细菌BJ5183内进行同源重组得到腺病毒质粒pAd.ES,重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切后,转染人胚肾293细胞包装成腺病毒颗粒Ad.ES,将病毒上清反复感染293细胞获得高滴度病毒,应用氯化铯(CsCl)梯度离心的方法纯化病毒,利用AdEasy系统上的绿色荧光蛋白(GFP)标签测定重组腺病毒的功能滴度.用2 MOI重组腺病毒Ad.ES体外转导SPCA-1细胞48h,流式细胞仪检测GFP表达阳性率,ELISA法测定细胞培养上清液中ES的含量.结果 双酶切证实重组腺病毒穿梭载体pAdTrack.CMV.ES质粒构建正确,卡那霉素抗性筛选和Pac Ⅰ酶切鉴定证实腺病毒重组质粒构建成功.Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒导入293细胞3d,约20%的细胞表达GEP,回收病毒重复感染293细胞,CsCl梯度离心纯化最终获得约5.6×1010TU/mL滴度的重组病毒.Ad.ES体外转导SPCA-1细胞48h后,细胞GFP阳性率为93%,细胞培养上清液中ES的含量较Ad.GFP感染组和阴性对照组明显增加(P＜0.05).结论 应用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和ES的重组腺病毒,Ad.ES体外感染人肺腺癌细胞SPCA-1可显著提高ES表达,为进一步研究抗血管生成治疗肺癌奠定了基础.     

腺病毒介导的人内皮型——-氧化氮合酶基因和增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的：研究腺病毒载体介导人内皮型一氧化氮合酶（human endothelial nitric oxide synthase，heNOS）和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）在体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的表达。方法：体外培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞，并对培养的细胞进行成骨、成脂肪诱导分化和细胞免疫表型鉴定；用PmeI线性化后去磷酸化的pShuttle—heNOS—EGFP转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy--1的感受态BJ 5183，使其在细菌内发生同源重组，获得阳性重组质粒pAdEasy—heNOS—EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定正确后经Pac I酶切，转人AD 293细胞，包装成重组腺病毒Ad—heNOS—EGFP。用重组腺病毒Ad—heNOS—EGFP对MSCs进行转染，并用荧光显微镜及免疫荧光染色法观察转染细胞内EGFP和heNOS蛋白质的表达。结果：pShuttle—heNOS—EGFP与pAdeasy--1在BJ 5183中成功地发生了同源重组，得到了重组腺病毒质粒pAdEasy—heNOS—EGFP。重组质粒在AD 293细胞中包装成重组腺病毒Ad—heNOS—EGFP。经基因转染的MSCs中高表达heNOS和EGFP。结论：采用腺病毒载体可以将外源性的heNOS基因转染至MSCs中，并得到有效表达，且携带的EGFP标记可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况，这将为勃起功能障碍的细胞治疗提供一条新的途径。     

碘杂环—64对小鼠免疫功能的影响

本文报告抗高血压药碘杂环—64(IHC—64)对小鼠免疫功能的影响,并同免疫抑制剂CY和强的松龙进行比较。IHC—64 1.5,3mg/kg ip×7对小鼠胸腺重、牌重无显著影响,但对PHA6mg/kgim×3诱导的体内淋巴细胞转化有明显促进作用。相同剂量给药4天,IHC—64不但对SRBC所致的血清溶血素、凝集素的产生无明显影响而且对小鼠脾脏抗体形成细胞(PFC)特异性玫瑰花形成细胞(SRFC)和脾细胞总数均无显著影响。说明IHC—64对免疫功能有选择性促进作用。     

膀胱癌64层CT分期与病理对照分析

目的通过64 SCT对膀胱癌分期与病理分期的对比,评价64 SCT对膀胱癌分期的价值。方法使用东芝Aquilion64排CT扫描机对5O例经手术或膀胱镜病理证实的膀胱癌患者进行盆腔平扫、增强扫描,分析其CT表现。结果Ⅰ期22例,Ⅱ期14例,Ⅲb期6例,Ⅳa期8例,对膀胱癌周围组织侵犯的评价与术中所见符合率达88．8％：与手术病理分期结果呈显著正相关。移行细胞癌75％好友于膀胱侧壁、顶壁,三角区占19％;腺癌好发于三角区;发生于三角区的癌灶占所有癌灶的24％。结论64SCT是术前对膀胱癌进行临床分期的理想工具,为临床治疗方案的选择提供可靠的依据。     

64例人体囊虫病流行病学分析

目的了解广西贵港市人体囊虫病流行特点和分布情况。方法对1986～2006年住院治疗的64例囊虫病人进行流行病学分析。结果64例人体囊虫病人中，2例来自邻市，62例来自本市19个乡镇，其中32例（51．61％）来自本市的三里、覃塘和贵城3个镇；职业以农民为主；男女之比为2．76：1；发病年龄主要集中在21～60岁的青壮年；感染方式以异体感染为主。结论广西贵港市人体囊虫病具有散在性流行又相对区域性集中分布的特点。     

小儿副鼻窦支气管炎64例分析

目的探讨小儿副鼻窦支气管炎的临床特点、治疗及预后。方法以2005年1月至2006年12月诊治的小儿副鼻窦支气管炎为对象,进行回顾性分析。结果副鼻窦支气管炎占同期儿童慢性咳嗽的48.85%,其临床表现除咳嗽外,78.73%伴有流涕及鼻黏膜红肿。副鼻窦X线摄片漏诊率45.31%,其中筛窦炎的漏诊率为80.77%。副鼻窦支气管炎是局部化脓性炎症,在给予抗生素同时作局部处理,疗程2～4周,痊愈率100%。结论副鼻窦支气管炎是儿童慢性咳嗽的首位病因,对慢性咳嗽患者应重视鼻部症状及鼻咽部检查,作副鼻窦CT确定诊断,其治疗效果良好。     

创伤性结肠损伤64例临床分析

目的探讨创伤性结肠损伤的手术方式和治疗结局,为临床治疗提供进一步的指导依据。方法回顾性分析我院2008年1月～2011年1月收治的64例创伤性结肠损伤的临床资料。结果全部患者经手术治疗后,64例均获痊愈,无肠瘘发生。4例因切口感染,经换药后痊愈,2例并发腹腔残余脓肿均经非手术治疗治愈,5例术后出现炎性肠梗阻,经保守治疗好转出院。结论对于创伤性结肠损伤患者,应积极应用抗生素预防感染,严格掌握手术适应证,术中充分进行肠道灌洗,一期修补或切除吻合是治疗创伤性结肠损伤理想的手术方法之一。     

64例早发型重度子痫前期的临床分析

目的探讨早发型重度子痫前期对围生期母婴预后的影响。方法对本院64例早发型重度子痫前期患者进行回顾性分析。根据其发病孕周分成三组,即A组(孕周<28周)、B组(28周≤孕周<32周)、C组(32周≤孕周<34周)。结果早发型重度子痫前期三组患者并发症发生率随发病孕周延长而下降,但三组间差异无统计学意义;三组新生儿窒息率和围生儿死亡率均随发病孕周延长而下降,且三组间差异均有统计学意义(P<0.05);B组期待治疗时间均明显长于其他两组(P<0.05),各组患者的分娩方式均以剖宫产为主。结论早发型重度子痫前期严重影响母婴预后,在期待治疗过程中,应严密监护母胎情况,适时终止妊娠,终止妊娠的方式首选剖宫产。