人外周血未成熟树突状细胞的体外扩增和鉴定及抗成熟特性的研究

目的建立体外诱导、扩增具有抗成熟特性的未成熟树突状细胞(DC)的方法。方法从健康成人外周血分离单个核细胞(PBMC)，以rhGM—CSF和rhIL—4体外培养9d，于第7d加入rhIL—10，收集悬浮细胞，电镜观察形态，流式细胞仪测定细胞表型，并进行混合淋巴细胞反应(MLR)，观察其刺激同种异体未致敏T淋巴细胞增殖的能力。将培养的细胞分别用LYS、TNF—α继续刺激2d，再进行MLR，观察结果。结果PBMC经rhGM—CSF rhIL-4诱导并经rhIL-10处理后获得的细胞具有典型的DC形态特征，表达DC的特异性标志CD1a，不表达DC的成熟标志CD83，与对照组相比其共刺激分子CD86、CD40的表达显著下降，MLR示不能刺激同种异体T细胞增殖。经LPS、TNF—α刺激后亦不能刺激T细胞增殖。结论与rhIL—10联合培养可获得具有抗成熟特性的未成熟DC，这对于诱导大面积深度烧伤病人的异体皮移植免疫耐受具有良好的应用前景。     

脐血与脐带间充质干细胞的分离、扩增、分化比较

目的比较人脐血、脐带组织间充质干细胞体外分离、扩增与成骨、成脂肪细胞分化的方法与条件．比较相应实验的难易度。方法脐血采用沉降红细胞后密度梯度法及CD34^＋免疫磁珠负选法分离单个核细胞＋10％胎牛血清或Mesencuit^TM培养基培养传代,集落生长细胞向成骨、脂肪细胞定向诱导分化;脐带沿血管灌入胶原酶悬液,获取细胞培养、扩增,细胞呈集落生长后传代,定向成骨、成脂肪细胞分化。结果脐血经沉降红细胞后分离的MNCs,使用Mesencult^TM培养基＋10％胎牛血清培养成功率高,集落细胞能向成骨、成脂肪细胞定向诱导分化。脐带去除血管后灌注可获得贴壁生长的细胞,能扩增形成集落,并向成骨、成脂肪细胞定向分化。结论脐血中可分离出MSCs,并可在体外进行培养扩增及分化,但难度较大。脐带组织存在间充质干细胞,并可在体外进行培养扩增形成集落细胞传代,集落细胞能够向成骨、成脂肪细胞分化,方法较脐血容易。     

人脐血来源的树突状细胞体外培养、扩增及鉴定

目的 探讨人脐血来源的树突状细胞(dendritie cells,DC)的体外培养、增殖情况。方法 无菌条件下常规采集脐血,用密度梯度离心法分离脐血中单个核细胞,贴壁培养2小时,去除非贴壁细胞,将获得的单个核细胞分为两组,试验组在含有粒单细胞集落刺激因子(GM-CSF)+白介素-4(IL-4)+肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的培养液中培养,在体外诱导分化为DC,对照组不加上述细胞因子。在DC发育过程中,在光镜下连续观察DC生长情况,流式细胞仪(FACS Calibur.BD公司)检测细胞表型。结果 正常体外培养的DC在第四天由贴壁状态变为悬浮毛刺状细胞,随着培养时间的延长,此类细胞数量增多,第八天为形态不规则的毛刺状并聚集成簇,为典型DC形态。FACS显示培养成熟的细胞高表达DC相对特异性标志CD1a,共刺激分子CD80、黏附分子CD54、高表达MHCⅡ类分子,提示DC提高共刺激功能和黏附功能。结论 人脐血经GM-CSF(50ng/ml)+IL-4(10ng/ml)+TNF-α(50ng/ml)体外培养,能诱导出成熟DC。     

脐血与脐带间充质干细胞的分离、扩增、分化比较

目的比较人脐血、脐带组织间充质干细胞体外分离、扩增与成骨、成脂肪细胞分化的方法与条件,比较相应实验的难易度。方法脐血采用沉降红细胞后密度梯度法及CD34+免疫磁珠负选法分离单个核细胞+10%胎牛血清或MesencultTM培养基培养传代,集落生长细胞向成骨、脂肪细胞定向诱导分化;脐带沿血管灌入胶原酶悬液,获取细胞培养、扩增,细胞呈集落生长后传代,定向成骨、成脂肪细胞分化。结果脐血经沉降红细胞后分离的MNCs,使用MesencultTM培养基+10%胎牛血清培养成功率高,集落细胞能向成骨、成脂肪细胞定向诱导分化。脐带去除血管后灌注可获得贴壁生长的细胞,能扩增形成集落,并向成骨、成脂肪细胞定向分化。结论脐血中可分离出MSCs,并可在体外进行培养扩增及分化,但难度较大。脐带组织存在间充质干细胞,并可在体外进行培养扩增形成集落细胞传代,集落细胞能够向成骨、成脂肪细胞分化,方法较脐血容易。     

负载乳腺癌抗原的脐血树突细胞外泌体抗肿瘤免疫作用

目的:探讨负载乳腺癌抗原的人脐带血树突状细胞(DCs)分泌的外泌体的抗肿瘤免疫效应。方法:提取新鲜脐血单个核细胞,体外诱导分化为DCs,提取乳腺癌细胞MCF-7肿瘤抗原,并冲击脐血DCs,加入LPS诱导其成熟,利用流式细胞仪检测表型;超速离心法收获负载抗原的脐血DC外泌体;MTT法检测外泌体诱导的T淋巴细胞增殖反应及其激活的CTL对肿瘤细胞的杀伤效应。结果:脐血DC表面标志CD34、CD80、CD86、CD11c阳性细胞数与新鲜脐血单个核细胞相比明显增加(P<0.05);Western-Blot结果显示,负载乳腺癌的脐血DC外泌体携带有MHC-Ⅱ类、CD40、CD80、CD86分子;成熟脐血DC组及负载乳腺癌抗原脐血DC外泌体对同种异体来源的T细胞均有明显促增殖作用;负载乳腺癌抗原的脐血DC及其外泌体激活的CTL均能对乳腺癌细胞MCF-7产生显著地杀伤作用(P<0.05)。且在效靶比100∶1时,外泌体的杀伤作用高于负载抗原的脐血DC(P<0.05)。结论:负载乳腺癌抗原脐血DC分泌大量外泌体,可促进同种异体T细胞增殖,并能诱导特异性抗乳腺癌的免疫效应。     

骨髓间充质干细胞支持脐血造血干／祖细胞体外扩增的研究

目的体外分离培养人新鲜脐血（UCB）造血干细胞（HSC），利用骨髓间充质干细胞作为滋养层联合细胞因子组合以扩增脐血造血干／祖细胞。方法采用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离UCBHSC，加入骨髓间充质干细胞和细胞因子，检测脐血造血干／祖细胞总有核细胞（NC）总数和CD34^＋细胞数。结果有核细胞总数扩增（75．2±15．0）倍，CD34^＋细胞数扩增（18．7±12．3）倍。结论体外HSC培养，加入骨髓间充质干细胞和细胞因子对造血干／祖细胞增殖有明显的作用。     

宫颈癌细胞冻融抗原负载树突状细胞激发细胞毒性T淋巴细胞杀伤宫颈癌细胞的体外研究

目的研究HeLa、SiHa两种宫颈癌细胞株冻融抗原负载的树突状细胞(dendritic cells,DC)诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)体外抗原特异性杀伤官颈癌细胞的能力.方法利用免疫磁珠分离法(MACS)分离纯化脐血CD34 细胞并在体外诱导分化为DC,用反复冻融法分别从两种宫颈癌细胞株(HeLa利SiHa)中提取可溶性冻融抗原并负载DC.流式细胞学检测负载两种抗原后DC表面分子的表达,ELISA法检测DC上清中IL-12的表达,MLR测定DC刺激T细胞增殖的能力,MTT法检测DC经抗原负载后激活的CTL分别对HeLa和SiHa细胞的杀伤作用.结果与未经抗原负载的DC相比,经HeLa和SiHa冻融抗原负载的DC能更好的表达各种DC分化相关抗原(CD1a、CD83、CD80、HLA-DR以及CD54),刺激T淋巴细胞增殖和IL-12分泌的能力也显著加强(P＜0.05).与未经抗原负载相比,两种宫颈癌细胞冻融抗原负载DC后激发的CTL在体外对官颈癌细胞的杀伤能力也明显加强.此外,HeLa细胞抗原负载DC诱导的CTL在体外对HeLa细胞的杀伤率为72.2%,显著高于它对SiHa细胞的杀伤率(22.3%);而SiHa细胞抗原负载DC诱导的CTL对SiHa细胞的杀伤率为69.5%,也明显高于它对HeLa细胞的杀伤率(28.1%),具有显著的抗原特异性.结论经宫颈癌细胞冻融抗原负载DC激活的CTL在体外具有更强的增殖能力,并具有抗原特异性杀伤宫颈癌细胞的作用.     

视黄酸对脐血树突状细胞的作用及其途径

目的:研究视黄酸(RA)对脐血树突状细胞(dendriticcell,DC)分化、成熟和功能的影响,探讨视黄酸受体(retinoicacidreceptorα,RARα)在RA对脐血DC调节中的作用。方法:收集脐血9份,分离单个核细胞后,均匀分为4组:对照组、RA组、RARα特异性拮抗剂组(RO组)、RA+RO组。在体外进行DC的诱导培养,流式细胞仪检测细胞表面标记及其荧光强度,观察RA及RARα对DC分化、成熟的影响;培养DC与T细胞进行混合淋巴细胞反应(mixedlymphocytereaction,MLR)后,观察RA及RARα对DC刺激异体T细胞增殖能力的作用;采用ELISA法和RT-PCR法研究RA和RARα在DC对Th细胞极向分化调节中的作用。结果:RA使DC的分化、成熟明显受抑,但当RO同时加入时,则可逆转该影响;MLR后发现RO可逆转RA对T细胞增殖的抑制作用;在DC对T细胞极向分化的研究中,无论在蛋白水平还是基因水平,RO均可明显阻止RA对Th1(IFN-γ)的下调和对Th2(IL-4、IL-10)的上调作用。结论:RA抑制体外培养的脐血单个核细胞向DC的分化和成熟,降低其MLR能力,使免疫反应向Th2方向偏移。RARα从多个环节上参与了RA对脐血DC的调节作用。     

氧化低密度脂蛋白对树突状细胞表面CD36表达的影响

目的探讨氧化低密度脂蛋白（OX—LDL）对树突状细胞表面CD36表达的影响。方法梯度离心法分离人外周血单核细胞,经含重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和重组人白介素4的DC完全培养液中培养,使其分化为DC。DC分别与不同浓度OX—LDL（分别为10μg／ml、50μg／m1）共同孵育48h后,镜下观察DC形态变化,同时采用流式细胞术检测DCs表型（CDlot、CD83）和CD36的表达,以及用ELISA法检测细胞土清液中IL-10、IL—12含量。结果与对照组相比,OX—LDL50μg／ml组DCs表型CD1α、CD83以及CD36的表达明显上调（P〈0．01）,OX—LDL50μg／ml组细胞上清液中IL-10、IL—12含量明显分别明显升高和降低（P〈0．01）。结论DCs表面CD36的表达与OX—LDL诱导的DCs成熟以及炎症因子的释放密切相关,CD36可能在DCs分化成熟以及抗原递呈过程中发挥重要作用。     

镉对诱导成熟人树突状细胞的毒性作用

目的探讨镉化合物对人树突状细胞(DC)的细胞毒性作用。方法应用粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 白细胞介素-4(IL-4)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导人外周血单核细胞获得DC,流式细胞仪(FACS)检测细胞表面标记鉴定;给予CdCl2处理进行剂量-效应和时间-效应分析,采用甲基四氮唑盐(MTS)颜色反应法检测细胞毒性作用。结果诱导获得的DC呈悬浮生长,部分细胞聚集成簇。细胞表面标志分子表达阳性CD14为2.7%,HLA-DR为96.3%,CD1a为83.9%,CD80为88.3%,CD83为58.8%,CD86为42.4%。不同剂量(1.25~80.00μmol/L)和作用时间(24~48h)CdCl2染毒组细胞增殖抑制率不同程度增高,呈剂量-和时间-依赖性关系。结论诱导获得成熟的人DC;镉作用可致成熟DC的细胞毒性效应。     

巴戟天对脐血CD34+细胞体外扩增的影响

目的：探讨巴戟天对脐血CD34＋细胞体外扩增的影响。方法：用StemSpanTMSFEM无血清液体培养基加入不同浓度的巴戟天，进行液体扩增，计数总细胞数并检测CD34＋细胞。收获扩增后的细胞用MethoCultTMH14435半固体培养基培养，计数CFU2E、BFU2E、CFU2GM集落。结果：巴戟天具有刺激CD34＋细胞液体培养的作用。巴戟天的最佳浓度是50mg／L，Rg1最佳浓度是5mg／L，Rb1最佳浓度是5mg／L。细胞总数分别扩增20．4、24．5、24．1倍，CD34＋细胞数分别扩增4．22、5．19、4．12倍。在液体培养后仍可刺激扩增后脐血细胞集落形成，CFU2E集落形成能力分别比对照组高90．1％、70．8％、72．8％；BFU2E集落形成能力分别比对照组高53．4％、68．0％、67．0％；CFU2GM集落形成能力分别比对照组高67．0％、29．8％、39．4％。结论：巴戟天能促进造血干棚细胞增殖，并且能诱导定向分化，具有类似生长因子和协同生长因子作用。     

脐血CD34+细胞向粒、红细胞和血小板定向诱导分化研究

目的 体外定向诱导脐带血CD34^ 细胞向粒细胞、红细胞和血小板的定向分化。方法 用免疫磁珠分选的方法从脐带血中分离CD34^ 细胞，采用SCF与G-CSF、EPO或TPO联合诱导CD34^ 细胞分别向粒细胞、红细胞或巨核细胞和血小板分化成熟，从形态学、免疫表型和功能等方面鏊定已诱导分化的细胞。结果 粒系诱导培养体系中CD15^ 细胞达81．17％，红系诱导培养体系中GPA^ 细胞达95．35％，巨核系诱导培养体系中CD41^ 细胞达77．82％。且分别具有各系成熟细胞形态。粒细胞具有吞噬功能；血小板样颗粒在凝血酶作用下产生聚集反应。结论 建立了CD34^ 细胞分别向粒细胞、红细胞和血小板诱导分化的培养体系，为细胞治疗、分化过程中基因的调控、外源基因的表达等相关研究奠定了基础。     

HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞Toll样受体3的表达

目的观察HBeAg＋慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血树突状细胞内ToH样受体3（TLR3）mRNA的表达水平及意义。方法30例HBeAg＋慢性乙肝患者为研究组，30例HBeAg-慢性乙肝患者和30例健康体检者为对照组。用人重组粒细胞-巨噬细胞刺激集落因子（rhGM—CSF）、人重组白细胞介素4（rhIL4）、干扰素α（IFN-α）诱导慢性乙型肝炎患者和健康体检者外周血树突状细胞（DC）。ELISA法检测DCs培养上清液中IL-12、INF-1的分泌水平，实时荧光定量（RT—PCR）法检测TLR3mRNA表达水平。结果HBeAg＋和HBeAg-慢性乙肝患者外周血DCs分泌IL-12、INF-1的水平，TLR3mRNA表达均显著低于健康对照组（P〈0．01）。HBeAg＋慢乙肝患者TLR3mRNA表达低于HBeAg-慢乙肝患者，但二者差异无统计学意义（P〉0．05）。结论慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞Toll样受体3的表达和分泌细胞因子的功能下降。     

6种中药多糖对诱导树突状细胞成熟及刺激T细胞增殖作用的比较

[目的]比较6种中药多糖对树突状细胞诱导成熟及刺激T细胞增殖的能力。[方法]通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞,采用细胞因子体外培养7d后,分别加入6种中药多糖,观察细胞的形态变化及用免疫细胞化学法检测其表面标志的表达。通过混合淋巴细胞反应检测细胞提呈抗原的能力。[结果]经6种中药多糖诱导的DC分子表达有明显变化:MHCII+、CD86+、CD83+(P﹤0.05,P﹤0.01),而经RPMI1640培养的DC分子表达与培养前无明显变化。经6种中药多糖诱导的DC均能促进效应T细胞的增殖能力(P﹤0.01)。其中枸杞多糖对上述功能的作用最为明显(P﹤0.05)。[结论]上述6种中药多糖均可诱导DC分化、成熟和刺激T细胞增殖,枸杞多糖与其余5种多糖比较,对上述功能的作用最为明显。     

抗原负载树突状细胞对胃癌患者自身肿瘤细胞体外杀伤作用研究

目的探讨用冻融的自身胃癌抗原冲击树突状细胞(DC),体外观察其对自身细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)对自身肿瘤细胞杀伤作用的研究。方法从胃癌手术切除肿瘤周围转移引流淋巴结,提取单个核细胞,将贴壁生长的细胞用细胞因子基因重组粒巨集落和生长因子(rhGM-CSF)、基因重组白介素4(rhIL-4)、以及基因重组α-肿瘤坏死因子(rhTNF-α)联合诱导培养DC,然后用经冻融制备的自身肿瘤细胞抗原冲击DC并作用CIK细胞,最后检测CIK细胞体外杀伤三种靶细胞(自身胃癌细胞、K562和SGC-7901细胞)的活性。结果经细胞因子联合诱导培养后,DC含量明显增高,CD1a/CD14和CD80/CD86阳性细胞比刚分离的单个核细胞明显增多。DC和CIK细胞共同培养后,CIK细胞高表达CD3+CD56+。负载胃癌抗原冲击的引流淋巴结DC活化的CIK细胞,杀伤自身肿瘤细胞活性达78.6%,而单纯CIK细胞为35.2%,两者比较有显著性差异p<0.01;而对K562和SGC-7901细胞杀伤活性二者间无明显差异。结论肿瘤周围转移引流淋巴结贴壁细胞在体外能定向诱导扩增出大量DC;胃癌抗原负载的DC和CIK细胞共同培养,可明显提高CIK细胞对自身肿瘤细胞的杀伤活性。     

LSC-DC-CIK对慢性粒细胞白血病干细胞杀伤作用的体外试验研究

目的 研究慢性粒细胞白血病(CML)患者来源的干细胞体外扩增诱导生成树突细胞(DC),与同来源的细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共培养,对慢性粒细胞白血病细胞株K562干细胞的杀伤作用.方法 提取CML患者的骨髓单个核细胞(BMMC),利用流式细胞术(FCM)分选纯化白血病干细胞(LSC)CD34+CD38-CD44+,体外扩增诱导生成LSC-DC.取同一患者骨髓的BMMC诱导出CIK.LSC-DC与CIK共培养,用光学显微镜观察细胞形态,FCM分析LSC-DC和CIK细胞免疫表型,荧光原位杂交(FISH)检测BCR/ABL融合基因在LSC及LSC-DC中的表达,FCM检测LSC-DC-CIK对慢性粒细胞白血病细胞株K562干细胞的杀伤及凋亡情况.结果 白血病干细胞能成功诱导为LSC-DC,其DC成熟免疫表型CD40、CD80、CD83、CD86及受体(HLA-DR)的表达均高于诱导前;共培养后CIK表面标志CD3、CDs、CD56的表达率高于单独培养CIK,差异有统计学意义(P＜0.01).LSC-DC与CIK共培养后对慢性粒细胞白血病细胞株K562干细胞的杀伤率(66.94％)明显高于单独培养的CIK(31.89％),差异有统计学意义(P＜0.01).LSC-DC-CIK可诱导K562细胞凋亡,凋亡率为52.28％±3.71％,与CIK组(37.51％±1.89％)相比,差异有统计学意义(P＜0.01);但对其中白血病干细胞无明显的诱导凋亡作用.结论 CML来源LSC-DC保留有干细胞特征,其与CIK共培养能杀伤慢性粒细胞白血病细胞株干细胞,但无明显的诱导干细胞凋亡作用.     

视黄酸对人胸腺细胞成熟分化影响及其作用机制

目的:研究视黄酸调节胸腺细胞发育的作用及其机制。方法:采用体外胸腺组织培养体系,在培养体系中加入视黄酸或视黄酸受体拮抗剂。在培养的不同时间收集胸腺细胞,用荧光标记的抗CD3、CD4、CD8抗体染色,并进行流式细胞仪分析,观察胸腺细胞表面标志随成熟分化的变化。胸腺细胞抽提的RNA采用实时定量PCR法检测视黄酸受体α(RARα) mRNA的表达。结果:体外胸腺组织培养体系能支持胸腺细胞的发育成熟。在培养24 h促进未成熟的CD4+CD8+胸腺细胞向CD4+成熟细胞分化发育作用明显,并且该作用可被RARα特异性拮抗剂Ro41-5253所拮抗。视黄酸也能显著抑制CD4+CD8+胸腺细胞向CD8+细胞分化,该作用也在培养24 h出现。实时定量PCR显示,视黄酸能促进RARα mRNA表达,并且 RARαmRNA表达水平与CD4+CD8+胸腺细胞百分数之间存在正相关,与CD8+胸腺细胞百分数之间存在负相关。结论:视黄酸可能通过影响其受体RARα表达而影响胸腺细胞的成熟分化。     

肺癌胸腔积液中树突状细胞的诱导培养

目的 证实肺癌恶性胸腔积液中存在树突状细胞(Dendritic cells,DCs)的前体细胞,体外培养可获得成熟的DCs.方法 收集19例肺癌患者的恶性胸腔积液,用双层Ficoll密度梯度离心法获得胸腔积液中的单个核细胞,在贴壁的单个核细胞中加入GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、IL-4(白细胞介素4)和TNF-α(肿瘤坏死因子α),用S100蛋白染色法和流式细胞仪对DCs进行表型鉴定.结果 在体外诱导出恶性胸腔积液来源的成熟DCs,S-100蛋白染色均成阳性,并且高表达HLA-DR(82.8±10.6)％、CD83(79.6±13.0)％、CD86(83.1±7.9)％、CD80(61.9±13.8)％.结论 肺癌恶性胸腔积液中可以诱导出成熟DCs.     

NF-kB活性抑制对人外周血树突细胞功能及Ⅰ型糖尿病治疗的影响

目的:研究体外定向诱导培养Ⅰ型糖尿病患者外周血单核来源树突状细胞表面标记(CD83、CD80、CD86)及细胞因子的分泌,及其抑制树突状细胞中核转录因子kB(NF-kB)活性的变化,探讨其在Ⅰ型糖尿病发病机制中的作用。方法:糖尿病患者20名随机分为IDM组和ODN组各10名,无偿献血员对照组(N组)10名。每组外周血中分离出单个核细胞(PBMC),加入IL-4、GM-CSF对DC进行诱导培养,同时向ODN组中加入NF-kB特异性低脱氧核苷酸(ODN)培养细胞,流式细胞仪测定细胞表面标记CD83、CD80、CD86的水平,ELISA方法检测培养上清液中IL-12的水平。结果:培养物上清液IL-12水平的测定结果为:N组和ODN组IL-12水平显著低于IDM组(P0.05);N组和ODN组IL-12水平无显著差异(P0.05)。DC表面标志的测定显示,在N组和ODN组中的CD83、CD80、CD86显著地低于IDM组(P0.05);N组和ODN组CD83、CD80、CD86无显著差异(P0.05)。结论:Ⅰ型糖尿病患者DC细胞成熟增强而功能异常,与DC中的NF-kB活性增强有关。ODN可以抑制Ⅰ型糖尿病患者DC中NF-kB活性,减少共刺激分子的表达和IL-12的分泌。