骨髓来源间充质干细胞对胃癌细胞侵袭转移的影响及其机制探讨

目的 分析骨髓来源间充质干细胞(BM-MSCs)在胃癌细胞侵袭转移中的作用,并对其调控机制进行探讨.方法 首先将SGC7901和KATO-Ⅲ胃癌细胞分别与BM-MSCs共培养,Transwell实验检测其侵袭能力变化;其次从KATO-Ⅲ胃癌细胞中分选出CD133+和CD133-细胞,并分别与BM-MSCs共培养,比较其侵袭能力变化,并通过Western blotting检测共培养后胃癌细胞p-AKT和上皮间质转化(EMT)相关因子蛋白表达水平的变化及其与CD133表达间的关系;通过对SGC7901过表达CD133,进一步验证CD133在BM-MSCs影响胃癌细胞侵袭转移中的作用.采用SPSS 17.0统计软件进行分析,计数资料以均数±标准差((-x)±s)表示,行独立样本t检验.结果 SGC7901和KATO-Ⅲ细胞与BM-MSCs共培养后,胃癌细胞的侵袭能力均显著增强,与BM-MSCs共培养的KATO-ⅢCD133+细胞侵袭能力增加的趋势较共培养的CD133-细胞更加明显[(259.0±24.0)个比(58.0±5.6)个,P ＜0.001];CD133+细胞共培养后,p-AKT和Snail、N-cadherin的表达量均显著增高(P值分别为0.003 、0.003、0.002),E-cadherin的表达则低于单独培养组(P=0.021);CD133-细胞共培养后,E-cadherin的表达低于单独培养组(P =0.005),而p-AKT和Snail、N-cadherin的表达与单独培养组比较,差异无统计学意义(P值分别为0.744、0.277、0.275);SGC7901过表达CD133后与BM-MSCs共培养,其侵袭能力增加的趋势较共培养的空白载体对照组更加显著[(239.3±24.0)个比(103.3±15.5)个,P＜0.001],CD133过表达组细胞与BM-MSCs共培养后,p-AKT和Snail,N-cadherin表达水平均显著高于其单独培养组(P值均为0.01),E-cadherin的表达则显著降低(P=0.003);空白载体对照组细胞与BM-MSCs共培养后,Snail和N-cadherin的表达也显著增高(P =0.007,0.004),E-cadherin的表达显著降低(P =0.018),而p-AKT的表达未见明显变化(P=0.193).结论 BM-MSCs通过促进胃癌细胞的EMT进而增强其侵袭转移能力,CD133在该过程中可能是通过PI3 K/AKT信号通路参与对胃癌细胞EMT的调控.     

胃癌原发灶中上皮间质转化相关因子和CD133的表达及其与临床病理特征和预后的关系

目的研究上皮间质转化（EMT）相关因子Snail、E-cadherin、N-cadherin与胃癌患者临床病理特征、预后及胃癌肿瘤起始细胞表面标志物CD133表达的关系。方法利用Western blot方法检测50例胃癌及癌旁正常胃黏膜组织中EMT相关因子及CD133蛋白的定位及定量表达,分析EMT相关因子及CD133蛋白表达与胃癌患者的临床病理学指标的关系,Spearman等级相关分析EMT相关因子和CD133表达的关系,Kaplan-Meier方法分析EMT相关因子及CD133表达与胃癌患者生存的关系。结果①胃癌组织中Snail、N-cadherin及CD133蛋白表达相对灰度值明显高于其在癌旁正常胃黏膜组织中的表达（Snail：0.599±0.114比0.259±0.108,P=0.020;N-cadherin：0.754±0.154比0.329±0.134,P=0.001;CD133：0.635±0.119比0.485±0.116,P=0.029）,E-cadherin蛋白表达相对灰度值明显低于其在癌旁正常胃黏膜组织中的表达（0.378±0.123比0.752±0.156,P=0.003）。②Snail蛋白、N-cadherin蛋白表达平均相对灰度值在有血管浸润、淋巴管浸润、N3淋巴结转移及肿瘤直径≥5 cm和Ⅲ＋Ⅳ期胃癌患者中的表达明显高于无血管浸润、淋巴管浸润、N0～N2淋巴结转移及肿瘤直径〈5 cm和Ⅰ＋Ⅱ期的胃癌患者（P〈0.05）,而E-cadherin蛋白表达平均相对灰度值在有血管浸润、淋巴管浸润、N3淋巴结转移及Ⅲ＋Ⅳ期胃癌患者中的表达显著低于无血管浸润、淋巴管浸润、N0～N2淋巴结转移及Ⅰ＋Ⅱ期的胃癌患者（P〈0.05）,CD133蛋白表达平均相对灰度值在有淋巴管浸润、N3淋巴结转移、肿瘤直径≥5 cm和Ⅲ＋Ⅳ期胃癌患者中的表达显著高于无淋巴管浸润、N0～N2淋巴结转移、肿瘤直径〈5 cm和Ⅰ＋Ⅱ期的胃癌患者（P〈0.05）。③Snail、N-cadherin蛋白表达与CD133蛋白表达分别均呈正相关（rs=0.278,P=0.048;rs=0.406,P=0.003）,而E-cadherin蛋白表达与CD133蛋白表达呈负相关（rs=-0.504,P=0.000）。④Snail、N-cadherin及CD133蛋白低表达组的生存时间明显长于其高表达者（P〈0.05）,联合EMT相关因子和CD133蛋白表达能够最有效预测患者生存。结论EMT与胃癌肿瘤起始细胞特性之间存在明显相关,并且两者与胃癌的高侵袭的临床病理特征相关,联合EMT相关因子Snail、E-cadherin、N-cadherin与CD133能够最有效预测胃癌患者的预后。     

TGF-β1诱导胃癌细胞上皮间质转化及其上调CD44表达的实验研究

目的 观察TGF-β1诱导胃癌SGC7901细胞发生上皮间质转化及其对胃癌细胞生物学特性与肿瘤起始细胞特性的影响.方法 TGF-β1处理胃癌SGC7901细胞后,观察其形态学变化;CCK-8法检测细胞增生能力;划痕实验及transwell实验检测细胞迁移与侵袭能力;免疫荧光法检测上皮钙黏素及间质钙黏素表达的变化;逆转录PCR法与免疫蛋白印迹法检测上皮间质转化相关因子及CD44的表达.结果 TGF-β1处理SGC7901细胞后,细胞形态由上皮细胞形态向间质细胞样形态转变;TGF-β1处理后,处理组划痕愈合程度明显高于对照组(P＜0.05),处理组穿膜细胞数目(107.67±5.48)显著高于对照组(53.33±8.47,P＜0.05),TGF-β1处理组SGC7901细胞上皮钙黏素表达显著降低(P＜0.05),间质钙黏素(P＜0.05)与Snail(P＜0.05)表达显著增加,肿瘤起始细胞相关标志物CD44表达显著增加(P＜0.05).结论 TGF-β1可诱导胃癌SGC7901细胞发生上皮间质转化,增加CD44表达,抑制胃癌细胞增生,促进其侵袭和迁移.     

RNA干扰抑制KATO-Ⅲ CD133阳性胃癌细胞CD133基因表达及对其生物学特性的影响

目的 探讨CD133基因表达被抑制后对胃癌细胞增殖、侵袭、克隆球形成及化疗药物敏感性的影响.方法 通过免疫磁珠分选KATO-Ⅲ胃癌细胞中的CD133阳性细胞,将合成的CD133小干扰核糖核酸分子（siRNA）转染至KATO-ⅢCD133阳性胃癌细胞内,使用荧光标记的siRNA （FAM-siRNA）检测转染效率,通过RT-PCR、Western-blot方法检测CD133基因表达的沉默效果及上皮-间质转化（EMT）相关因子（E-cadherin、Snail和N-cadherin）的蛋白表达,采用CCK-8、Transwell侵袭实验、单克隆球形成实验和CCK- 8等方法分别检测细胞增殖、侵袭、克隆球形成能力及对化疗药物5-氟尿嘧啶（5-FU）的敏感性.结果 转染24 h后,转染效率可达到（87.7±8.1）％.干扰组CD133 mRNA及蛋白的表达显著低于阴性对照组（P＜0.01）.转染24、48和72 h后,与阴性对照组比较,干扰组细胞的增殖活性均得到显著抑制,差异均有统计学意义（P＜0.01）;转染72 h,干扰组细胞的增殖活性较阴性对照组降低了（52.1±8.0）％.与阴性对照组比较,干扰组的细胞侵袭数减少[（41.7±6.0）比 （130.3±11.0）,P＜0.05],克隆球形成率降低[（24.3±4.3）％比（45.1±6.4）％,P＜0.01],Snail和N- cadherin蛋白表达降低（P＜0.01）,而E-cadherin蛋白表达增高（P＜0.01）.干扰组细胞对化疗药物5-FU的敏感性显著增强,5-FU对干扰组细胞的抑制率为（62.4±3.3）％,较阴性对照组的（21.5±2.2）％增加（P＜0.01）.结论 CD133基因在胃癌细胞的增殖、侵袭、克隆球形成和化疗抵抗性等方面具有重要作用,可能是胃癌干细胞新型标志物,有望成为胃癌生物治疗的新靶点.     

胃癌KATO-Ⅲ细胞CD133基因的siRNA干扰及其效果比较

目的 比较3段化学合成的siRNA对KATO-Ⅲ胃癌细胞中CD133基因的抑制效果,并初步探讨CD133基因表达被抑制后对胃癌细胞增生的影响.方法 实验分为空白对照组、阴性对照组、CD133siRNA-1组,CD133siRNA-2组和CD133siRNA-3组.针对CD133mRNA序列设计并合成3段siRNA,利用荧光标记的siRNA转染KATO-Ⅲ胃癌细胞后,通过共聚焦显微镜荧光计数检测其转染率,用RT-PCR法和Western blot法检测并比较3段siRNA对CD133基因表达的沉默效果,采用CCK-8法检测CD133表达被抑制后对胃癌细胞增生的影响.结果 siRNA在KATO-Ⅲ细胞中的转染效率可达到(85±8)％,所设计的3段siRNA均可显著抑制胃癌KATO-Ⅲ细胞CD133基因的表达,抑制率分别为(11±2)％、(19±2)％和(24±3)％.与空白组比较,CD133siRNA-3转染组细胞的增生活性降低了(42±4)％(P＜0.05).结论 成功转染并抑制了KATO-Ⅲ胃癌细胞中CD133基因的表达,并从中筛选出了干扰效果最佳的CD133siRNA片段,为后续CD133+胃癌细胞的干扰提供初步的实验研究.     

胃癌CD133阳性细胞亚群肿瘤起始细胞样特性的检测

目的 探讨人胃癌细胞CD133＋亚群的分选及其特性的鉴定.方法 对50例胃癌原发灶和癌旁胃黏膜组织标本行免疫组织化学染色及Western blot检测CD133蛋白的表达.采用流式细胞仪检测不同分化胃癌细胞系CD133所占百分比,免疫磁珠法分选CD133＋细胞亚群,悬浮培养并观察其生长特性,并检测CD133阳性细胞裸鼠皮下接种致瘤能力.单细胞克隆观察单个CD133＋细胞生长特性,半定量反转录聚合酶链反应法鉴定相关干细胞标记的表达.结果 CD133蛋白多定位于胃癌原发灶黏膜及黏膜下层的肿瘤细胞膜表面,其相对表达量高于癌旁胃黏膜组织（P＜0.05）.不同分化程度的人胃癌细胞系KATO-Ⅲ、SGC-7901、AGS及MKN-45中CD 133＋亚群所占相对百分比为（28±2）％、（17±2）％、（6±2）％及（4±2）％.人胃癌细胞系KATO-Ⅲ分选后阳性组中CD133＋亚群比例分别为（91±3）％;培养1周后,达到（95±2）％,并不断增殖形成细胞球.而且其增殖能力强于阴性细胞[群体倍增时间分别为（21±3）h和（40±8）h,P＜0.05].CD133阳性组和未分选组细胞裸鼠皮下接种时成瘤率分别为100％和80％;而CD133阴性组不成瘤,CD133阳性组移植瘤平均体积及重量均大于未分选组（P＜0.05,P＜0.05）.单克隆形成实验示单个CD133＋细胞可形成新的细胞克隆.半定量RT-PCR检测示其表达干细胞标记物Oct-4、Nanog、Sox-2、Musashi-1及EGFR.结论 体外可成功分离、纯化和扩增人胃癌细胞CD133＋亚群,其具有自我更新、增殖能力及较强的致瘤能力,并表达部分干细胞相关基因.     

CD133通过上皮间质转化促进胃癌侵袭和转移的研究

目的观察胃癌细胞CDl33表达与胃癌侵袭的关系,进而探讨其是否通过上皮间质转化（EMT）促进胃癌侵袭和转移。方法通过免疫磁珠分选技术,将KATO-Ⅲ细胞分为CDl33阳性细胞和CDl33阴性细胞,利用Transwell小室法检测其侵袭能力,并通过Western blot和RT-PCR方法检测siRNA干扰CDl33基因沉默前后其EMT相关因子的表达差异。Western blot法检测50例胃癌组织及癌旁组织CDl33和EMT相关因子的表达．并分析其相关性。结果CDl33阳性组穿膜细胞数（67．7±10．5）显著高于CDl33阴性组（13．3±6．8,P=0．001）。CDl33阳性细胞中Snail和N-cadherinmRNA及蛋白表达显著高于CDl33阴性细胞．而E-cadherin表达则明显低于CDl33阴性细胞（均P〈0．05）。siRNA干扰后,Snail和N-cadherinmRNA及蛋白表达明显下调,而E-cadherin表达则显著上升（均P〈0．05）。胃癌组织中CDl33、Snail及N-cadherin蛋白相对表达为0．635±0．119、0．599±0．114及0．754±0．154,明显高于癌旁组织的0．485±0．116（P=0．029）、0．259±0．108（P=0．020）和0．329±0．134（P=0．001）,而E-cadherin蛋白表达相对表达为0．378±0．123,明显低于癌旁组织的0．752±0．156（P=O．003）。相关分析显示,Snail及N-cadherin的表达与CDl33表达呈正相关（P〈0．05）,而E-cadherin的表达则与CDl33表达呈负相关（P〈O．05）。结论CDl33阳性胃癌细胞具有更强的侵袭能力,并可能通过EMT促进胃癌的侵袭和转移。     

胃癌中CXCR4和CD133的表达及其对淋巴转移的影响

目的:探讨CXCR4和CD133在胃癌原发灶中的表达及其对淋巴转移的影响。方法:对50例原发性胃癌原发灶和癌旁胃黏膜组织行免疫组化染色法定位检测CXCR4和CD133蛋白;选用半定量RT-PCR及Western blot法测定CXCR4和CD133 mRNA与蛋白表达量,分析两者的相关性及其与淋巴管浸润和淋巴结转移的关系。结果:CXCR4和CD133分子均定位于肿瘤细胞膜表面,极少数CXCR4位于细胞核内。胃癌组织中CXCR4和CD133表达阳性率及mRNA和蛋白的表达量均明显高于癌旁胃黏膜组织(均P<0.05);CXCR4和CD133 mRNA相对灰度值在淋巴结转移组高于无淋巴结转移组(P=0.011,P=0.038);N1组CXCR4蛋白相对灰度值明显高于N0组(P=0.023),而低于N2+N3组(P=0.008),N1组和N2+N3组CD133蛋白灰度值明显高于N0组(P=0.04,P=0.01),但N1组与N2+N3组之间无明显差异;淋巴管浸润组中的CXCR4和CD133蛋白相对灰度值均高于淋巴管无浸润组(P<0.05);在淋巴转移患者中,CXCR4和CD133蛋白相对灰度值分别与转移淋巴结数(r=0.480,r=0.426)及转移性淋巴结比率(r=0.502,r=0.489)呈正相关。结论:CXCR4和CD133在胃癌原发灶中高表达,两者呈正相关,其联合表达与转移淋巴结比率和转移淋巴结数呈正相关,推测胃癌CD133阳性细胞亚群可能在CXCR4介导下更易导致淋巴管浸润和淋巴结转移。     

胃癌CD133阳性细胞的纯化及其生物学特性研究

目的检测人胃癌KATO-Ⅲ、SGC7901、AGS及MKN-45细胞株中CD133基因及蛋白的表达,研究CD133阳性(CD133+)细胞与CD133阴性(CD133-)细胞的生物学特性的差异。方法采用半定量聚合酶链反应及免疫蛋白印迹法分别检测KATO-Ⅲ、SGC7901、AGS及MKN-45细胞株中CD133基因和蛋白的表达;免疫磁珠细胞技术将KATO-Ⅲ细胞株中CD133+和CD133-细胞分离纯化,对比两者生长形态特点、体外增殖能力及分化能力的差异;采用CCK-8法分析CD133+和CD133-细胞对不同浓度(0.05、0.10、0.20、0.50、1.00mg/ml)化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)敏感性的差别。结果 KATO-Ⅲ细胞中CD133基因及蛋白表达量均明显高于SGC7901、AGS及MKN-45细胞(P<0.05)。CD133+细胞在无血清培养基中呈球形克隆悬浮生长,相比CD133-细胞具有更强的体外增殖能力及潜在分化能力。5-FU耐药性实验中,CD133+细胞在0.50mg/ml浓度下的抑制率较CD133-细胞明显降低(P<0.05),但其他浓度时二者比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论人胃癌细胞株KATO-Ⅲ中的CD133+细胞具有一定增殖、分化及耐药潜能,CD133可作为胃肿瘤起始细胞亚群的表面标志之一。     

CD133、CXCR4共表达与胆囊癌转移特性的相关性研究

目的探讨CD133、CXCR4共表达与胆囊癌转移特性之间的关系。方法培养胆囊癌GBC~-SD细胞,并经免疫磁珠分选法分选得到CXCR4~+和CXCR4~-亚群胆囊癌GBC~-SD细胞,分为CD133~-CXCR4~-、CD133~-CXCR4~+、CD133~+CXCR4~-及CD133~+CXCR4~+四组,以Transwell法检测四组胆囊癌GBC~-SD细胞侵袭能力。Western~-blot法检测CD133~+CXCR4~+组与CD133~+CXCR4~-组细胞上皮间质转化相关因子表达。Western blot法检测21例胆囊癌原发灶组织标本中CD133与CXCR4蛋白表达与淋巴结转移、肝脏侵犯、胆管侵犯及TNM分期之间的关系。结果 CD133~+CXCR4~+组平均穿膜细胞数为(32.49±9.45),显著高于CD133~+CXCR4~-组的(16.17±8.55),差异具有统计学意义(P=0.02)。CD133~+CXCR4~+组N~-cadherin蛋白灰度值为(0.8321±0.1259),显著高于CD133~+CXCR4~-组的(0.4572±0.0775),差异有统计学意义(P=0.004)。CD133~+CXCR4~+组E~-cadherin蛋白灰度值为(0.4712±0.0736),显著低于CD133~+CXCR4~-组的(0.8439±0.1339),差异有统计学意义(P=0.006)。CD133~+CXCR4~+组Snail蛋白相对灰度值为(0.9455±0.1228),显著高于CD133~+CXCR4~-组的(0.3219±0.0934),差异有统计学意义(P=0.003)。胆囊癌标本淋巴结转移组、肝脏侵犯组、胆管侵犯组CXCR4蛋白表达值显著高于对应阴性组(P=0.013,P=0.024,P=0.037),Ⅰ/Ⅱ分期组显著低于Ⅲ/Ⅳ组,差异有统计学意义(P=0.016)。淋巴结转移组CD133蛋白表达显著高于对应阴性组,差异有统计学意义(P=0.009),Ⅰ/Ⅱ分期组显著低于Ⅲ/Ⅳ组,差异有统计学意义(P=0.018)。肝脏侵犯组、胆管侵犯组与相应对照组CD133蛋白相对表达差异无统计学意义(P=0.443,P=0.371)。CD133蛋白与CXCR4蛋白表达存在明显正相关(r=0.693,P0.01)。结论 CD133、CXCR4共表达预示胆囊癌具有较强的转移特性。     

前列腺癌患者外周血中CD4+CD25high调节性T细胞及调节因子TGF-31和COX-2的表达

目的:通过检测前列腺癌患者以及健康志愿者外周血中CD4+ CD25high调节性T细胞、TGF-β1及COX-2的表达,初步探讨CD4+ CD25high调节性T细胞在前列腺癌发病机制中的作用及其与TGF-β1和COX-2的相关性.方法:应用流式细胞术检测30例前列腺癌患者治疗前后(其中前列腺癌局限组11例,非局限组19例)及20例健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)中CD4+ CD25high调节性T细胞占CD4+T细胞的比例;应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其外周血清中TGF-β1和COX-2的表达.对前列腺癌患者上述指标进行术前术后对比分析,另对CD4+ CD25high调节性T细胞与TGF-β1及COX-2的相关性进行分析;并探讨上述指标在前列腺癌患者局限组和非局限组间是否存在差异性.结果:流式细胞术检测显示,前列腺癌患者治疗前PBMC中CD4+ CD25high调节性T细胞占CD4+T细胞的比例为(18.32±7.49)%,高于健康志愿者对照组(7.77±1.86)%(P＜0.05).前列腺癌患者治疗后其比值为(17.34±5.87)%,较治疗前稍减低,但两者相比无显著差异(P＞0.05).ELISA检测外周血清中TGF-β1和COX-2显示,前列腺癌组分别为(215.97±55.16) ng/ml和(6.88±5.14) ng/ml,对照组分别为(149.75±:47.11) ng/ml和(5.65±2.69) ng/ml;前列腺癌患者外周血清中TGF-β1的表达水平高于健康志愿者对照组(P＜0.05),COX-2的表达水平与对照组无显著差异(P＞0.05).通过多重线性回归分析表明,前列腺癌患者PBMC中C14+ CD25high调节性T细胞的表达与血清中TGF-β1和COX-2的表达无显著相关.前列腺癌局限组和非局限组外周血中CD4+ CD25 high调节性T细胞、TGF-β1及COX-2的表达均无显著性差异(P＞0.05).结论:前列腺癌患者PBMC中CD4+ CD25high调节性T细胞可能参与前列腺癌的发生,其增殖机制与血清中TGF-β1和COX-2的表达无关,可能与肿瘤本身及肿瘤局部微环境相关.     

胃癌患者外周血CD133 mRNA检测及其临床意义

目的 探讨胃癌患者外周血CD133 mRNA表达情况及其临床意义.方法 抽取10名健康志愿者（组1）、5例胃溃疡穿孔患者（组2）,18例胃癌术前患者（组3）及19例胃癌术后患者（组4）外周静脉血2 ml,分离单核细胞,采用半定量RT-PCR检测CD133 mRNA表达水平.结果 组3患者外周血CD133 mRNA灰度值显著高于组1和组2（P=0.001）.组4患者中12例复发转移者外周血CD133mRNA灰度值显著高于7例无复发转移者（P=0.042）.CD133 mRNA表达与淋巴结转移和肿瘤分期有关（P＜0.05）.CD133 mRNA灰度值与淋巴结转移率呈正相关（P=0.007）.结论 胃癌患者外周血高表达CD133 mRNA,其表达与淋巴结转移率正相关.胃癌术后外周血高表达CD133mRNA提示肿瘤复发或转移.     

前列腺癌患者外周血中CD4^＋CD25^high调节性T细胞及调节因子TGF-β1和COX-2的表达

目的：通过检测前列腺癌患者以及健康志愿者外周血中CD4＋CD25high调节性T细胞、TGF-β1及COX-2的表达,初步探讨CD4＋CD25high调节性T细胞在前列腺癌发病机制中的作用及其与TGF-β1和COX-2的相关性。方法：应用流式细胞术检测30例前列腺癌患者治疗前后（其中前列腺癌局限组11例,非局限组19例）及20例健康志愿者外周血单个核细胞（PBMC）中CD4＋CD25high调节性T细胞占CD4＋T细胞的比例;应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其外周血清中TGF-β1和COX-2的表达。对前列腺癌患者上述指标进行术前术后对比分析,另对CD4＋CD25high调节性T细胞与TGF-β1及COX-2的相关性进行分析;并探讨上述指标在前列腺癌患者局限组和非局限组间是否存在差异性。结果：流式细胞术检测显示,前列腺癌患者治疗前PBMC中CD4＋CD25high调节性T细胞占CD4＋T细胞的比例为（18.32±7.49）%,高于健康志愿者对照组（7.77±1.86）%（P〈0.05）。前列腺癌患者治疗后其比值为（17.34±5.87）%,较治疗前稍减低,但两者相比无显著差异（P〉0.05）。ELISA检测外周血清中TGF-β1和COX-2显示,前列腺癌组分别为（215.97±55.16）ng/ml和（6.88±5.14）ng/ml,对照组分别为（149.75±47.11）ng/ml和（5.65±2.69）ng/ml;前列腺癌患者外周血清中TGF-β1的表达水平高于健康志愿者对照组（P〈0.05）,COX-2的表达水平与对照组无显著差异（P〉0.05）。通过多重线性回归分析表明,前列腺癌患者PBMC中CD4＋CD25high调节性T细胞的表达与血清中TGF-β1和COX-2的表达无显著相关。前列腺癌局限组和非局限组外周血中CD4＋CD25high调节性T细胞、TGF-β1及COX-2的表达均无显著性差异（P〉0.05）。结论：前列腺癌患者PBMC中CD4＋CD25high调节性T细胞可能参与前列腺癌的发生,其增殖机制与血清中TGF-β1和COX-2的表达无关,可能与肿瘤本身及肿瘤局部微环境相关。     

LncRNA C21orF96通过调控miR-875-5p和USF2基因表达促进胃癌细胞的侵袭和转移

目的探讨lncRNA-C21orF96调控miRNA-875-5p和USF2基因表达促进胃癌细胞的侵袭和转移机制。方法采用RT-PCR技术检测胃癌细胞中与lncRNA-C21orF96相关的m iRNA的含量;胃癌细胞KATO-Ⅲ经pcDNA3.1质粒过表达lncRNA-C21orF96,SGC-7901细胞经siRNA干扰lncRNA-C21orF96表达后,采用R T-PCR技术检测胃癌细胞中miR-875-5p和USF2基因表达量的变化;胃癌细胞MKN45过表达lncRNA-C21orF96后,采用Transwell实验观察细胞侵袭和迁移能力的变化。结果在胃癌细胞中,lncRNA-C21orF96与miR-875-5P值呈显著的相反关系,两者之间相对定量值差异具有统计学意义(SGC-7901细胞:21.19±1.09比3.28±0.06,P<0.01;SNU-16细胞:24.76±2.09比8.16±0.07,P<0.01);转染lncRNA-C21orF96表达载体的KATO-Ⅲ细胞中miR-875-5p表达显著下降而USF2基因表达升高(0<0.01);转染lncRNA-C21orF96干扰载体的SGC-7901细胞中miR-875-5p表达显著升高而USF2基因表达降低(P<0.05);lncRNA-C21orF96过表达后,实验组穿过人工基底膜的平均细胞数与对照组相比差异具有统计学意义[迁移实验:(216.19±2.30)个比(89.19±4.60)个,P<0.001;侵袭实验:(146.18±5.3)个比(59.18±2.60)个,P<0.001]。结论lncRNA-C21orF96的过表达能显著调控miR-875-5p表达同时促进USF2基因表达,促进胃癌细胞的侵袭和转移。     

转化生长因子-β1诱导体外失神经骨骼肌肌源性干细胞分化的研究

目的 探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)对体外失神经骨骼肌肌源性干细胞(MDSCs)分化方向的作用.方法 采用差速贴壁法分离出大鼠失神经骨骼肌肌源性干细胞,利用TGF-β1诱导分化.将细胞随机分为两组:A,对照组;B,10 ng/ml TGF-β1处理组.在相差显微镜下观察细胞生长情况,用免疫细胞化学法、RT-PCR和Western blot检测两组细胞中Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(COL-Ⅲ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(vimentin)和干细胞抗原-1(Sca-1)的表达水平变化.结果 在体外,对照组失神经骨骼肌MDSCs表达和合成COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA和vimentin的水平极低,而表达和合成Sca-1的水平很高.10 ng/ml TGF-β1处理后,失神经骨骼肌MDSCs能高表达COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA和vimentin,而低表达Sca-1.在TGF-β1的作用下,失神经骨骼肌MDSCs中COL-Ⅰ的表达水平在第2天时达最高值(12.5591±0.3389),约为对照组的3倍;COL-Ⅲ在5d时达最高值(0.8956±0.0438),约为对照组的23倍;α-SMA在第5天时达最高值(1.1090±0.0018),约为对照组的18倍;vimentin在5d时达最高值(0.1794±0.0019),约为对照组的8.5倍;Sca-1在第2天时开始降低,第5天时降低最显著(0.0636±0.0015).结论 TGF-β1能诱导体外失神经骨骼肌MDSCs向肌成纤维母细胞(myofibroblasts)分化,促进细胞合成和分泌细胞外基质.     

Wnt/β连环蛋白信号在人真皮成纤维细胞表型转化中的作用及机制

目的 了解Wnt/β连环蛋白信号在人正常真皮Fb向肌成纤维细胞(MFb)表型转化中的作用及机制.方法 采用酶消化法分离培养人正常皮肤真皮Fb.(1)实验1.按随机数字表法将细胞分为4组:对照组,采用无血清DMEM培养液(以下简称培养液)培养;TGF-β1组,用含10 ng/mL重组人TGF-β1(浓度下同)的培养液培养;Wnt3a组,用含150 ng/mL重组人Wnt3a(浓度下同)的培养液培养;TGF-β1+Wnt3a组,用含重组人TGF-β1和重组人Wnt3a的培养液培养.48 h后,分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法,检测Fb β连环蛋白和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA及蛋白表达水平.(2)实验2.按照随机数字表法将细胞分为4组:对照组、TGF-β1组,处理方法均同实验1;SB415286(糖原合酶激酶3β阻断剂)组,用含10 μmol/L SB415286(浓度下同)的培养液培养;TGF-β1+ SB415286组,用含重组人TGF-β1和SB415286的培养液培养.48 h后,分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测Fb α-SMA的mRNA和蛋白表达水平;用免疫荧光细胞化学法检测α-SMA阳性表达情况.各项检测重复3次,对数据进行方差分析及LSD-t检验.结果 (1)实验1.①β连环蛋白的mRNA表达水平:对照组、TGF-β1组、Wnt3a组和TGF-β1+Wnt3a组Fb组间比较,差异无统计学意义(F=0.302,P=0.823).②β连环蛋白的蛋白表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=16.713,P=0.001).与对照组表达水平(0.34±0.11)相比,TGF-β1组、Wnt3a组均显著上调(0.73±0.12、0.82±0.17,t值分别为3.028、3.727,P＜0.05或P＜0.01).TGF-β1+Wnt3a组(1.23±0.21)显著高于其余3组(t值分别为6.911、3.883、3.184,P值均小于0.01).③α-SMA mRNA表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=31.830,P=0.001);与对照组相比,TGF-β1组显著上调,Wnt3a组下调(t值分别为6.759、2.535,P＜0.05或P＜0.01);TGF-β1+Wnt3a组低于TGF-β1组(t=4.532,P＜0.01).④α-SMA蛋白表达水平:对照组、TGF-β1组、Wnt3a组、TGF-β1+ Wnt3a组分别为0.83±0.17、1.43±0.20、0.53±0.12、0.89±0.14(F=16.597,P=0.001).与对照组相比,TGF-β1组显著上调,Wnt3a组下调(t值分别为4.582、2.291,P＜0.05或P ＜0.01);TGF-β1 +Wnt3a组低于TGF-β1组(t =4.123,P＜0.01).(2)实验2.①α-SMA mRNA表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=34.101,P=0.001).SB415286组明显低于对照组(t =2.511,P＜0.05),TGF-β1+SB415286组明显低于TGF-β1组(t=3.587,P＜0.01).②α-SMA蛋白表达水平:4组细胞比较,差异有统计学意义(F =11.381,P=0.003).SB415286组显著低于对照组(t=2.364,P＜0.05),TGF-β1+ SB415286组低于TGF-β1组(t=2.556,P＜0.05).③免疫荧光细胞化学法检测显示,对照组Fb α-SMA表达微弱;TGF-β1组α-SMA表达较对照组显著增强(t =11.198,P＜0.01);SB415286组表达较对照组减少,TGF-β1+ SB415286组表达较TGF-β1组显著减少(t=5.902,P＜0.01).结论 Wnt/β连环蛋白信号可能参与Fb细胞表型转化,并且对TGF-β1所介导的促转化效应起负性调控作用.     

胃癌患者CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞与TGF-β1检测的意义

目的:探讨胃癌患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(CD4+CD25+Foxp3+Tergs)以及血清TGF-β1水平的变化及意义。方法:检测并比较42例胃癌患者(胃癌组)与24例健康体检者(对照组)外周血CD4+CD25+Foxp3+Tergs与血清TGF-β1水平,分析两者水平与胃癌患者临床病理因素的关系。结果:胃癌组CD4+CD25+Foxp3+Tergs和TGF-β1水平均明显高于对照组(均P<0.05)。胃癌患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Tergs水平与TNM分期、淋巴结转移有关(均P<0.05),而血清TGF-β1的表达水平与TNM分期、分化程度、淋巴结转移有关(均P<0.05);胃癌组患者外周血内CD4+CD25+Foxp3+Tergs的表达水平与血清内TGF-β1的表达水平呈明显正相关(r=0.801,P<0.05)。结论:胃癌患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Tergs水平及血清TGF-β1水平升高,检测两者水平有助于患者病情与预后的判断。     

细胞间黏附分子复合体表达与胃癌侵袭转移及预后的关系

目的探讨细胞间黏附分子复合体表达与胃癌侵袭转移及预后的关系。方法应用免疫组化SP法,检测胃癌组织与非肿瘤胃黏膜组织中的Syndecan-1、E钙粘素（E-cadherin）与整合素β3（integrin-β3）的表达。结果本组118例胃癌组织中Syndecan-1、E-cadherin的表达明显低于20例非肿瘤胃黏膜组织（P=0.000、P=0.000）,其表达水平与肿瘤的浸润深度（P=0.000、P= 0.000）、脉管侵犯（P=0.000、P=0.000）、淋巴结转移（P=0.000、P=0.000）和远处转移（P=0.000、P=0.000）呈显著负相关;而integrin-β3的表达明显高于非肿瘤胃黏膜组织（P=0.000）,其表达水平与肿瘤的浸润深度（P=0.000）、脉管侵犯（P=0.000）、淋巴结转移（P=0.000）和远处转移（P= 0.000）呈显著正相关。三种蛋白的表达均与胃癌的生长方式相关（P=0.000、P=0.000、P=0.015）,而与分化程度无关（P=0.063、P=0.138、P=0.585）。Syndecan-1与E-cadherin两种蛋白表达水平呈显著正相关（P=0.000）,二者与integrin-β3的表达水平均呈显著负相关（P=0.000、P=0.000）。单因素分析显示,Syndecan-1、E-cadherin蛋白低表达及integrin-β3白高表达患者的5年生存率均低于Syndecan-1、E-cadherin蛋白高表达及integrin-β3白低表达的患者（分别为12.8%及91.7%,P= 0.000;12.8%及93.6%,P=0.000;13.9%及72.8%,P=0.000）。COX模型多因素分析显示,Syndecan-1的表达水平可作为独立于胃癌生长方式、浸润深度、脉管侵犯、淋巴结转移和远处转移等指标外的胃癌预后指标（P=0.000）,而E-cadherin与integrin-β3能作为反映胃癌预后的独立指标（P=0.978、P=0.789）。结论Syndecan-1、E-cadherin蛋白低表达及integrin-β3蛋白高表达均与胃癌的侵袭与转移显著相关,可作为胃癌预后判断的重要指标。     

免疫磁珠法分离胆囊癌CD133阳性细胞及其生物学特性鉴定

目的 建立胆囊癌CD133+细胞分离纯化的方法,观察胆囊癌CD133+细胞和CD133-细胞生物学特性的差异.方法 流式细胞仪检测胆囊癌GBC-SD、SGC996细胞中CD133所占百分比,免疫磁珠法分选CD133+细胞亚群,免疫荧光法定位检测CD133蛋白表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测CD133 mRNA表达,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测CD133+组和CD133-组细胞增殖能力及对5-氟尿嘧啶(5-Fu)耐药特性的差异,单克隆形成实验观察单个CD133+细胞生长特性.结果 胆囊癌GBC-SD、SGC996细胞中CD133+亚群所占相对百分比为(68.5±2.9)％、(0.3±0.2)％.GBC-SD组CD133 mRNA相对灰度值(0.6466±0.0259)显著高于SGC996组(0.2181±0.0108,P＜0.01).CD133蛋白定位于细胞膜表面,并在GBC-SD细胞中呈强表达.人胆囊癌GBC-SD细胞分选后,CD133+组CD133蛋白表达明显强于CD133-组.CD133+组中CD133+亚群所占比例为(90.4±0.9)％.CD133+组CD133mRNA相对灰度值(0.7734±0.0217)显著高于CD133-组(0.2146 ±0.0174,P＜0.01).CD133+组细胞增殖能力明显强于CD133-组(P＜0.01).经5-Fu(0.1μg/ml)处理后,CD133+组细胞生存率明显高于CD133-组(P＜0.05).单克隆形成实验结果示单个CD133+细胞可形成新的细胞克隆,且CD133+组[(36.25±2.99)％]细胞克隆球形成率高于CD133-组[(4.50±1.29)％,P＜0.01].体内成瘤实验结果示CD133+组与未分选组移植成瘤率分别为100％和60％,而CD133-组不成瘤.结论 免疫磁珠分选系统可成功分离高纯度的胆囊癌CD133+细胞,而且人胆囊癌CD133+细胞具有一定的增殖、耐药、自我更新及致瘤潜能.     

Smad4在TGF-β诱导人胆管癌细胞上皮-间质转化中的作用

目的 探讨Smad4在TGF-β诱导人胆管癌细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的作用.方法 用转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)处理RBE人胆管癌细胞系24h后,观察其形态变化,采用Western Blotting检测TGF-β1处理0h、12h、24h、48h后RBE细胞N-钙黏蛋白(N-cadherin)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达.通过RNA干扰技术建立稳定干扰Smad4表达的细胞系,在无TGF-β1处理或TGF-β1处理24h后,观察Smad4干扰组与野生型组和空载体组细胞的形态差异,Western Blotting检测各组N-cadherin和E-cadherin的表达水平.结果 TGF-β1诱导RBE细胞的形态由上皮样向间质样转变,促进 N-cadherin表达增加和E-cadherin表达降低.在无TGF-β1处理时,Smad4干扰组细胞比野生型组和空载体组细胞的形态更趋于上皮样,E-cadherin表达水平也显著高于野生型组和空载体组(P＜0.05).在TGF-β1处理24h后,Smad4干扰组细胞形态的间质样变化程度、N-cadherin表达量明显低于野生型组和空载体组(P＜0.05);野生型组和空载体组细胞E-cadherin的表达缺失,而Smad4干扰组细胞仍表达较高水平的E-cadherin,两者间差异显著(P＜0.05).结论 TGF-β依赖Smad4介导人胆管癌细胞发生上皮-间质转化.