人Hiwi miRNA干扰质粒的构建及其鉴定

目的构建人Hiwi基因miRNA干扰质粒,探讨其对肝癌7721细胞株中Hiwi基因和蛋白表达的阻抑作用。方法根据Homo sapiens Hiwi基因序列,设计RNA干扰靶点,构建4对Hiwi的pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR miRNA及1对无效对照miRNA干扰质粒并将其转染至肝癌7721细胞中,通过RT-PCR和Western blot检测7721细胞中HiwimRNA和蛋白的表达水平。结果成功构建了4对Hiwi miRNA干扰质粒及无效干扰质粒,测序表明Hiwi干扰序列及读框完全正确。RT-PCR和Western blot结果显示,与未转染组及阴性对照组比较,转染该载体能有效下调7721细胞株中mRNA和蛋白的表达。结论成功构建了Hiwi的干扰表达载体,为进一步探讨Hiwi基因在肝癌中的相关机制提供了实验基础。     

大鼠组织因子基因克隆及其在C6细胞系中的表达

目的:克隆大鼠组织因子(tissue factor,TF)基因,构建真核表达载体pEGFP-N1-TF,转染C6大鼠神经胶质瘤细胞并检测转染细胞内TF表达水平.方法:采用RT-PCR法从Wistar大鼠肺组织中扩增TF基因,克隆到真核表达载体pEGFP-N1上.通过测序鉴定重组质粒中插入TF的完整性和可靠性.应用脂质体法将鉴定正确的重组质粒转入C6细胞中,荧光显微镜下观察EGFP报告基因的表达强度和转染效率,并对转染细胞的TF-eGFP融合蛋白进行Western blot检测.结果:成功构建pEGFP-N1-TF真核表达载体,转染C6细胞24 h后,在荧光显微镜下可以观测到荧光,并通过Western blot技术检测到TF-eGFP融合蛋白的表达.结论:重组真核表达载体pEGFP-N1-TF构建成功,转染C6细胞后获得了良好的瞬时表达.     

pEGFP-BMI-1真核表达载体的构建、鉴定及其表达

本研究构建真核表达载体pEGFP-BMI-1并观察其在HeLa细胞中的表达。将BMI-1逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)产物克隆入pEGFP-N1,经酶切、PCR鉴定及测序分析,构建pEGFP-BMI-1真核表达载体;采用脂质体转染法,将融合基因pEGFP-BMI-1转入HeLa细胞,用荧光显微镜和Western blot检测其表达,SYBR Green I实时定量RT-PCR方法检测转染前后HeLa细胞中P16INK4a mRNA的表达变化。结果表明:重组后的pEGFP-N1质粒已成功载入BMI-1的全长编码基因,序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜下可见在转染pEGFP-BMI-1的HeLa细胞中存在荧光分布;Western blot检测发现存在外源性融合蛋白BMI-1-EGFP的表达。在HeLa细胞中过表达BMI-1显著下调P16INK4a mRNA的表达为对照组的9.2%(P<0.01)。结论:成功构建了真核表达质粒pEGFPBMI-1,转染HeLa细胞后可表达融合蛋白BMI-1-EGFP。这为今后研究BMI-1在肿瘤发生发展中的机制奠定了基础。     

SV2A基因真核表达质粒构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的构建鼠突触囊泡蛋白2A(SV2A)基因的真核表达质粒,并瞬时转染至人胚肾细胞(HEK293T)中,对其表达进行鉴定。方法以APP/PS1双转基因小鼠海马组织的cDNA为模板,扩增得到长2239 bp的SV2A基因编码序列,将此序列插入到真核表达载体p3×Flag-CMV-10多克隆位点区域中,得到真核表达质粒p3×Flag-CMV-10-SV2A,转化后挑取单克隆菌落经双酶切鉴定后送公司测序,将构建成功的重组质粒转染至HEK293T细胞中,利用蛋白质印迹法(Western blot)检测SV2A基因的表达情况。结果成功构建p3×Flag-CMV-10-SV2A重组质粒,并在转染至HEK293T细胞后,验证了相应蛋白表达。结论利用分子克隆技术成功构建了p3×Flag-CMV-10-SV2A真核表达质粒并在HEK293T细胞中正确表达,为后续实验奠定了基础。     

人Seipin基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建人Seipin基因的真核表达质粒并转染293T细胞后进行鉴定。方法采用PCR法从人睾丸组织中扩增人Seipin基因,通过BamHI/XhoI限制性酶切位点克隆入真核表达载体pEGFP-C1内,构建含人Seipin基因的真核表达质粒pEGFP-Seipin。运用真核转染、Western blot和免疫荧光实验的方法,鉴定Seipin在真核细胞293T中的表达。结果克隆的人Seipin基因,测序结果显示完全正确。瞬时转染真核细胞293T后,采用Western blot在预期的位置检测出目的条带,免疫荧光实验显示293T细胞中存在人Seipin基因的表达。结论成功构建了含人Seipin基因的真核表达质粒。     

人上皮细胞黏附分子的真核表达及鉴定

目的构建人上皮细胞黏附分子(EpCAM)全基因的真核表达质粒,研究其在HepG2细胞中的表达。方法将EpCAM基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-EpCAM,转染人肝癌HepG2细胞。通过免疫荧光、Western Blotting及流式细胞检测对转染后细胞内EpCAM蛋白的表达进行鉴定。结果双酶切鉴定结果表明重组质粒构建成功。免疫荧光、Western Blotting及流式细胞检测结果一致表明,转染后EpCAM基因在HepG2细胞中表达成功。结论成功构建了人EpCAM的真核表达载体,并在HepG2细胞中表达,为研究高表达人EpCAM的肝癌细胞的功能打下基础。     

整合蛋白β1 shRNA表达质粒的构建及其对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响

目的 应用RNAi技术,构建整合蛋白β1 shRNA表达质粒,诱导肝癌细胞中整合蛋白β1基因沉默,并观察其对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响.方法 设计整合蛋白β1 shRNA序列,与载体pSilencer 2.0连接,构建整合蛋白β1 shRNA表达质粒.经测序鉴定后,转染肝癌细胞SMMC-7721, Western blot检测整合蛋白β1及p27的蛋白表达, MTT方法测定转染后细胞的增殖能力.结果 成功构建了整合蛋白β1 shRNA表达质粒,转染肝癌细胞SMMC-7721后,整合蛋白β1的蛋白表达被明显抑制, p27的蛋白表达也随之减少.MTT实验结果发现转染细胞的增殖能力明显提高.结论 应用RNAi技术,可特异性阻断整合蛋白β1的蛋白表达.整合蛋白β1可调节肝癌细胞的增殖,并可能与p27的表达相关.     

整合蛋白β_1 shRNA表达质粒的构建及其对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响

目的应用RNAi技术,构建整合蛋白β1 shRNA表达质粒,诱导肝癌细胞中整合蛋白β1基因沉默,并观察其对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响。方法设计整合蛋白β1 shRNA序列,与载体pSilencer 2.0连接,构建整合蛋白β1 shRNA表达质粒。经测序鉴定后,转染肝癌细胞SMMC-7721,Western blot检测整合蛋白β1及p27的蛋白表达,MTT方法测定转染后细胞的增殖能力。结果成功构建了整合蛋白β1 shRNA表达质粒,转染肝癌细胞SMMC-7721后,整合蛋白β1的蛋白表达被明显抑制,p27的蛋白表达也随之减少。MTT实验结果发现转染细胞的增殖能力明显提高。结论应用RNAi技术,可特异性阻断整合蛋白β1的蛋白表达。整合蛋白β1可调节肝癌细胞的增殖,并可能与p27的表达相关。     

构建血红素氧合酶1基因真核表达质粒及在大鼠主动脉平滑肌细胞中的表达

目的：克隆血红素氧合酶1基因并构建其真核表达重组质粒，进一步检测血红素氧合酶1基因转染大鼠主动脉平滑肌细胞及其表达目的蛋白的效果。 方法：实验于2007-02／12在泸州医学院中心试验室完成。取雄性健康成年SD大鼠1只，腹腔注射氯化汞（1mg／kg）24h后，麻醉状态下取肾脏，从大鼠肾组织中提取总RNA，通过反转录-聚合酶链反应扩增大鼠血红素氧合酶1基因片段，并将其克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，运用脂质体将重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1转染主动脉平滑肌细胞，通过反转录-聚合酶链反应和Western blot分析血红素氧合酶1基因细胞转染及表达的效果。 结果：经双酶切及测序鉴定证明，正确克隆了血红素氧合酶1基因并成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1。反转录-聚合酶链反应及Western blot分析显示血红素氧合酶1基因能成功转染主动脉平滑肌细胞并在mRNA水平和蛋白水平有效表达。 结论：①成功构建血红素氧合酶1基因真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1。②脂质体包裹重组质粒瞬时成功转染到体外培养的主动脉平滑肌细胞并得到有效表达。     

抑制促血管生成素基因表达对肝癌血管生成的影响

目的:观察抑制促血管生成素-2(Ang-2)基因表达后时人肝癌细胞系SMMc7721体外成瘤性和血管生成的影响,阐明Ang-2基因在肝癌血管生成和转移过程中的作用,为研究抗血管生成疗法奠定基础.方法:选择携带Ang-2基因的肝癌细胞系SMMC7721,通过脂质体介导的基因转染方法将特异干扰性小RNA(siRNA)基因导入SMMC7721肝癌细胞系,并用G418筛选稳定表达的细胞克隆,用RT-PCR和免疫荧光法检测是否成功构建了抑制Ang-2基因表达的SMMC7721肝癌细胞系.将63只裸鼠随机分成3组,分别用转染和未转染siRNA基因的携带Ang-2基因SMMC7721肝癌细胞及不携带Ang-2基因SMMC7721肝癌细胞注射于裸鼠皮下产生肿瘤结节,观察肿瘤的生长的速度并对肿瘤组织中的微血管进行检测.结果:用RT-PCR方法从RNA水平以及用免疫荧光法从蛋白质水平均证实新构建的肝癌细胞系成功抑制了Ang-2基因及其蛋白产物的表达.抑制了Ang-2基因后肿瘤生长速度明显减慢(P<0.05),肿瘤组织中血管生成的数量较未转染前明显减少(P<0.05).结论:Ang-2的表达增强了人肝癌细胞系SMMC7721的体外成瘤性并促进了肿瘤组织中的血管生成.抑制Ang-2的表达可以明显减弱这种促进作用.     

外源性子宫珠蛋白基因对宫颈癌HeLa细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨人子宫珠蛋白（UG）基因对宫颈癌Hela细胞系细胞增殖及凋亡的影响。方法构建真核细胞表达载体pcDNA3．1-UG（＋），以脂质体介导法稳定转染体外培养的人宫颈癌Hela细胞，同时转染空载体pcDNA3．1质粒，以未转染细胞为对照，转染成功后分别命名为pcDNA3．1-UG（＋）／Hela组、pcDNA3．1／Hela组、Hela组。应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、Western blot方法分析目的基因表达，并采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法和流式细胞术检测细胞增殖和细胞凋亡。结果pcDNA3，1-UG（＋）／Hela组UGmRNA及UG蛋白出现明显的高表达，与对照组细胞相比差异有统计学意义（P〈0．05）；pcDNA3．1UG（＋）／Hela组细胞生长速度明显慢于未转染Hela细胞，其细胞凋亡率与未转染Hela细胞相比差异也有统计学意义；然而pcDNA3．1／Hela组细胞生长速度和凋亡率均无明显变化。结论转染UG基因能诱导Hela细胞凋亡及抑制Hela细胞生长。     

sox4不同结构域的真核表达质粒的构建和鉴定

目的：构建并鉴定sox4四段不同结构域的重组真核表达质粒。方法：以HL-60细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增出sox4基因cDNA,将产物克隆进真核载体pCMV—Flag质粒内,构建含sox4不同结构域的重组真核表达质粒。将pCMV—Flag—sox4重组质粒转染293T细胞,Westernblot检测sox4蛋白表达。结果：核酸序列分析sox4已成功插入pCMV—Flag载体中,转染pCMV—Flag-sox4的293T细胞中检测到表达的sox4蛋白。结论：成功构建了含sox4基因的重组真核表达质粒。     

稳定表达HLA-A*1101蛋白的K562细胞株的建立

本研究目的是建立稳定表达HLA-A*1101分子的K562细胞株,为研究慢性髓系白血病(CML)HLA-I限制性抗原特异T细胞的细胞毒作用提供靶细胞.利用RT-PCR从CML患者外周血单个细胞中扩增HLA-A*1101基因全长序列;利用重组PCR将2A肽连接子(D-V-E-X-N-P-G-P)基因连接到HLA-A+ 1101的3’端,并将其定向克隆入带有增强型绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pEGFP-N3,构成HLA-A+ 1101-T2A-EGFP转录盒的重组表达载体;利用电穿孔技术将pEGFP-N3或重组质粒转染入K562细胞,利用荧光显微镜监测绿色荧光蛋白的表达,通过G418筛选出有效转染pEGFP-N3或HLA-A* 1101 -T2A-EGFP载体的K 562细胞株;利用RT-PCR和流式细胞术检测HLA-A* 1101基因和蛋白的表述情况.结果表明,成功构建了以2A肽基因为连接子的HLA-A* 1101-T2A-EGFP真核表达载体;重组质粒转染的K562细胞经G418筛选2个月后,获得2株表达绿色荧光蛋白的K562稳定细胞株HLA-A* 1101 +K562和pEGFP-N3+ K562.RT-PCR检测证明,HLA-A* 1101+ K562细胞表达HLA-A* 1101基因,而pEGFP-N3+ K562细胞则不表达HLA-A*1101;流式细胞术分析显示,HLA-A* 1101和GFP蛋白双阳性HLA-A*1101+K562细胞占88.5％,明显高于pEGFP-N3+ K562细胞(0.698％).结论:建立了一个简单有效地筛选HLA-A+ 1101+ K562细胞株的方法,并成功地建立了膜稳定表达HLA-A*1101蛋白的K562细胞株,为进一步研究CML的特异性细胞免疫提供工具细胞.     

碱性成纤维细胞生长因子荧光真核表达载体构建及对过氧化氢诱导血管内皮细胞凋亡的影响

背景：已证实外源性碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）可抑制血管内皮细胞凋亡。目的：构建表达bFGF的荧光真核表达载体,探讨其对过氧化氢（H2O2）诱导的血管内皮细胞凋亡和凋亡相关蛋白的影响。方法：通过基因亚克隆构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,利用脂质体介导将bFGF基因导入人脐静脉内皮细胞内,通过荧光观察和RT-PCR检测基因的表达。实验分为3组,对照组（转染pcDNA3.1）、过氧化氢组（转染pcDNA3.1＋H2O2）和bFGF转染＋过氧化氢组（转染pcDNA3.1-bFGF-GFP＋H2O2）,流式细胞术测定细胞凋亡率,Western blot检测caspase-3 P17活性亚单位和Bax蛋白表达。结果与结论：成功构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,该载体转染人脐静脉内皮细胞后,bFGF mRNA显著增加,并可观察到绿色荧光。与对照组相比,过氧化氢组细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量都明显增加（P〈0.01）,而bFGF转染＋过氧化氢组的细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量则比过氧化氢组显著降低（P〈0.01）。证实bFGF基因转染能抑制过氧化氢诱导的血管内皮细胞凋亡,其作用机制可能与调控Bax蛋白表达和caspase-3活性有关。     

survivin基因沉默对“三阴”乳腺癌细胞株中caspase3和caspase7基因的影响

目的 探讨“三阴”乳腺癌细胞中沉默survivin基因对抑癌基因caspase3和caspase7的影响.方法 针对survivin基因设计干扰片段并与真核表达载体pGCsilencerTMU6/Neo/GFP进行连接,之后转染“三阴”乳腺癌细胞MDA-MB-231;通过RT-PCR鉴定survivin基因mRNA水平沉默效果;用RT-PCR检测沉默survivin基因对caspase3和caspase7表达及细胞凋亡的影响.结果 survivin基因沉默可引起MDA-MB-231细胞凋亡;caspase3和caspase7表达升高,灰度分析结果显示差异具有统计学意义（P =0.008）.结论 （1）RNAi技术沉默MDA-MB-231细胞中survivin基因,达到了对其表达的抑制效果;（2）survivin基因沉默可上调caspase3和caspase7的表达;（3） survivin基因沉默可引起细胞凋亡;（4） survivin基因可作为“三阴”乳腺癌基因治疗的新靶点.     

重组腺病毒ADV-TK对肝癌抑制作用的实验研究

目的观察已构建的含胸苷激酶（TK）自杀基因的重组腺病毒（ADV-TK）对肝癌细胞的体外杀伤作用和对肝癌裸鼠移植瘤的治疗效果。方法将ADV-TK体外感染人肝癌细胞株SMMC-7721,噻唑蓝（MTT）法检测受感染的SMMC-7721细胞被不同浓度更昔洛韦（GCV）作用后的细胞存活率情况。构建肝癌SMMC-7721裸鼠移植瘤模型,观察肿瘤注射重组腺病毒ADV-TK结合GCV治疗移植瘤的变化。结果相同滴度的重组腺病毒与不同浓度的GCV作用于肝癌细胞株SMMC-7721后,MTT法检测到细胞的存活率随着GCV浓度的增加而不断降低。动物实验中ADV-TK治疗组肿瘤体积明显小于对照组（ADV-null及NS）（P〈0.01）。结论重组腺病毒ADV-TK对肝癌SMMC-7721细胞的体外增殖和裸鼠体内的移植瘤生长均有明显的抑制作用。     

人EGFL7基因真核表达载体构建及鉴定

【目的】构建人类表皮生长因子域7（EGFL7）基因的真核表达载体。【方法】通过聚合酶链式反应（PCR）方法扩增EGFL7目的片段,利用基因重组技术构建pEGFPC1-EGFL7真核表达载体,并进行酶切和测序鉴定。鉴定正确的克隆瞬时转染293T细胞,通过Westernblot方法检测目的蛋白的表达。【结果】通过酶切和测序鉴定,pEGFBC1-EGFL7真核表达载体序列正确,编码框正确。转染后的293T细胞经Westernblot检测,能够表达目的蛋白。【结论】本方法成功构建了EGFL7真核过表达载体,为进一步研究其功能奠定了基础。     

CD133和CD34在肝细胞癌血管生成拟态形成中的表达及意义◆

背景:在恶性肿瘤中血管生成拟态的形成过程与肿瘤干细胞有密切联系。目的:分析肝癌干细胞标志物CD133和CD34在肝细胞癌血管生成拟态形成中的表达及意义。方法:建立肝癌细胞HCC97H、SMMC7721和正常肝细胞L02三维培养体系,结合激光捕获显微切割技术分离形成血管生成拟态的肝癌细胞,分别利用RT-PCR和Western blot技术检测CD133和CD34表达水平。结果与结论:三维培养条件下,肝癌细胞HCC97H细胞形成血管生成拟态,肝癌细胞SMMC7721以及正常肝细胞L02未形成血管生成拟态。形成血管生成拟态的肝癌细胞HCC97H中CD133、CD34在mRNA及蛋白表达水平上均高于未形成血管生成拟态的肝癌细胞SMMC7721和正常肝细胞L02(P<0.05)。表明高侵袭性肝癌细胞在三维培养下形成血管生成拟态,而低侵袭性肝癌细胞及正常肝细胞不能形成血管生成拟态;肝癌细胞形成血管生成拟态的过程中与表达肝癌干细胞有关。