基于钙激活氯离子通道检测胞质内第二信使Ca2+

目的 建立一种基于钙激活氯离子通道(CaCC)可敏感检测胞质内第二信使Ca2+的细胞模型.方法 构建氯离子通道蛋白1(ANO1)和YFP-H148Q/I152 L真核表达载体,应用脂质体转染法构建共表达ANO1和YFP-H148Q/I152 L的FRT细胞,倒置荧光显微镜观察其表达情况,流式细胞仪检测细胞纯度;应用膜片...     

小鼠气道杯状细胞钙激活氯离子通道胞外段基因的克隆及表达

目的 :克隆并表达小鼠气道杯状细胞的特定钙激活Cl 通道(mCLCA3)。方法 :根据GenBank(No.NM 0 174 74 )的信息 ,设计针对mCLCA3的 3个胞外段基因的引物。以重组质粒pcD NA3.1(- ) /mCLCA3为模板 ,PCR法扩增 3个胞外段的基因。将N端和C端胞外段基因分别亚克隆到原核表达载体pRSET A中 ,中间胞外段基因则亚克隆入原核表达载体pGEX T1中。分别转化大肠杆菌BL2 1(DE3)感受态细胞 ,使用IPTG诱导表达。结果 :酶切鉴定和序列分析表明 ,克隆的mCLCA3的 3个胞外段基因序列与GenBank中登录的完全一致。将这些基因亚克隆到相应表达载体 ,经IPTG诱导在大肠杆菌中获得表达 ,并且表达产物主要以包涵体的形式存在。结论 :获得了mCLCA3抗原分子胞外段基因及其原核表达产物 ,对进一步制备单克隆抗体 ,探讨mCLCA3的通道调控机制具有重要意义。     

基于CaCC的P2ry2调节剂细胞筛选模型的建立及应用

目的:构建基于钙激活氯离子通道(CaCC)的高通量P2Y₂嘌呤受体(P2ry2)调节剂细胞筛选模型。方法:采用RT-PCR方法验证Fischer大鼠甲状腺滤泡上皮细胞(FRT细胞)中P2ry2的mRNA表达水平,切胶回收PCR扩增产物并进行序列测序和比对,进一步应用Western blot检测FRT细胞的P2ry2蛋白表达水平。构建钙激活氯离子通道ANO1和对卤族元素敏感的黄色荧光蛋白双突变体YFP-H148Q/I152L真核表达载体,应用脂质体转染、抗生素筛选和有限稀释,获取共表达ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞。采用倒置荧光显微镜观察共表达ANO1和YFP-H148Q/I152L细胞的情况,并应用荧光淬灭动力学实验验证模型的有效性;荧光淬灭动力学实验验证细胞模型是否可筛选P2ry2调节剂,并应用Fura-2/AM荧光探针法检测细胞内游离钙的变化,探究胞内Ca²⁺浓度与P2ry2调节剂的剂量依赖关系;用Z′因子评价本模型的稳定性和可重复性。结果:FRT细胞内源性表达P2ry2;倒置荧光显微镜中观察到ANO1在细胞膜上表达...     

钙激活氯通道ANO1在小鼠心肌细胞的表达及其功能鉴定

目的:探讨钙激活氯通道蛋白anoctamin 1(ANO1)在小鼠原代培养心肌细胞中的表达及其功能特性。方法:采用胰酶与胶原酶共同消化,联合2次差速贴壁法获得C57BL/6小鼠原代心肌细胞;并用免疫荧光染色法检测α-横纹肌肌动蛋白,以鉴定心肌细胞纯度;应用RT-PCR检测小鼠心肌细胞ANO1 mRNA的表达;免疫印迹检测ANO1蛋白在小鼠心肌细胞的表达情况;应用荧光淬灭动力学实验检测ANO1钙激活氯通道的功能特性。结果:RT-PCR结果表明原代培养的小鼠心肌细胞表达ANO1 mRNA。免疫印迹实验结果显示原代培养的小鼠心肌细胞表达ANO1蛋白。荧光淬灭动力学实验证实表达于小鼠心肌细胞的ANO1具有钙激活氯通道典型的阴离子转运功能特性。结论:ANO1在小鼠心肌细胞中有明确表达,并具有钙激活氯离子通道特性,提示ANO1是钙激活氯通道的分子基础。     

钙激活性氯离子通道与高肺血流性肺动脉高压

Pulmonary hypertension induced by high pulmonary blood flow involves a variety of complex mechanisms, including endothelial damage, pulmonary artery smooth muscle relaxation-contraction disorder and vascular remodeling. Besides, the factor of ion channels in pulmonary artery smooth muscle cells is also highly correlated to vasoconstriction. In recent years, many studies have shown that activation of Ca²⁺-activated Cl^- channels is responsible for the membrane depolarization of pulmonary artery smooth muscle cells, and plays an important role in the regulation of vascular tone and vasoconstriction. This article reviews the biophysical and pharmacological characteristics of Ca²⁺-activated Cl^- channels as well as the influence of Ca²⁺-activated Cl^- channels in high pulmonary blood flow-induced pulmonary hypertension.     

血管内皮细胞钙激活钾通道

自1980年Eurchgott和Zawadzki报道兔主动脉内皮依赖性舒张以来^[1],内皮细胞已被认为不仅是一层衬贴于血管壁内面的屏障,而是具有多种生理功能的组织甚至器官。它可分泌释放多种生物活性物质调节血管张力和平滑肌生长,参与凝血及抗血栓形成,影响血管通透性和物质交换^[2]。尤其是内皮细胞产生的一氧化氮（NO）,其多方面的生理功能引进人们高度重视。因为它“在心血管系统可作为信息分子从而给予生物学信息系统一个崭新的原理”而成为1998年诺贝尔医学和生理学浆的内容^[3]。正是由于这些发现,对于内皮细胞功能的研究越来越令人瞩目。内皮细胞众多生物功能的发挥依赖于胞内钙浓度的升高。钙库释放和外钙内流是胞内钙浓度升高的基础。前者引起胞内钙浓度一过性的快速提高,后者将促使外钙缓慢大量内流,形成胞内钙浓度平台,它对于内皮细胞持续产生NO尤其重要^[4]。由于促进外钙内流的电化学驱动力和外钙内流通道的关闭和开放都受控于内皮细胞静息膜电位,因而参与静息膜电位形成的钾通道在内皮细胞功能发挥中所处的地位不容忽视。     

中电导钙激活钾通道研究进展

中电导钙激活钾通道的分子生物学 1991年从果蝇slowpork位点首先克隆出大电导钙激活钾通道（BK）的编码基因,随后于1996年又从哺乳动物脑组织中分离出小电导钙激活钾通道（SK）的三个编码基因,分别命名为SK1-3.直到1997年,Ishii和他的同事们才从人胰腺组织中克隆出中电导钙激活钾通道（IK）的编码基因.     

大电导钙激活钾通道与动脉粥样硬化

动脉粥样硬化（AS）形成是一个复杂炎症反应的过程。多种致AS的危险因素,尤其是氧化型低密度脂蛋白存在,导致内皮细胞、单核巨噬细胞、血管平滑肌细胞及血小板等的大电导钙激活钾通道（BKCa）激活,后者促使细胞功能障碍,进而促进AS的形成。本文简要综述BKCa参与AS形成的研究进展。     

大电导钙激活钾通道与动脉粥样硬化

动脉粥样硬化(AS)形成是一个复杂炎症反应的过程.多种致AS的危险因素,尤其是氧化型低密度脂蛋白存在,导致内皮细胞、单核巨噬细胞、血管平滑肌细胞及血小板等的大电导钙激活钾通道(BKCa)激活,后者促使细胞功能障碍,进而促进AS的形成.本文简要综述BKCa参与AS形成的研究进展.     

钙激活氯通道与哮喘黏液过度分泌及气道炎症的关系

哮喘的一个重要特征是杯状细胞增生和黏液过度分泌,大量黏液难以清除引起小气道阻塞并导致气道高反应性,急性哮喘死亡患者尸检显示大小气道均有杯状细胞增生和黏液过度分泌,这种黏液过度分泌导致的气道阻塞是重症哮喘主要死因之一,有研究证实黏液过度分泌是第1秒用力呼气容积(FEV1)下降加速的独立危险因素[1].     

二十二碳六烯酸对大鼠肺动脉平滑肌细胞大电导钙激活性钾通道的影响

 目的： 探讨二十二碳六烯酸（DHA）对大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）大电导钙激活性钾离子通道（BKCa）的作用。方法：采用酶解法获得单个活性良好的PASMC,PASMCs的BKCa电流变化采用全细胞膜片钳技术记录,PASMCs胞浆内游离钙离子浓度(［Ca2+］i)采用激光共聚焦显微镜技术测定。结果：DHA 0.01 μmol/L对BKCa无显著激活作用;0.1、1、10 μmol/L DHA可显著激活BKCa。不同浓度的DHA（0、0.1、1、10 μmol/L）在指令电压为+60 mV时,BKCa电流密度分别为(30.5±6.5) pA/pF、(59.4±5.8) pA/pF、(87.2±4.3) pA/pF和(117.3±7.1) pA/pF (P<0.01)。急性缺氧在指令电压为+60 mV时,BKCa电流密度从(32.7±8.5) pA/pF降低至(11.9±5.8) pA/pF (P<0.01)。DHA (10 μmol/L) 能明显逆转急性缺氧对BKCa的抑制作用（P<0.01）,同时DHA触发PASMCs内［Ca2+］i的增加,最大增加速率为（71.9±4.1）%（P<0.01）。结论：DHA通过增加PASMCs［Ca2+］i激活BKCa,逆转急性缺氧对BKCa的抑制作用,具有舒张肺血管的作用。     

容积调控性氯离子通道与肿瘤

容积调控性氯通道在细胞的容积调节、增殖及凋亡等生理过程中发挥重要作用，其分子结构尚未确定。近年研究发现容积调控性氯通道与肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移、凋亡及多药耐药性等恶性生物学行为有关。随着研究深入，容积调控性氯通道将成为抗肿瘤治疗的新靶点。     

钙激活Cl-通道基因疫苗对哮喘小鼠气道高反应性的预防作用

目的：探讨hCLCA1 DNA疫苗对哮喘小鼠气道高反应性（AHR）的影响。方法： 构建重组真核表达载体pSecTag-2A/hCLCA1，将其作为DNA疫苗肌注法接种给BALB/c小鼠（每2周1次），并采用间接ELISA法检测血清抗体。卵蛋白致敏法复制接种小鼠的哮喘模型。引喘5 d后，测定小鼠气道压力峰值-时间指数（APTI）和离体气管环收缩最大张力，并计数肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸性粒细胞的数量。设接种空载体pSecTag-2A对照组、生理盐水组和正常小鼠对照组。结果： 间接ELISA法证实疫苗接种3次后，小鼠产生能结合mCLCA3胞外肽段的血清抗体，其滴度为1∶800-1∶1 000。疫苗组、空质粒组和生理盐水组的APTI、气管环收缩张力和BALF中嗜酸性粒细胞含量均明显高于正常小鼠（P<0.01）；但疫苗组的这些指标显著低于空载体组（P<0.01）。空载体组与生理盐水组结果相似。结论： 人源hCLCA1基因疫苗能诱导小鼠产生结合自身mCLCA3的交叉抗体，并因此阻断了上皮对哮喘AHR的促进作用，从而在一定程度上抑制了哮喘AHR的发生。     

丹参素对猪冠脉平滑肌细胞钙激活钾通道的作用

目的观察丹参素(DS-182)对原代培养猪冠脉平滑肌细胞钙激活钾通道(KCa)的作用,从单个钾通道水平揭示其扩冠机制。方法采用膜片钳单通道电流记录技术。结果①猪冠脉平滑肌细胞KCa的单通道电导值高,为(291.74±4.89)pS;对膜电位变化及细胞内钙离子浓度变化敏感,能被5~20 mmol/L膜内侧四乙基铵(TEA)所阻断。②在细胞贴附式膜片方式下,细胞外应用10~20μmol/L的DS-182对通道具明显的激活效应;而在内面向外式膜片方式下,细胞内应用5~30μmol/L的DS-182对通道均无明显作用。结论DS-182对通道的激活作用是非直接的,需要一系列的胞内过程。     

蛋白激酶A在慢性心房颤动患者2型小电导钙激活钾通道调控中的作用

 目的：探讨心房颤动（AF）时心房肌细胞2型小电导钙激活钾通道（SK2通道）功能的改变及蛋白激酶A（PKA）相关途径对SK2通道电流的调节。方法：从体外循环手术中获取右心耳组织,应用改良的急性酶分离法获得人心房单个心肌细胞,采用膜片钳全细胞记录模式进行SK2通道电流记录。对比窦性心律（SR）组和AF组SK2通道电流密度及其在混合电流中所占比例的变化。观察PKA特异性抑制剂H-89对SK2通道电流的作用。采用BCA法和ELISA法检测心房组织总蛋白和PKA的含量。结果：（1）SR组和AF组的SK2通道电流均呈现内向整流特性。AF组SK2通道电流密度明显增高,且在混合电流中所占比例增加。在-130 mV钳制电压下,SR组和AF组SK2通道电流密度分别为(-2.61±0.14) pA/pF和(-6.21±0.59) pA/pF,在混合电流中所占比例分别为(20.01±1.44)%和(42.87±1.79)%,差异均有统计学意义（P<0.05）。（2）H-89能够降低SR组和AF组SK2通道电流密度,且对AF组SK2通道电流密度的抑制更明显。在-130 mV钳制电压下,H-89对SR组和AF组SK2通道电流密度的抑制率分别为(39.27±4.08)%和(76.32±2.94)%;SK2通道电流在混合电流中比例亦下降,抑制率分别为(37.48±4.77)%和(56.40±3.66)%,差异均有统计学意义（P<0.05）。（3）AF使PKA含量下降。SR组和AF组PKA含量分别为(511.91±7.22) ng/L和(444.09±7.88) ng/L,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：AF患者心房肌细胞SK2通道电流密度及其在混合电流中比例升高,是AF发生和维持的基础之一,电流改变参与了心房电重构过程。PKA能够通过一定途径调节SK2通道功能,且对AF心房肌细胞SK2通道的调节更为显著。     

Analysis of the time course of calcium-activated chloride “tail” currents in rabbit portal vein smooth muscle cells

 The time course of calcium-activated chloride ”tail” currents (I _tail) in single cells of the rabbit portal vein was studied. These currents were activated by the influx of calcium through voltage-dependent calcium channels (VDCCs). At –50 mV, I _tail decayed exponentially with a time constant (τ) of 80–100 ms that was independent of amplitude and was similar to the τof the decay of spontaneous transient inward currents (STICs; calcium-activated chloride currents). The decays of the STIC and I _tail had a similar voltage dependence between –50 and –110 mV and were similarly affected by the chloride channel blocker, niflumic acid. However, at more positive potentials (–20 to +40 mV), I _tail was sustained for the duration of the test pulse in most cells, in contrast to STICs which decayed exponentially. At very positive potentials (e.g. +100 mV), when little calcium enters the cell through VDCCs, I _tail decayed exponentially. Measurement of calcium current (I _Ca) at various potentials showed that the VDCCs did not inactivate fully at potentials between –20 and +30 mV. We propose that at negative potentials the decay of I _tail is determined by slow gating of the chloride channel, but at positive potentials a sustained I _tail is produced by persistent influx of calcium through non-inactivating VDCCs. Received: 19 March 1996 / Received after revision: 22 May 1996 / Accepted: 23 May 1996     

电压门控氯通道生物学功能与疾病的关系

电压门控氯通道是表达于细胞膜或细胞器质膜上的一类阴离子跨膜通道蛋白,具有调节细胞容积、参与细胞迁移、增殖与凋亡以及氧化应激等生物学功能,本综述总结近年来该通道生物学功能及其与疾病的相关研究进展。