新型降钙素的制备及活性测定

新型降钙素（一种人降钙素类似物）基因工程菌ｎＣＴ／ｐＧＥＸ－２Ｔ／Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１经２０Ｌ规模发醇,离心收集细胞,反复冻融裂解细胞,裂解液经Ｇ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－４Ｂ亲和层析纯化得到融合蛋白。融合蛋白进行磺酸化和溴化氰裂解后,用Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ纯化得到新型降钙素前体,其纯度为９７．６％。选用羧肽酶Ｙ（ＣＰＹ）将其前体转化为Ｃ－末端酰胺化的新型降钙素,转化率为３４％。转化液经ＨＰＬＣ分离     

人胰岛素样生长因子Ⅰ基因的半合成及其克隆表达

目的 将人胰岛素样样生长因子Ⅰ（ＩＧＦ－Ⅰ）基因克隆到ｐＥＴ１１Ｃ中，构建成ｐＥＴＩＧＦ－Ⅰ表达载体，完成人ＩＧＦ－Ⅰ基因大在大肠杆菌中的表达。方法 利用固相亚磷酸三酯法化学合成人ＩＧＦ－Ⅰ基因的２条寡核苷酸片段，通过互补配对和Ｋｌｅｎｏｗ酶促补平成完整的ＩＧＦ－Ⅰ双链ＤＮＡ片段，然后经酶切克隆于ｐＴＶ１１８Ｎ载体中，构建ｐＴＶＩＧＦ－Ⅰ克隆载体并测定ＤＮＡ序列后，构建ｐＥＴＩＧＦ－Ⅰ表达载体。结     

丙肝病毒非结构4区和5区抗原的克隆表达及纯化鉴定

通过分析丙肝病毒（ＨＣＶ）的非结构４区（ＮＳ４）和５区（ＮＳ５）蛋白的氨基酸序列，推测确定抗原决定簇位点。用ＲＴ－ＰＣＲ技术从中国丙肝病人血甭中扩增克隆含抗原决定簇基因的ＮＳ４及ＮＳ５基因，将该丙段基因分别克隆至质粒表达载体ｐＥＴ２８ａ（＋）内，转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），成功了高儿表达ＮＳ４和ＮＳ５蛋白的工程菌，ＩＰＴＧ诱导后两蛋白在工程菌内的表达量分别约占菌体蛋白的３３％和２８％。经Ｓｅｐ     

Cecropin B抗菌肽基因的定向诱变与表达

采用寡核苷酸介导的定向的定向点突变法,对天蚕抗菌肽Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｂ基因１３位甲硫氨酸（Ｍｅｔ）旅为为亮氨酸（Ｌｅｕ）或缬氨酸（Ｖａｌ）,保留１位上的Ｍｅｔ,衣变后的Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｂ ＤＮＡ序列分析证明产生了预斯的估变。将Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｂ突变体基因与ｐＧＥＸ－４Ｔ－２融合表达载体中的谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）基因融合,在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达,当ＩＰＴＧ诱导３０ｍｉｎ后,工程菌的数量开始减少,     

人EPO cDNA基因在CHO细胞中的稳定表达

建立稳定表达人红细胞生成素（ＥＰＯ）的工程细胞株。方法：用 ＤＮＡ磷酸钙共转染法,将人ＥＰＯ ｃＤＮＡ的表达质粒 ｐＣＤＢ与标志质粒 ｐＳＶ－ｄｈｆｒ共转染到 ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞中。用 ＥＬＩＳＡ法检测到 ７０个克隆的细胞培养上清,筛选出５０个克隆细胞系。结果：经ＭＴＸ加压扩增,获得４系高效表达ＥＰＯ的细胞系（Ｂ４、Ｃ３、Ｆ１０、Ｇ７）,表达量为 ２． ２～１０ μｇ／（１０６ ｃｅｌｌ· ２４ ｈ）,ＥＰＯ的分泌量在上述细胞系扩增了 １１～３１倍。 Ｆ１０细胞系表达量为最高,并进一步亚克隆纯化。其中Ｆ１０－６亚克隆细胞株的平均表达水平为１０ ｕｇ／（１０６ｃｅｌｌ·２４ ｈ）,细胞冻存后复苏传代１５次,ＥＰＯ的表达水平无明显改变。结论：以Ｆ１０－６亚克隆细胞株建立了工程细胞株。     

人胰岛素样生长因子I基因的半合成及其克隆表达

将人胰岛素样生长因子 Ⅰ（ＩＧＦ－ Ｉ）基因克隆到 ｐＥＴ１１Ｃ中,构建成 ｐＥＴＩＧＦ－ Ｉ表达载体,完成人ＩＧＦ－Ｉ基因在大肠杆菌中的高表达。方法：利用固相亚磷酸三酯法化学合成人ＩＧＦ－Ｉ基因的２条寡核苷酸片段,通过互补配对和Ｋｌｅｎｏｗ酶促补平成完整的ＩＧＦ－Ｉ双链ＤＮＡ片段,然后经酶切克隆于ｐＴＶ１１８Ｎ载体中,构建ｐＴＶＩＧＦ－Ｉ克隆载体并测定ＤＮＡ序列后,构建ＰＥＴＩＧＦ－Ｉ表达载体。结果：合成的人ＩＧＦ－Ｉ基因经测序证明与设计的一致,人 ＩＧＦ－ Ｉ基因在大肠杆菌中表达量高于 １０％。结论：选用大肠杆菌偏性密码子,小分子的人 ＩＧＦ－ Ｉ在大肠杆菌中可实现高表达     

人α2b型干扰素的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达提高

应用ＰＣＲ的方法，从人的染色体片段制备人α２ｂ干扰素的ｃＤＮＡ，将其克隆到ｐＲＣ２３表达载体上，构建成重组表达质粒ｐＭＺＩ２Ａ和ｐＭＺＩ２Ｂ，并转化大肠杆菌ＤＨ５α组建成工程菌。ｐＭＺＩ２Ａ和ｐＭＺＩ２Ｂ的区别在于后者的α２ｂ基因５＇－卢始密码ＡＴＧ上游编制了一段ＳＤ顺序，与ｐＬ启动子上连接的ＳＤ顺序组成双ＳＤ顺序。表达重组质粒中由于不含ｃＩｔＳ基因，所以采取３７℃连续培养后比较两者的抗病毒活性，     

梭曼单链抗体的基因克隆和表达

成功地扩增了有机磷毒剂梭曼类似物１－羟基－１－对胺基苯基甲膦酸单频哪基醇酯与血蓝蛋白结合物免疫小鼠脾细胞中抗体重链和轻链基因片段，构建了单链抗体可变区基因（ＶＨ－ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬＤＮＡ），并将该基因克隆到噬菌体表达载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ的外壳蛋白ｇ３ｐ基因中，使单链抗体以融合蛋白的形式在Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１中表达在噬菌体表面，构成噬菌体抗体库．通过免疫亲和淘洗和竞争抑制酶联免疫吸附测定法筛选，得到１２株克隆，其分泌的单链抗体与梭曼有结合活性．     

大肠杆菌分泌型载体表达重组人碱性成纤维细胞生长因子

设计构建了带有大肠杆菌外膜蛋白信号肽序列的重组分泌型表达载体ｐＳＥ－ｈｂＦＧＦ，在大肠杆菌ＤＨ５α中分泌表达了重组人碱性成纤维细胞生长因子。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫印迹及生物活性测定均表明表达产物分泌到细胞细菌周质和培养式中。分泌到周质中的ｒｈｂＦＧＦ可占周质总蛋白的１５％。     

VES对人胃癌细胞中细胞周期调控因子蛋白表达的影响

本研究采用免疫细胞化学方法检测了维生素Ｅ琥珀酸酯（ＶＥＳ）处理人胃癌（ＳＧＣ－７９０１）细胞４８小时后某些细胞周期调控因子及细胞凋亡调控基因的蛋白表达。结果表明ＶＥＳ能明显抑制ＳＧＣ－７９０１细胞的ｐ１６、ｐ５３、ｐ２１和ＰＣＮＡ的蛋白表达并均有明显的剂量－效应关系。以ｐ１６的降低作用最为明显，依次顺序为ｐ２１、ｐ５３和ＰＣＮＡ。与此相反，在ＶＥＳ处理后ｃ－ｆｏｓ蛋白表达被明显诱导。上述结果提示在离体试验条件下ＶＥＳ具有潜在的抗癌作用。