用合成多肽制备抗胰蛋白酶原激活肽单克隆抗体的研究

目的建立以合成的小分子肽胰蛋白酶原激活肽制备单克隆抗体(mAb)的技术路线.方法以合成多肽TAP与载体KLH交联的偶联物为免疫原,免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术建立能稳定分泌抗TAP mAb的杂交瘤细胞株.结果共获得10株能稳定分泌TAP mAb的杂交瘤细胞株,经稳定性试验,对其分泌的mAb进行效价测定、中和抑制试验、特异性鉴定,均表明所制备的杂交瘤细胞株稳定性好,其所分泌的mAb效价高、特异性好.结论利用合成多肽TAP成功制备了抗TAP单克隆抗体.     

抗胰蛋白酶原激活肽单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备抗胰蛋白酶原激活肽（TAP）单克隆抗体（TAP McAb），并进行初步鉴定。方法 将人工合成的TAP与血蓝蛋白（KLH）交联作为免疫原，免疫Balb／c小鼠，经细胞融合，有限稀释法筛选出能稳定分泌TAP McAb的杂交瘤细胞株，并对单克隆抗体进行鉴定。结果 细胞融合率85．03％，经4次克隆化后获得10株能稳定分泌TAP McAb的杂交瘤细胞株，经免疫球蛋白亚类鉴定，除1株为IgG1外，其余9株均为IgM类；染色体数目为92～101条；酶联免疫吸附测定（ELISA）检测杂交瘤细胞培养上清效价为1：20～1：160，腹水效价为1：3200～1：25600；特异性试验表明，抗TAP单克隆抗体与牛血清白蛋白（BSA）、人白蛋白、胰蛋白酶、淀粉酶均无交叉反应；中和抑制试验表明，培养上清及腹水中的抗体能明显被合成多肽TAP及为急性胰腺炎患者尿液所中和；对其中5株细胞株进行相对亲和力分析结果表明，2C3〉8C6〉6H7〉6F7〉8810。结论 成功制备了抗TAP单克隆抗体，为建立敏感、特异的TAP免疫检测方法奠定了基础。     

抗胰蛋白酶原激活肽单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗胰蛋白酶原激活肽(TAP)单克隆抗体(TAPMcAb),并进行初步鉴定。方法将人工合成的TAP与血蓝蛋白(KLH)交联作为免疫原,免疫Balb/c小鼠,经细胞融合,有限稀释法筛选出能稳定分泌TAPMcAb的杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体进行鉴定。结果细胞融合率85.03%,经4次克隆化后获得10株能稳定分泌TAPMcAb的杂交瘤细胞株,经免疫球蛋白亚类鉴定,除1株为IgG1外,其余9株均为IgM类;染色体数目为92~101条;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测杂交瘤细胞培养上清效价为1∶20~1∶160,腹水效价为1∶3200~1∶25600;特异性试验表明,抗TAP单克隆抗体与牛血清白蛋白(BSA)、人白蛋白、胰蛋白酶、淀粉酶均无交叉反应;中和抑制试验表明,培养上清及腹水中的抗体能明显被合成多肽TAP及为急性胰腺炎患者尿液所中和;对其中5株细胞株进行相对亲和力分析结果表明,2C3>8C6>6H7>6F7>8B10。结论成功制备了抗TAP单克隆抗体,为建立敏感、特异的TAP免疫检测方法奠定了基础。     

抗人脑钠肽单克隆抗体的制备及其鉴定

目的：制备抗人脑钠肽单克隆抗体并对其进行初步鉴定。 方法：实验于2004-12／2006-02在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所进行。利用碳化二亚胺法将合成的人脑钠肽与牛血清白蛋白偶联制备完全抗原，反复免疫Balb／c小鼠，应用杂交瘤技术将免疫小鼠的脾细胞与Balb／c小鼠骨髓瘤细胞（SP2／0）在PEG下融合，HAT选择性培养，间接酶联免疫吸附方法对细胞培养上清检测、筛选，选择筛选结果脑钠肽抗体阳性的细胞株连续进行3次亚克隆，建立稳定分泌脑钠肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株。扩大培养阳性单克隆细胞株后，腹腔注射小鼠，制备腹水。对腹水亲和层析纯化，所得的单克隆抗体行初步鉴定。 结果：免疫小鼠血清呈脑钠肽抗体阳性，经筛选得到3株稳定分泌脑钠肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株，纯化的单克隆抗体经鉴定为IgG型，蛋白质印迹分析证实单克隆抗体可特异识别脑钠肽，具备较高的特异性及敏感性。 结论：成功制备了3株抗脑钠肽特异性的单克隆抗体，可用于脑钠肽免疫检测方法的建立。     

抗人脑钠肽单克隆抗体的制备及其鉴定

目的:制备抗人脑钠肽单克隆抗体并对其进行初步鉴定。方法:实验于2004-12/2006-02在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所进行。利用碳化二亚胺法将合成的人脑钠肽与牛血清白蛋白偶联制备完全抗原,反复免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术将免疫小鼠的脾细胞与Balb/c小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)在PEG下融合,HAT选择性培养,间接酶联免疫吸附方法对细胞培养上清检测、筛选,选择筛选结果脑钠肽抗体阳性的细胞株连续进行3次亚克隆,建立稳定分泌脑钠肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株。扩大培养阳性单克隆细胞株后,腹腔注射小鼠,制备腹水。对腹水亲和层析纯化,所得的单克隆抗体行初步鉴定。结果:免疫小鼠血清呈脑钠肽抗体阳性,经筛选得到3株稳定分泌脑钠肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株,纯化的单克隆抗体经鉴定为IgG型,蛋白质印迹分析证实单克隆抗体可特异识别脑钠肽,具备较高的特异性及敏感性。结论:成功制备了3株抗脑钠肽特异性的单克隆抗体,可用于脑钠肽免疫检测方法的建立。     

人Survivin蛋白的纯化、单克隆抗体的制备及在肿瘤细胞的表达

目的表达人Survivin重组蛋白、制备单克隆抗体及检测Survivin在多种肿瘤细胞中的表达。方法诱导含有pMS-Survivin重组质粒的E.coli.表达人MS2-Survivin重组蛋白,并作为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,经ELISA双筛,获得稳定分泌抗人Survivin mAb的杂交瘤细胞株。ELISA检测Survivin mAb的特异性。免疫细胞化学检测多种肿瘤细胞中天然Survivin的表达情况。结果诱导菌在相对分子质量为30KD左右表达出一新的蛋白条带。筛选出2株稳定分泌特异性抗人Survivin mAb的杂交瘤细胞株,亚类鉴定均为IgG1类。两株单克隆抗体的效价均达到6.4×105。ELISA结果显示出抗人Survivin mAb的特异性。在胃癌细胞、肺癌细胞、宫颈癌细胞中均强表达,且主要在细胞浆中。结论成功制备出特异性抗人Survivin mAb,为以后应用于临床检测奠定了基础,也为其进一步开发成诊断性试剂盒奠定了基础。     

PNAS-2蛋白单克隆抗体的制备和初步鉴定

本研究制备凋亡相关蛋白PNAS-2的单克隆抗体,并对其进行初步鉴定,为PNAS-2蛋白功能研究提供必需工具。以PNAS-2的合成肽为免疫原,通过动物免疫、细胞融合、克隆化制备抗PNAS-2蛋白的单克隆抗体,并用Western blot、免疫荧光、ELISA实验对单克隆抗体的特异性、效价、亚型进行了检测。结果表明：获得了稳定的分泌型杂交瘤细胞株S-31-7,属IgG1λ亚型,腹水效价为1：8000;Western blot测得分子量为28kD的单条特异性条带;免疫荧光实验显示胞浆中有阳性反应。结论：制备的单克隆抗体特异性好、效价高,能够作为深入研究PNAS-2蛋白功能的有利工具。     

抗HCCR单克隆抗体的制备及其鉴定

目的制备抗人宫颈癌癌基因（HCCR）单克隆抗体（mAb）,并进行鉴定。方法以HCCR重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,常规筛选杂交瘤细胞。腹水诱导法制备抗人HCCR单克隆抗体,并经蛋白A亲合层析进行纯化。用Western blot和免疫荧光等方法检测HCCR mAb的特异性。用纯化HCCR蛋白进行包被,建立间接ELISA方法,检测系列稀释的HCCR mAb,确定其灵敏度。结果筛选出2株分泌抗人HCCR mAb的杂交瘤细胞株。Western blot结果表明抗人HCCR抗体能与HCCR蛋白特异性结合,免疫荧光结果显示肝癌HepG2细胞中胞浆和胞膜均呈阳性染色。间接ELISA方法检测HCCR mAb的灵敏度可达到1μg/L。结论成功制备并鉴定了特异性抗人HCCR mAb的杂交瘤细胞株,为进一步深入研究HCCR的生物学特征和临床应用打下基础。     

抗人心肌肌钙蛋白T杂交瘤细胞系的建立及初步鉴定

[目的]建立稳定分泌抗人心肌肌钙蛋白T(cardic troponin,cTnT)单克隆抗体的杂交瘤细胞株.[方法]以纯化的cTnT(分子质量为3.7×107)加福氏佐剂免疫8周龄雌性Balb/c小鼠,取免疫脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0融合,以酶联免疫吸附法(ELISA)筛选.阳性克隆以有限稀释法进行克隆化、Western blot法鉴定所制备的单克隆抗体.[结果]共筛出4株稳定分泌抗cTnT单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的抗体效价高达10-5,经免疫学鉴定其分泌的免疫球蛋白类型均为IgG1、κ型,且Western b1ot鉴定4株细胞株所分泌的抗体均与人cTnT均有很好的反应性.[结论]获得4株稳定分泌抗人cTnT单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为cTnT的临床研究提供了可能性.     

人肝癌组织中DSA强结合的γ-谷氨酰基转移酶单克隆抗体的制备

目的制备与欧蔓陀罗凝集素(DSA)强结合的γ-谷氨酰基转移酶(γGT)的单克隆抗体(mAb),并对抗体进行鉴定。方法以纯化的人肝癌组织DSA强结合的γGT为抗原,免疫Balb/c小鼠,取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤(SP2/0)细胞融合,经ELISA筛选和有限稀释法获得稳定分泌mAb的细胞株。结果获得5株分泌抗DSA强结合γGT的mAb细胞株,其中3株分泌的mAb具有较高的特异性;ELISA法测定小鼠腹水mAb的效价≥625000;亚类鉴定mAb为小鼠IgG1。结论成功制备了抗DSA强结合γGT的单克隆抗体,为进一步建立免疫学检测方法奠定了基础。     

抗尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2单克隆抗体的制备与鉴定

本研究制备抗人尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2（UDP-glucose pyrophosphorylase2）的单克隆抗体（mAb）并进行初步鉴定。将正常成人肝组织匀浆离心并分离肝脏胞浆总蛋白,用肝脏胞浆总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,通过间接ELISA法、Western blot及免疫组织化学的方法对单克隆抗体进行特性鉴定,通过Uni-ZAP XR肝脏cDNA表达文库筛选鉴定抗体特异性。结果表明：通过间接ELISA筛选获得1株可稳定分泌抗人UGP2mAb的杂交瘤细胞系BAD062,其分泌的单克隆抗体的Ig亚类（型）为IgG2b（κ）,Western blot结果显示该抗体可以特异地识别分子量为56kD的蛋白;应用单克隆抗体BAD062对人肝脏cDNA表达文库（Uni-ZAPXR）进行筛选,阳性噬菌斑测序结果显示2个阳性克隆插入序列均为UGP2。结论：单克隆抗体BAD062特异地识别抗原UGP2,该抗体可用于ELISA检测、Western blot、免疫组织化学实验,为UGP2的研究提供了有力的工具。     

抗人红细胞血型糖蛋白A非多态性表位单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备抗人红细胞血型糖蛋白A(Glycophorin A,GPA)非多态性表位单克隆抗体并鉴定其特性。方法用小鼠B淋巴细胞杂交瘤技术获得分泌单抗-GPA非多态性表位的杂交瘤细胞株;鉴定抗体特异性和亚型;通过和各种酶处理细胞的反应确定单抗结合抗原位点的特性。结果得到的2株抗-GPA非多态性表位的单克隆细胞株Q6D7和Q7C9,均属IgG1亚类、Kappa型轻链,所针对的抗原位点均抗胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶处理,对无花果酶、木瓜酶、唾液酸酶敏感。结论制备获得2株抗-GPA非多态性表位单克隆抗体。     

侵袭性曲霉感染特异性抗体的筛选及其初步临床应用研究

目的 筛选出可用于侵袭性曲霉感染实验室早期诊断的特异性单克隆抗体.方法 应用单克隆抗体技术制备针对不同曲霉抗原的特异性抗曲霉单克隆抗体,根据单抗识别表位不同,初步筛选出两组灵敏度高、特异性强的单抗组合,并分别建立了双抗体夹心ELISA检测法.通过检测常见临床和环境分离曲霉株、马尔尼菲青霉及念珠菌培养液,感染动物模型标本,临床标本,初步评估检测方法的敏感性和特异性.并应用WB对抗体所识别靶标进行初步鉴定.结果 获得32株稳定分泌曲霉单抗的杂交瘤细胞株,建立了2种双抗体夹心ELISA法,第1种方法可识别环境和临床分离的19种曲霉.第2种方法仅特异性识别临床和环境分离的烟曲霉,与其他曲霉抗原无交叉.对同一种烟曲霉培养液而言,第1种方法可检测稀释度为第2种方法的10倍.WB分析显示该组单抗识别的靶标为相对分子质量在25 000～75 000之间的甘露聚糖蛋白.结论 本研究获得了可用于侵袭性曲霉感染实验室诊断的特异性单克隆抗体,单抗识别的抗原为相对分子质量在25 000～75 000之间的甘露聚糖蛋白.该抗原是侵袭性曲霉感染早期诊断的潜在标志物.     

TAP, a novel T cell-activating protein involved in the stimulation of MHC-restricted T lymphocytes

Five mAbs have been generated and used to characterize TAP (T cell activating protein) a novel, functional murine T cell membrane antigen. The TAP molecule is a 12-kD protein that is synthesized by T cells. By antibody crossblocking, it appears to be closely associated with a 16-kD protein on the T cell membrane also identified with a novel mAb. These molecules are clearly distinct from the major well-characterized murine T cell antigens previously described. Antibody binding to TAP can result in the activation of MHC-restricted, antigen-specific inducer T cell hybridomas that is equivalent in magnitude to maximal antigen or lectin stimulation. This is a direct effect of soluble antibody and does not require accessory cells or other factors. The activating anti-TAP mAbs are also mitogenic for normal heterogeneous T lymphocytes in the presence of accessory cells or IL-1. In addition, these antibodies are observed to modulate specific immune stimulation. Thus, the activating anti-TAP mAbs synergise with antigen-specific stimulation of T cells, while a nonactivating anti-TAP mAb inhibits antigen driven activation. These observations suggest that the TAP molecule may participate in physiologic T cell activation. The possible relationship of TAP to known physiologic triggering structures, the T3-T cell receptor complex, is considered. TAP is expressed on 70% of peripheral T cells and therefore defines a major T cell subset, making it perhaps the first example of a murine subset-specific activating protein.     

Development of a recombinant hepatitis B immunoglobulin derived from B cells collected from healthy individuals administered with hepatitis B virus vaccines: A feasibility study

Background

In Japan, plasma with a high concentration of Hepatitis B Virus (HBV) antibodies for hepatitis B immunoglobulin (HBIG) is almost entirely imported. We aimed to produce recombinant HBIG by isolating immunoglobulin cDNAs against the HBV surface antigen (HBsAg).

Study Design and Methods

B cells expressing HBsAg antibodies were obtained from blood center personnel who had been administered HB vaccine booster and then isolated by either an Epstein–Barr virus hybridoma or an antigen-specific memory B cell sorting method. Each cDNA of the heavy and light chains of the target antibody was cloned into an IgG₁ expression vector and transfected into Expi293F cells to produce a recombinant monoclonal antibody (mAb), which was screened by ELISA and in vitro HBV neutralizing assays. The cross-reactivity of the mAbs to normal human molecules was evaluated by ELISA and immunohistochemistry.

Results

Antibody cDNAs were cloned from 11 hybridoma cell lines and 204 HBsAg-bound memory B cells. Three of the resulting recombinant mAbs showed stronger neutralizing activity in vitro than the currently used HBIG. All three bind to the conformational epitope(s) of HBsAg but not to human DNA or cells.

Discussion

We successfully isolated HBV-neutralizing monoclonal antibodies from B cells collected from healthy plasma donors boosted against the HBV. To obtain an alternative source for HBIG, HBV-neutralizing monoclonal antibodies from B cells collected from healthy plasma donors boosted against the HBV may be useful.     

稀有血型筛选用小鼠单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备血型单克隆抗体,用于筛选稀有血型。方法用人红细胞作为免疫原免疫6周龄Balb/c小鼠(雌),通过小鼠B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体,用免疫原红细胞筛选阳性克隆,用已知表型的稀有血型红细胞筛选鉴定抗体特异性。用1 L培养袋扩大培养,以硫酸铵法粗提培养上清。以商品试剂盒检测抗体的免疫球蛋白亚类。检测抗体反应性,摸索在全自动血型仪上进行抗原筛选的使用条件。结果建立了3株单克隆抗体细胞株。抗-GPA/GPB(IgG1,κ)盐水法反应,抗体效价为102 400;抗-EnaTS(IgM,κ)盐水法反应,抗体效价为204 800;抗-K14(IgG1,κ)菠萝酶法反应,抗体效价为20 480。结论利用得到的单抗可在自动血型仪上实施快速高通量抗原筛选,可用于筛选MkMk型、En(a-)、Ko及K:-14型等稀有血型。     

阻断血管性血友病因子与胶原结合的抗人vWF-A3单抗的鉴定和功能研究

目的 制备阻断血管性血友病因子(von Willebrand因子)A3区(vWF-A3)与胶原结合的抗vWF-A3单抗,并对其进行生化鉴定和功能研究.方法 用重组vWF-A3蛋白免疫BALB/c小鼠,经标准的方法制备单抗.用ELISA法鉴定单抗特异性,经vWF胶原结合抑制试验筛选获得抑制性单抗,用免疫印迹技术确定单抗与重组(r)vWF-A3和还原性人vWF识别的抗原分子.经胶原结合试验确定单抗对vWF与胶原结合的影响.结果 获得一组共30株抗vWF-A3单抗,其中两株确定为抑制vWF与胶原结合的单抗,分别命名为SZ-123和SZ-125,两株单抗分别与rvWF-A3和vWF强反应,而不与rvWF-A1、A2反应.免疫印迹分析显示SZ-123和SZ-125分别识别相对分子质量为27×103的rvWF-A3、250×103还原性人vWF单体和170×103的vWF酶切片段.单抗SZ-123和SZ-125不仅剂量依赖性地抑制纯化的人血浆vWF与人胎盘和牛皮肤Ⅲ型胶原结合,而且分别抑制人、猕猴或Beagle犬血浆vWF与人胎盘和牛皮肤Ⅲ型胶原结合.结论 抗vWF-A3单抗SZ-123和SZ-125是两株抑制性单抗,有望成为具有治疗潜力的抗血栓药物.     

Fully human therapeutic monoclonal antibodies

Monoclonal antibody (mAb) therapy has been facilitated by a number of technologic advances over the past 30 years. Whereas hybridoma development of murine mAbs was requisite for the development of mAbs as drugs, the inherent immunogenicity of rodent sequences in humans has presented obstacles to the clinical application of mAbs. Sensitization to mAb therapeutics poses significant risk to the patient and may blunt the efficacy of these therapies. The advent of chimeric antibodies lessened but did not eliminate the rodent content of mAbs; thus, immunogenicity remained a concern. Further elimination of rodent sequences enabled the production of humanized mAbs, followed by current technology using phage display and, finally, transgenic mice technology, which allows for the generation of fully human therapeutic mAbs. The reduced immunogenicity of this new generation of mAbs is expected to enhance efficacy, safety, and ease of use. In addition to providing replacements for existing mAb drugs, new technologies have greatly facilitated the optimization and modification of mAbs, opening numerous therapeutic avenues.