VSMC-Cx43-/-条件性基因敲除小鼠模型的构建及基因型鉴定

目的 应用CRISPR-Cas9技术和LoxP-Cre系统构建血管平滑肌缝隙连接蛋白Cx43条件性基因敲除小鼠(VSMC-Cx43-/-)模型.方法 采用受精卵同源重组的方式,对Gja1基因进行flox修饰.通过体外转录的方式,获得Cas9 mRNA和gRNA;通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载...     

VSMC-Cx43-/-条件性基因敲除小鼠模型的构建及基因型鉴定

目的应用CRISPR-Cas9技术和LoxP-Cre系统构建血管平滑肌缝隙连接蛋白Cx43条件性基因敲除小鼠(VSMC-Cx43^-/-)模型。方法采用受精卵同源重组的方式,对Gja1基因进行flox修饰。通过体外转录的方式,获得Cas9 mRNA和gRNA;通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载体,该载体包含3.0 kb 5’同源臂、1.9 kb的flox区域和3.0 kb 3’同源臂。将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,获得F0代小鼠。PCR扩增及测序鉴定阳性的F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得3只阳性F1代小鼠(Cx43^flox/+)。将获得的flox杂合子Cx43^flox/+小鼠自交,获得flox纯合子Cx43^flox/flox小鼠。然后用Cx43^flox/flox小鼠和Myh11-CreERT2小鼠交配,最终获得flox纯合且Cre阳性的实验组小鼠(该小鼠简写为:VSMC-Cx43^-/-)和flox纯合且Cre阴性的对照组小鼠(Cx43^flox/flox)。用PCR进行基因型鉴定,用Western blot技术检测Cx43在大脑中动脉、冠脉、肺动脉和肾动脉组织中的表达,以明确基因敲除小鼠是否构建成功。结果基因型鉴定、免疫荧光和Western blot检测结果表明VSMC-Cx43^-/-基因敲除小鼠模型构建成功,小鼠一般性状无改变,小鼠大脑中动脉、冠脉、肺动脉和肾动脉组织中Cx43蛋白表达均下降。因此,可作为长期稳定模型研究血管平滑肌Cx43的功能。结论应用CRISPR-Cas9技术和LoxP-Cre系统成功构建了VSMC-Cx43^-/-基因敲除小鼠模型,为深入研究Cx43在血管疾病中的作用提供工具。     

Pgenesil-1质粒载体介导的表达ERCClshRNA的质粒构建和鉴定

目的:设计构建Pgenesil－1质粒载体介导的表达ERCClshRNA的重组体质粒.方法:以ERCC1为靶基因,以Pgenesil－1质粒为载体,设计构建重组体,根据ERCCl基因cDNA序列,设计有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,克隆到空载体Pgenesil－1中,转化DH5a菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析.结果:经酶切鉴定筛出的重组体测序结果和目的序列相同,重组体载体构建成功.结论:成功构建了能表达ERCClshRNA的质粒载体Pgenesil－1/ERCC11和Pgenesil－1/ERCC12,为下一步研究ERCC1基因在卵巢癌细胞株顺铂耐药中的作用奠定了实验基础.     

铜绿假单胞菌外毒素A原核表达载体的构建及鉴定

[目的]对铜绿假单胞菌外毒素A (PEA)全基因进行基因克隆,构建原核表达质粒并加以鉴定.[方法]从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA,设计PCR引物扩增出带信号肽的PEA目的基因,经Hind Ⅲ和EcoRⅠ消化后,与PET-32a载体进行连接重组.[结果]PET-32a-PEA原核表达质粒构建完成后.用限制性内切酶消化、PCR及DNA测序等多种方法进行鉴定,证实其构建成功.[结论]PET-32a-PEA原核表达质粒的成功构建,为进一步研究出有效的基因工程疫苗和用于免疫导向治疗的重组毒素奠定了基础.     

HOGG1基因特异性锤头状核酶表达载体的构建及其在细胞中表达的研究

目的：设计并合成人8-羟基鸟嘌呤-DNA糖苷酶(HOGG1)特异性的锤头状核酶(hammerhead ribozyme)基因并构建其真核表达载体。初步探讨其在A549细胞中的瞬时表达效应。方法：运用计算机软件人工设计并合成核酶基因(RZ)，将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA3．1( )中，阳性重组子由BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定及DNA测序证实。大量抽提阳性重组子并在非脂质体转染试剂FuGENE 6的介导下引入人肺腺癌细胞株A549，RT—PCR(逆转录多聚酶链反应)法半定量检测转染细胞中HOGG1 mRNA表达的改变。结果：经酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA3．1( )的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，命名为pcDNA3．1( )-RZ。经RT—PCR法检测到转染核酶的靶细胞中HOGG1 mRNA表达下降36％，与空白细胞组差异有显著性。结论：成功合成HOGG1特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体。核酶在A549细胞内对靶基因HOGG1具有抑制其表达的作用。     

制备肝靶向载体半乳糖基化壳聚糖/DNA纳米颗粒转染肝癌细胞SMMC-7721的体外实验

[目的]研究半乳糖基化壳聚糖(Galactosylated chitosan,GC)与质粒DNA混合制备纳米颗粒的方法及其对肝癌细胞SMMC-7721转染效率的体外实验.[方法]水溶性GC溶液与质粒pEGFP通过磁力搅拌(1 000rpm,室温)并逐滴滴加混合制备为纳米微囊复合物;制备的GC/DNA纳米微囊体外转染肝癌细胞SMMC-7721,以脂质体转等量质粒及裸质粒DNA为对照,荧光显徽镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况,流式细胞仪测定转染效率.[结果]半乳糖基化壳聚糖与质粒DNA在一定物理作用条件下混合能够形成纳米微囊复合物;SMMC-7721实验组与对照组均有绿色荧光蛋白表达,实验组(GC/DNA纳米微囊组)转染率为(6.60±0.56)%,对照组(脂质体组)转染率为(20.62±2.27)%.[结论]GC/DNA纳米微囊能将质粒DNA转入肝癌细胞细胞内并表达,可作为基因治疗的一个载体.     

人α防御素6毕赤酵母表达载体的构建

[目的]构建人α防御素6(HD-6)酵母表达载体,为研究和解析人α防御素6的功能准备了条件。[方法]采用PCR方法,设计引物从cDNA文库中扩增出人α防御素6基因片段,将产物分离纯化后经EcoRⅠ和XbaⅠ酶切,并将其插入到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,以得到重组的酵母表达载体pPICZαA/HD-6,最后进行琼脂糖电泳和酶切鉴定。[结果]从cDNA文库中扩增出的HD-6基因片断大小正确;电泳和酶切结果均证明已将此片段克隆到酵母表达载体pPICZαA内。[结论]成功地构建了人α防御素6基因的酵母表达载体pPICZαA/HD-6。     

人防御素5基因毕赤酵母重组表达系统的构建

[目的]构建人防御素5(HD5)基因毕赤酵母表达系统,为进一步表达HD5基因提供理论依据和实验基础. [方法]构建好的毕赤酵母重组表达质粒pGAPZaA/HD5经Sac I线性化后应用LiCl法转化毕赤酵母菌株GS115感受态,Zeocin平板筛选,PCR鉴定转化子. [结果]线性化的重组质粒pGAPZαA/HD5成功转化进入毕赤酵母感受态,PCR鉴定结果与预期相符. [结论]成功构建HD5基因毕赤酵母表达系统.     

单纯疱疹病毒1型糖蛋白G表达载体的构建及鉴定

[目的]构建gG-1强抗原决定簇集中区对应基因的重组原核表达载体,并对其进行鉴定。[方法]利用DNAstar软件分析gG-1强抗原决定簇的集中区,PCR扩增相应基因片段,将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-4T-1/gG-1,并对其进行双酶切和DNA测序鉴定。[结果]成功构建了pGEX-4T-1/gG-1重组原核表达载体,且目的基因片段与GenBank中已公布序列一致性较高,阅读框架正确。[结论]pGEX-4T-1/gG-1重组原核表达载体的成功构建,为研制HSV-1型特异性基因工程诊断试剂奠定了基础。     

靶向Survivin的shRNA表达载体的构建和对宫颈癌Caski细胞Survivin表达的影响

[目的]探讨RNA干扰对Caski细胞Survivin基因表达的抑制作用. [方法]构建针对Survivin基因编码区和非编码区的两对短发夹状RNA真核表达载体,分别命名为pGenSurl、pGenSur2.以脂质体介导的转染方法将其导入宫颈癌Caski细胞株,采用荧光定量RT-PCR和western blot检测转染后24、48、72 h Survivin基因mRNA和蛋白质表达水平. [结果]成功构建Survivin基因shRNA真核表达载体pGenSur1、pGenSur2.与野生型Caski细胞、阴性对照相比,Caski/pGenSur1细胞和Caski/pGenSur2细胞中Survivin mRNA和蛋白表达随着干扰时间增加有显著性减少(P<0.01),72h到达最低值,mRNA抑制效率分别达到63.3%±1.44%和79.7%±2.12%,蛋白抑制效率达到64.2%±2.02%和79.4%±1.77%. [结论]靶向Survivin的shRNA质粒载体均可显著抑制宫颈癌Caski细胞内源Survivin的mRNA和蛋白的表达(P<0.01).     

人防御素-5基因毕赤酵母表达载体的构建及鉴定

[目的]构建人防御素5(HD-5)基因的毕赤酵母表达载体并加以鉴定。[方法]采用PCR技术从人cDNA文库中扩增HD-5基因片段,将HD-5基因扩增产物和毕赤酵母表达载体pPICZαA用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后连接构成重组质粒,然后转化到E.coliTop10中,筛选阳性克隆,并进行PCR、酶切和序列鉴定。[结果]重组质粒经酶切获得HD-5基因片段大小正确,经序列测定证实HD-5基因正确插入pPICZαA中。[结论]成功构建人防御素5基因的毕赤酵母表达载体。     

结核杆菌MTC28基因真核表达载体的构建及鉴定

[目的]对结核杆菌MTC28基因进行克隆,构建真核表达质粒并加以鉴定.[方法]采用聚合酶链反应(PCR)从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中扩增带信号肽MTC28目的基因,经NheI和EcoRI消化后,与PCDNA3.1(+)载体进行连接重组.[结果]PCDNA3.1(+)-MTC28真核表达质粒构建完成后,用限制性内切酶消化、PCR及DNA测序等多种方法进行鉴定,证实其构建成功.[结论]PCDNA3.1(+)-MTC28真核表达质粒的成功构建,为进一步研究该质粒的免疫保护效果,了解信号肽序列在MTC28蛋白表达和分泌过程中所起的作用及制备相应的结核病DNA疫苗奠定了基础.