犬不同部位BMSCs对牙周膜细胞增殖和成骨分化的影响

目的:研究犬髂骨骨髓基质细胞(iliac bone marrow stromal cells,I-BMSCs)和犬颌骨骨髓基质细胞(maxilla bone marrow stromal cells,M-BMSCs)对犬牙周膜细胞(periodontal ligament cells,PDLCs)增殖和成骨分化的影响,了解不同部位来源的骨髓基质细胞对牙周膜细胞调控作用的差异性。方法:原代培养犬髂骨骨髓基质细胞、颌骨骨髓基质细胞和牙周膜细胞。分别建立犬髂骨和颌骨来源的骨髓基质细胞与牙周膜细胞的Transwell共培养体系;制备骨髓基质细胞条件培养液培养牙周膜细胞,MTT法检测牙周膜细胞生长曲线;利用实时荧光定量PCR法检测牙周膜细胞成骨相关基因核心结合因子2(Runx2)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)的变化;Westernblot法检测牙周膜细胞Runx2和OCN蛋白的表达变化。结果:髂骨骨髓基质细胞条件培养液能促进牙周膜细胞的增殖;颌骨骨髓基质细胞条件培养液对牙周膜细胞增殖有抑制作用;QPCR检测到共培养组牙周膜细胞Runx2、OCN、ALP基因表达高于对照组,Westernblot检测到共培养组牙周膜细胞的Runx2和OCN的蛋白表达高于对照组,且颌骨骨髓基质细胞诱导牙周膜细胞成骨分化效果更显著。结论:犬颌骨骨髓基质细胞条件培养液可能会抑制牙周膜细胞的增殖,相较于髂骨骨髓基质细胞,颌骨骨髓基质细胞促进牙周膜细胞成骨分化效果更显著,颌骨骨髓基质细胞和牙周膜细胞共同作为种子细胞可能更有利于牙周组织再生。     

低氧对牙周膜成纤维细胞增殖和成骨分化的影响

目的:观察低氧对体外培养的人牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament cells, PDLCs)增殖与成骨分化的影响。方法:体外培养鉴定人牙周膜成纤维细胞,分别用浓度为0、100、200、400 μmol/L的CoCl2作用于细胞,采用MTT法观察CoCl2对PDLCs增殖的影响,运用实时定量PCR和Western免疫印迹技术检测CoCl2模拟低氧对PDLCs成骨分化的影响。采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果:免疫组化染色结果证实,培养细胞为牙周膜成纤维细胞。200 μmol/L及400 μmol/L的CoCl2均能抑制PDLCs的增殖及碱性磷酸酶、RUNX2、Ⅰ型胶原的表达,并呈剂量依赖性。结论:氯化钴模拟的低氧环境对PDLCs增殖及成骨分化具有抑制作用。     

鼠根端乳头条件培养基诱导下的牙周膜细胞膜片与牙本质管和煅烧骨间的牙周膜再生

目的 利用鼠根端乳头条件培养基(APTG-CM)与牙周膜细胞(PDLCs)建立间接共培养体系,探讨牙周组织再生的研究.方法 胶原酶联合组织块法获得人PDLCs,用波形蛋白和角蛋白鉴定PDLCs的来源.APTG-CM诱导PDLCs 28d,通过免疫细胞化学法检测PDLCs中骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原(COL Ⅰ)、骨涎蛋...     

BMP受体在大鼠骨髓间充质细胞成骨中的作用

目的:研究骨形成蛋白受体(BMP-R)在大鼠骨髓间充质细胞(BMSCs)成骨中的作用机制。方法:分离大鼠BMSCs,将原代细胞分为4组,分别应用普通培养基(CM)、成骨诱导培养基(OM)、骨形成蛋白-2(BMP-2)和OM+BMP-2诱导培养基培养。应用碱性磷酸酶(ALPase)活性和钙结节染色(Von Kossa法)检测成骨分化程度,RT-PCR检测骨形成蛋白受体(BMP-R)的表达情况。采用SPSS16.0软件包对数据进行单因素方差分析。结果:OM可诱导BMSCs成骨分化,表现出高碱性磷酸酶活性和基质矿化能力。BMP-2可提高OM诱导BMSCs成骨分化的能力;OM在早期即可诱导BMP-RⅠA和BMP-RⅡ的表达,而BMP-2诱导BMP-R较迟。结论:BMP-2可提高OM诱导BM-SCs分化成骨的能力,BMP-R在BMSCs分化成骨中起重要作用。     

炎症微环境对人牙周膜成纤维细胞增殖与成骨分化的影响

目的: 观察脂多糖模拟的炎症微环境对体外培养的人牙周膜成纤维细胞（periodontal ligament cells, PDLCs）增殖与成骨分化的影响。方法: 体外培养鉴定人牙周膜成纤维细胞,分别用浓度为0、0.1、10 μg/mL脂多糖作用于细胞,采用MTT法观察脂多糖对PDLCs增殖的影响,运用实时定量PCR和Western印迹法检测脂多糖模拟的炎症微环境对PDLCs成骨分化的影响。采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 0.1 μg/mL脂多糖促进PDLCs增殖,增强成骨标志物mRNA和蛋白的表达;10 μg/mL脂多糖可抑制PDLCs的增殖及碱性磷酸酶、RUNX2、Ⅰ型胶原、骨形态发生蛋白2的表达,其结果有统计学意义。结论: 高浓度脂多糖（10 μg/mL）模拟的炎症微环境对PDLCs增殖及成骨分化有抑制作用,低浓度脂多糖（0.1 μg/mL）对PDLCs的增殖和成骨分化有促进作用。     

人牙周韧带细胞与β-磷酸三钙多孔生物陶瓷三维培养的实验研究

目的 :通过将人牙周韧带细胞 (humanperiodontalligamentcells ,PDLCs)接种到三维多孔 β -磷酸三钙( β -tricalciumphosphate ,β -TCP)陶瓷支架材料上 ,探讨以 β -TCP为牙周组织工程支架材料的可能性。 方法 :取新鲜拔除的健康第一前磨牙牙周膜 ,用组织块培养法培养PDLCs。β -TCP多孔陶瓷加工成片状 ,作为细胞支架 ,将 4-7代PDLCs与 β -TCP进行体外三维培养 ,2周后观察细胞生长状况。 结果 :PDLCs在 β -TCP支架材料上附着、增殖并复层生长。结论 :β -TCP具有良好的生物相容性 ,有望成为牙周组织工程的支架材料     

碱性成纤维细胞生长因子和骨形成蛋白2在牙源性细胞分化中的表达及意义

目的研究人牙髓细胞(DPCs)和牙周韧带细胞(PDLCs)矿化过程中碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)和骨形成蛋白2(BMP2)的表达变化,以及FGF2和BMP2在牙髓牙周损伤修复动物模型中的分布,探讨FGF和BMP信号通路在DPCs和PDLCs向成牙本质/成骨样细胞分化及牙髓牙周组织损伤修复中的调控作用。方法酶消化法分离培养DPCs和PDLCs,取诱导前及矿化诱导14d的DPCs和PDLCs,实时荧光定量反转录聚合酶链反应检测FGF2和BMP2的表达变化并进行统计学分析。建立大鼠牙髓牙周联合损伤动物模型,HE染色观察4周后牙髓牙本质复合体及牙周组织修复情况,免疫荧光检测FGF2和BMP2在新生牙髓及牙周组织的表达和分布。结果 DPCs和PDLCs经矿化诱导,FGF2mRNA表达下调,BMP2mRNA表达上调,与对照组间差异有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光示FGF2在新生的牙周韧带组织强表达,在新生牙髓及正常牙髓牙周组织弱表达,BMP2蛋白在损伤处的新生牙髓及牙周韧带组织细胞浆强表达,FGF2和BMP2在正常牙髓及牙周韧带组织均无表达。结论 FGF2和BMP2在DPCs和PDLCs体外成牙本质/成骨分化中可能具备独立的生物学功能,在体内牙齿损伤修复过程中可能存在协同调控作用。     

预培养比格犬干细胞的牙本质片复合牙周膜细胞膜片裸鼠体内移植研究

目的：探索预培养干细胞的牙本质片复合牙周膜细胞（PDLCs）膜片对牙周组织再生的可行性。方法：将比格犬牙根制成牙本质片,其上接种骨髓基质干细胞（BMSCs）或PDLCs,应用成骨诱导液或α-MEM培养液培养,电镜观察牙本质片表面细胞附着与基质形成情况。并构建细胞／牙片／膜片／煅烧陶瓷牛骨CBB复合体,裸鼠体内皮下移植,8周后取材HE染色观察。结果：预培养干细胞的牙本质片,电镜检测到表面有足够的细胞和细胞外基质分布。裸鼠体内结果显示牙本质片接种BMSCs或PDLCs经成骨诱导组可见类牙骨质基质形成,但无类牙周膜纤维,未经成骨诱导组无类牙骨质基质形成,但有明显的类牙周膜纤维样组织形成;空白组无类牙骨质基质及类牙周膜纤维样组织形成。结论：在牙本质片上预培养BMSCs或PDLCs,复合PDLC膜片和CBB后异位移植,有利于类牙周膜纤维的形成。加入成骨诱导液诱导,有利于基质的形成。     

应用细胞-支架构建方式的组织工程方法促进牙周组织再生的实验研究

目的:观察评价细胞 -支架构建方式的组织工程方法对牙周组织再生修复的影响和意义,探讨自体牙周膜细胞(PDLCs)和纳米羟基磷灰石材料 -纳米羟晶 -胶原仿生骨材料 (nHAC)分别用作牙周组织工程种子细胞和支架材料的可行性。方法:改良组织块法体外培养动物自体PDLCs,传代扩增后接种到nHAC三维支架上,再植入动物人工牙周组织缺损,表面覆盖聚四氟乙烯 (e-PTFE)膜,以单纯翻瓣组和单纯GTR组作为对照。术后 8周进行组织学观察和测量,分析评价其牙周组织的再生情况。结果:自体PDLCs-nHAC-膜复合植入组较单纯翻瓣组和单纯GTR组有更多的新生牙槽骨、新生牙周膜和新生牙骨质生成,且未见上皮长入。结论:应用细胞-支架构建方式的牙周组织工程方法能更有效地促进牙周组织再生和重建,而自体PDLCs可作为牙周组织工程的种子细胞,nHAC可作为牙周组织工程的支架材料。     

牙囊细胞及其在牙周组织再生中的应用

牙囊细胞(DFC)来源于外胚间充质,是牙周组织的前体细胞,具有异质性和多向分化的潜能,可以成骨、成牙骨质、成软骨、成脂和成神经向分化.DFC可通过组织块法、酶消化法或两者结合的方法获得,可通过细胞形态鉴定、透射电镜观察和细胞表面特异性标志物检测鉴定,其增殖能力较强.DFC既可以作为种子细胞,复合支架材料形成类似牙周组织的相关结构,也可与其他种子细胞共培养或利用其条件培养液提供的微环境诱导其他种子细胞进行牙周组织的再生,因此在牙周组织再生方面具有广泛的应用前景.     

重组腺病毒载体Ad5-hOPG-EGFP介导hOPG基因在犬牙周韧带细胞中的表达检测

[摘要]目的：观察人骨保护素（humanosteoprotegerin,hOPG）在犬牙周韧带细胞（periodontalligamentcells,PDLCs）中的表达情况,为后期的牙周组织再生实验制备高表达目的基因hOPG的种子细胞。方法：体外构建携带hOPG基因的腺病毒载体Ad5-hOPG—EGFP,并将其转染Beagle犬PDLCs,通过流式细胞术、实时定量RT．PCR、ELISA以及WesternBlot检测目的基因的转录和表达。结果：重组腺病毒Ad5一hOPG—EGFP成功转染犬PDLCs,转染72h后转染效率达到80％以上,转染的细胞发出较强的绿色荧光;基因和蛋白水平检测表明,hOPG在犬PDLCs中得到了有效表达。结论：重组腺病毒介导的hOPG基因可以在PDLCs中有效表达。     

间接共培养诱导大鼠骨髓间充质干细胞向牙周膜成纤维样细胞分化

目的：探讨通过间接共培养诱导骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）向牙周膜成纤维细胞（Periodontal ligament fibroblasts,PDLFs）分化的可行性。方法：将大鼠BMSCs与PDLFs间接共培养,分别于不同时间段检测碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）活性以及骨钙素（Osteocalcin,OCN）、Ⅲ型胶原（Collagen typeIII,COLⅢ）mRNA表达的变化。结果：间接共培养后的BMSCs表现出类似PDLFs的性质,各检测指标与单独培养的PDLFs无统计学差异,与单独培养的BMSCs有统计学差异。结论：牙周膜成纤维细胞通过旁分泌机制可以诱导骨髓间充质干细胞向其分化。     

LIM矿化蛋白1对牙周膜细胞生物学特性的影响

目的以LIM矿化蛋白1（LIM mineralization protein 1,LMP-1）基因构建真核表达载体PET43.1a-LMP-1,转染人牙周膜细胞,观察对其生物学特性的影响。方法采用基因工程技术构建真核表达载体pET43.1a-LMP-1,脂质体法转染人牙周膜细胞,四唑盐比色法和酶联免疫吸附测定法测定真核表达载体pET43.1a-LMP-1转染对牙周膜细胞活性以及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）的影响。结果与空质粒转染组和空白对照组相比,pET43.1a-LMP-1真核表达载体转染后牙周膜细胞中LMP-1 mRNA和蛋白表达显著增强（P〈0.05）;细胞增殖明显增加;ALP表达明显增强,并随时间延长逐渐上升。结论外源性LMP-1转染进入牙周膜细胞能够促进细胞的增殖和矿化能力。     

人牙周膜细胞在矿化液作用下的增殖、成骨分化与相关基因表达

目的：分离培养人牙周膜细胞（PDLCs）,观察矿化液对PDI。Cs细胞增殖和成骨分化的影响。方法：酶解组织块后获得人PDLCs,矿化液处理后观察对细胞影响。采用MTT法检测对细胞增殖;流式细胞分析细胞周期改变;分别通过碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红染色,RT—PCR观察矿化液诱导成骨分化的效果。结果：矿化液对人PDI．Cs的增殖无显著影响,高浓度地塞米松（Dex）的矿化液有一定抑制作用。含Dex的矿化液可促进成骨分化,包括ALP活性提高,矿化结节形成,以及成骨基因的表达上调。$100A4和PLAP-1是相对特异的牙周膜标志,也参与矿化液诱导的成骨分化的调控过程。结论：含地塞米松的矿化液可有效促进人PDLCs的成骨分化,对细胞增殖影响较小。PDI,Cs是一种新型的种子细胞,可应用于骨组织工程。     

几种胚胎干细胞标志在牙周膜细胞中的表达及意义

目的检测部分胚胎干细胞标志在牙周膜细胞中的表达。方法通过酶解组织块法分离牙周膜细胞,利用多向分化实验和流式细胞术分析表面标志对获得细胞进行鉴定。利用免疫荧光法和RT-PCR法检测牙周膜细胞中Oct4、Nanog、Sox2、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81这些胚胎干细胞标志的表达。结果牙周膜细胞为成纤维细胞样,可分化为成骨细胞和成软骨细胞,可均一表达间充质细胞标志CD44、CD90、CD105,异质性表达间充质标志CD146、Stro-1。细胞免疫荧光实验显示牙周膜细胞表达部分胚胎干细胞标志:Oct4、Nanog、SSEA-4、TRA-1-60阳性,Sox2、TRA-1-81阴性。半定量RTPCR结果显示P3和P8代牙周膜细胞表达Oct4和Nanog,表达量差异不大,Sox2则为阴性。结论牙周膜细胞除了表达常用间充质干细胞标志外,也可表达部分胚胎干细胞标志,这对牙周膜细胞的鉴定和进一步分选纯化有一定应用价值。     

松质骨基质作为细胞载体应用于牙周组织工程的实验研究

目的 研究评价松质骨基质(CBM)作为细胞载体应用于牙周组织工程的可行性及意义。方法 将体外培养的犬自体牙周膜细胞(PDLCs)接种到CBM三维支架上,扫描电镜观察PDLCs在CBM支架上的生长、附着情况;同时,将PDLCs/CBM复合植入动物牙周组织缺损,以空白组及仅植入CBM组为对照组,术后8周观察评价其牙周组织的再生情况。结果 扫描电镜显示PDLCs在CBM上伸展充分,生长旺盛,而CBM具有良好的多孔网状结构。动物实验结果可见PDLCs/CBM复合植入组较对照组有更多的新生牙骨质、新生牙周膜和新生牙槽骨生成,缺损处牙周组织几近完全再生,且未见上皮长入。结论 CBM可作为细胞载体用于牙周组织工程研究,有望用作牙周组织工程的支架材料。     

人CD146＋牙周膜干细胞的分选及其干细胞特性的鉴定

目的：通过酶消化法及流式细胞分选技术分选CD146＋牙周膜干细胞（Periodontal ligament cells,PDLCs）,探讨其干细胞特性。方法：采用流式细胞技术从人牙周膜细胞中分选CD146＋PDLCs,并对其进行免疫组化染色（角蛋白、波形丝蛋白及Stro-1）,成骨、成脂诱导分化及克隆形成实验鉴定其干细胞特性。结果：CD146＋PDLCs表达波形丝蛋白及Stro-1,具有成骨及成脂分化能力,体外培养能形成细胞克隆。结论：以CD146为分选指标的流式细胞分选技术可作为牙周膜干细胞筛选的方法。     

BMP-2、bFGF和Dex联合应用对犬牙周膜细胞增殖及矿化结节形成能力的影响

目的：联合应用BMP-2、bFGF和Dex诱导牙周膜细胞（PDLCs）,观察其成骨分化能力.方法：体外培养犬PDLCs,将第4代PDLCs进行分组：（1）对照组增加矿化诱导液组（2）bFGF＋Dex组、（3）BMP-2＋bFGF组、（4）加BMP-2＋Dex组、（5）bFGF＋BMP-2＋ Dex组.MTT法观察BMP-2、bFGF和Dex联合应用对犬PDLCs增殖的影响;成骨分化实验观察BMP-2、bFGF、Dex联合应用对犬PDLCs分化的影响.结果：（1）PDLCs细胞呈典型的成纤维细胞样形态：长梭形、纺锤形、三角形等多形性.波形丝蛋白表达阳性,角蛋白表达阴性.（2）MTT增殖实验显示：bFGF＋Dex、BMP-2＋bFGF、BMP-2＋Dex、bFGF＋BMP-2＋Dex组均促进犬PDLCs增殖,但各诱导组间无明显差异.（3）成骨诱导实验检测结果：bFGF＋BMP-2＋Dex组矿化结节染色深、面积较大、细胞密集而集中.结论：三种诱导因子两两结合均能增强犬PDLCs矿化结节形成能力,但三种因子联合应用成骨能力最强（P＜0.05）.     

BMP-2、bFGF和Dex联合应用对犬牙牙周膜细胞成骨分化能力的影响

目的:观察骨形成蛋白(BMP-2)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和地塞米松(Dex)联合应用对犬牙周膜细胞(PDLCs)成骨分化能力的影响。方法:将第4代犬PDLCs分为5组:bFGF+Dex、BMP-2+bFGF、BMP-2+Dex、BMP-2+bFGF+Dex、对照组。检测各组碱性磷酸酶(ALP)活性,并应用RT-PCR检测各组PDLCs成骨关键基因OPN、COL-1的表达。结果:第7、14 d,各组ALP表达均较空白组显著增强(P<0.05),其中200μg/L BMP-2+10μg/LbFGF+10-8mol/L Dex诱导组犬PDLCs的ALP活性显著高于其他各组(P<0.05)。RT-PCR显示,200μg/L BMP-2+10μg/L bFGF+10-8mol/L Dex诱导组OPN、COL-1基因表达最为显著。结论:3种诱导因子两两结合均能增强犬PDLCs成骨能力,但在最佳浓度下3种因子联合应用诱导能力最强(P<0.05)。