自体移植冻存骨髓基质细胞修复犬牙周缺损的实验

目的 观察冻存对骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSC)体内形成牙周支持组织能力的影响.方法 在5只Beagle犬的26个实验牙位制备牙周缺损.区组随机法分成3组,空白组(8颗)植入载体胶原膜,未冻存组(9颗)和冻存组(9颗)接种未冻存或冻存细胞与胶原膜复合物,8周后观察牙周组织再生情况.结果 冻存组和未冻存组牙槽骨再生百分比分别为(83.7±10.6)%、(85.0±6.8)%,两组新生牙骨质和牙周膜百分比均为100%,差异无统计学意义(P>0.05);空白组牙槽骨再生百分比为(24.7±9.2)%,牙骨质再生百分比为(21.0±4.8)%,牙周膜再生百分比为(24.8±5.4)%,均较冻存组和未冻存组显著减少,差异有统计学意义(P<0.05).结论 冻存对BMSC体内分化形成牙周组织的能力无显著影响.     

犬自体血清培养骨髓基质细胞的实验研究

目的:探讨犬自体血清培养骨髓基质细胞的可行性方法:获取犬自体血清,配制成含10%和20%自体血清的培养液,与含10%胎牛血清的培养液在相同条件下培养犬骨髓基质细胞(BMSCs)。通过倒置显微镜下观察细胞形态,细胞计数以及MTT法对细胞增殖情况进行检测。并且对第2代细胞用3种不同血清成分培养液(均加入β-甘油磷酸钠、抗坏血酸及地塞米松)进行成骨诱导分化,采用免疫组化检测碱性磷酸酶及钙结节形成。对检测到的量化数据做统计学分析,比较各组间的差异,以评价不同血清成分培养液对细胞增殖分化的影响。结果:3组细胞的生长及形态无明显差别,经过诱导培养均能形成钙结节。对3组间量化检测做统计学分析,各组间差异无统计学意义。结论:制备的犬自体血清能完全替代胎牛血清对骨髓基质细胞进行诱导培养。     

犬骨髓基质细胞体外培养和诱导分化的实验研究

目的：观察犬骨髓基质细胞在体外培养的条件及生物学特性,对其进行鉴定。方法：取犬骨髓分离培养骨髓基质细胞（BMSC）传代后,倒置相差显微镜观察其形态,免疫组化方法加以鉴定,生化检测Vonkossa染色鉴定其成骨能力。结果：原代培养20d后可分离得到骨髓基质细胞BMSC,生长形态相对稳定,具有成骨能力。结论：BM-SC具有贴壁生长特征,易分离扩增,增殖速度快,诱导分化具有成骨能力,可用于骨缺损的修复治疗。     

颌骨骨髓基质细胞与牙周膜细胞的生物学特性比较

目的:比较颌骨骨髓基质细胞与牙周膜细胞的基本生物学特性。方法:分离颌骨来源骨髓基质细胞和牙周膜细胞,进行改良体外原代培养。倒置显微镜观察细胞生长及克隆形成情况;CCK-8检测细胞生长曲线;免疫荧光染色检测STR0-1表达;成脂诱导后检测脂滴形成,矿化诱导后检测碱性磷酸酶的变化并用RT-PCR检测7、14 d成骨相关基因OCN的表达水平。结果:两种细胞体外培养均呈成纤维样细胞外形,能克隆生长,均具有活跃的增殖能力;两种细胞STR0-1表达阳性;成脂诱导后可见脂滴形成;矿化诱导后骨髓基质细胞的碱性磷酸酶活性较强,而且OCN基因表达较早且较强。结论:颌骨来源骨髓基质细胞具有较强的增殖及成骨分化能力,具有干细胞特性,可能是有较大临床应用潜力的组织工程种子细胞。     

犬牙周膜干细胞用于附着龈组织工程化再生的实验研究

目的：探讨牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）复合脱细胞真皮基质（acellular dermal matrix,ADM）对犬附着龈缺损模型再生修复效果,评估其用于附着龈缺损治疗的可行性.方法：原代培养犬PDLSCs,采用免疫磁珠法分离PDLSCs,将Brdu标记的PDLSCs与生物支架材料ADM复合,体外培养5天后植入犬附着龈缺损模型部位.8w时大体测量修复前后附着龈宽度、面积,Brdu免疫组化标记细胞的迁移、分化及转归,组织学观察PDLSCs-ADM复合物修复再生犬附着龈缺损效果.结果：PDLSCs-ADM复合体移植后8w,新生附着龈呈粉红色,与原黏膜组织形成明显界限,其宽度及面积增加量明显高于对照组.组织学结果显示ADM-PDLSCs组上皮结构类似正常附着龈,为复层鳞状上皮,但上皮钉突粗大、圆钝,无角化层.固有层血管、细胞成分较对照组明显增多,胶原纤维丰富.免疫组化显示ADM-PDLSCs组Brdu标记的阳性细胞在上皮基底层及黏膜下层表达,而ADM对照组无表达.结论：PDLSCs复合ADM较ADM单独使用能显著提高犬附着龈缺损修复效果,本实验为牙龈缺损的生物再生修复提供了有效途径.     

犬牙周膜干细胞体外分离培养和鉴定的实验研究

目的体外分离培养犬牙周膜干细胞,并对其进行生物学鉴定。方法采用有限稀释法进行犬牙周膜细胞克隆筛选,获得单细胞克隆来源细胞,检测其克隆形成率,并采用免疫组织化学染色、碱性磷酸酶染色、苏木精-伊红染色以及生长因子分化诱导等方法观察其生物学特性。结果1）克隆化分离培养的犬牙周膜干细胞呈集落状生长,增殖快,克隆形成率为0.95％。2）苏木精-伊红染色见细胞呈成纤维样,体积小、核大,有较多的双核细胞。3）碱性磷酸酶染色阳性。4）细胞表型组化鉴定波形丝蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原阳性,间充质干细胞表面标志STRO-1染色阳性,角蛋白染色阴性。5）在含β-磷酸甘油钠、维生素C、地塞米松的矿化液中,细胞被诱导分化为成骨细胞,碱性磷酸酶活性增强,Ⅲ型胶原染色阴性,能形成矿化结节,细胞表达成骨细胞特异的骨涎蛋白,在含β-羟基乙醇的培养液中,被诱导分化为神经细胞样细胞。结论克隆化分离培养的犬牙周膜干细胞具有很强的克隆形成能力,具有间充质干细胞表型和多向分化潜能。     

矿化液促进犬牙周膜细胞异位成骨实验

目的：探讨矿化液对犬牙周膜细胞（PDLCs）体外诱导分化、体内成骨作用的影响。方法：酶消化法原代培养成年犬前磨牙PDLCs并鉴定。再以含地塞米松、β甘油磷酸钠和抗坏血酸的矿化液连续诱导PDLCs，观察细胞形态变化，检测骨涎蛋白（BSP）表达碱性磷酸酶（ALP）活性。将诱导14d的细胞接种于钠米羟基磷灰石-胶原-聚乳酸复合支架（nHAC／PLA）上，体外培养5d后植入犬自体皮下，8W取材HE、三色法染色评价骨形成情况。以未诱导细胞为对照。结果：PDLCs波形丝蛋白（VIM）表达阳性，角蛋白（CK）阴性。矿化诱导后强阳性表达BSP，ALP活性也显著升高，提示细胞向成骨样细胞分化。体内移植8W，组织学见对照组主要形成纤维样组织而诱导组形成大量骨样组织。结论：矿化液具有促进PDLCs体外向成骨细胞分化和体内成骨作用。     

骨髓基质细胞修复骨缺损的实验研究

目的 探讨骨髓基质细胞(BMSC)对骨缺损的修复作用.方法 实验动物为新西兰大白兔,抽取2 ml骨髓制成细胞悬液,体外培养2周.采用外科手术的方法在兔双侧桡骨处形成1.5 cm的骨膜-骨缺损,将培养2周的骨髓基质细胞注射到桡骨缺损处,于移植后第1、2、3、4 周末,用钼靶X线分别检查双侧桡骨缺损处的骨形成情况,并取第4周末的骨痂进行组织学检查.结果 移植后实验侧骨痂形成快于对照侧;第4周末,实验侧缺损处全部为骨性骨痂连接,对照侧缺损处仍未形成骨痂连接.结论 BMSC可以促进骨缺损的修复.     

骨髓基质细胞体外培养及其生物学特性的研究

目的:建立一种新型的体外培养成骨细胞的生物学模型。并对其生物学特性进行研究。方法:选择大耳白兔骨髓基质细胞为材料进行体外成骨细胞培养实验,在不同培养体系中进行体外培养,通过倒置显微镜观察、透射电镜、扫描电镜、组织化学染色技术、钙染色等手段对获得的细胞进行生物学特性进行研究。结果:获得的细胞呈多种形态,有长短不一、大小不均的胞浆突起,且互相连接,细胞互相重叠呈复层生长,并形成细胞结节;胞浆丰富,富含线粒体、粗面内质网、高尔基体等,具有合成分泌功能旺盛的结构,与典型成骨细胞的形态结构相似。同时,胞浆富含碱性磷酸酶活性,在条件培养基中细胞发生钙化现象,这与典型成骨细胞的生物学特性相似。且获得的细胞在体外能连续传代,形态和功能不变。结论:我们认为用骨髓基质细胞为材料进行体外培养是成骨细胞体外培养的一种新型的生物学模型,为人工骨替代材料的研制、成骨细胞移植修复骨缺损等开辟了新的途径     

骨髓基质细胞的体外培养及分化为成肌样细胞的实验研究

目的:评估骨髓基质细胞(bMSCs)体外分化为成肌样细胞的能力,探讨骨髓基质细胞作为肌肉组织工程新的种子细胞的可能性。方法:体外分离培养兔骨髓基质细胞,经腺病毒介导的MyoD(Ad-MyoD)基因转染后,观察细胞的形态变化及增殖情况,并行成肌细胞标志物的检测。结果:转染后细胞形态发生明显变化,可见肌管样结构;myogenin及desmin免疫细胞化学染色呈阳性。结论:体外培养的骨髓基质细胞可以向成肌方向转化,有望成为肌肉组织工程新的种子细胞。     

犬不同部位BMSCs对牙周膜细胞增殖和成骨分化的影响

目的:研究犬髂骨骨髓基质细胞(iliac bone marrow stromal cells,I-BMSCs)和犬颌骨骨髓基质细胞(maxilla bone marrow stromal cells,M-BMSCs)对犬牙周膜细胞(periodontal ligament cells,PDLCs)增殖和成骨分化的影响,了解不同部位来源的骨髓基质细胞对牙周膜细胞调控作用的差异性。方法:原代培养犬髂骨骨髓基质细胞、颌骨骨髓基质细胞和牙周膜细胞。分别建立犬髂骨和颌骨来源的骨髓基质细胞与牙周膜细胞的Transwell共培养体系;制备骨髓基质细胞条件培养液培养牙周膜细胞,MTT法检测牙周膜细胞生长曲线;利用实时荧光定量PCR法检测牙周膜细胞成骨相关基因核心结合因子2(Runx2)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)的变化;Westernblot法检测牙周膜细胞Runx2和OCN蛋白的表达变化。结果:髂骨骨髓基质细胞条件培养液能促进牙周膜细胞的增殖;颌骨骨髓基质细胞条件培养液对牙周膜细胞增殖有抑制作用;QPCR检测到共培养组牙周膜细胞Runx2、OCN、ALP基因表达高于对照组,Westernblot检测到共培养组牙周膜细胞的Runx2和OCN的蛋白表达高于对照组,且颌骨骨髓基质细胞诱导牙周膜细胞成骨分化效果更显著。结论:犬颌骨骨髓基质细胞条件培养液可能会抑制牙周膜细胞的增殖,相较于髂骨骨髓基质细胞,颌骨骨髓基质细胞促进牙周膜细胞成骨分化效果更显著,颌骨骨髓基质细胞和牙周膜细胞共同作为种子细胞可能更有利于牙周组织再生。     

氯化镧对体外培养的犬骨髓基质细胞增殖的影响

目的:观察3种浓度的氯化镧(LaCl3,La3+)对体外培养的犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)的影响。方法:用5.564×102、5.564、5.564×10-2μg/mL3种浓度的La3+干预第3代BMSCs,设空白对照组和50ng/mLBMP-2干预的阳性对照组。通过MTT法、碱性磷酸酶半定量检测分析La3+对BMSCs的影响。结果:5.564μg/mL La3+干预组BMSCs在第6、7天表现出较高的生长趋势;碱性磷酸酶半定量检测发现5.564μg/mL La3+干预组OD值均数明显高于另两个实验组均数(P<0.05)。结论:5.564μg/mL浓度的La3+可促进BMSCs增殖。     

牙周韧带细胞与骨髓基质细胞表面抗原表达的比较

目的：比较骨髓基质细胞与正常人牙周韧带细胞表面抗原的表达情况,探讨牙周韧带细胞与骨髓基质细胞的关系。方法：体外培养人牙周韧带细胞及骨髓基质细胞,采用免疫组化SP法检测细胞中CD14、CD44、CD105、CD34的表达,并进行图像分析。结果：与骨髓基质细胞相似,人的牙周韧带细胞上表达CD44、CD105,不表达CD34、CD14结论：人的牙周韧带细胞与骨髓基质细胞在表面抗原特性上有相似性。     

犬骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化的实验研究

目的:研究犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)在体外诱导分化为成骨细胞的方法和活性检测。方法:抽取犬骨髓3 mL,使用成骨条件培养液,贴壁法体外培养,将培养的第2、3代细胞进行透射电镜、流式细胞仪、生长曲线、碱性磷酸酶、Von Kossa和免疫组化等检测。结果:第2代细胞碱性磷酸酶染色呈阳性表达;第3代细胞Von Kossa染色、骨桥素、骨涎蛋白和骨钙蛋白呈阳性表达;第3代细胞透射电镜显示高尔基体和线粒体丰富;流式细胞仪检测显示第3代处于S期的细胞比例较第2代增加。结论:犬骨髓基质细胞在体外能定向诱导分化为成骨细胞。     

兔骨髓基质细胞的体外成骨定向诱导培养

目的:体外分离培养兔骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs),并向成骨定向诱导培养,为骨组织工程提供适宜的种子细胞。方法:抽取新西兰白兔的骨髓,体外分离纯化得到BMSCs,并利用条件培养液将其向成骨定向诱导培养、扩增。采用倒置相差显微镜观察细胞增殖分化情况;使用碱性磷酸酶(ALP)和VonKossa染色的方法,鉴定其成骨性能;用MTT法描绘标准细胞浓度-OD值曲线。结果:BMSCs在培养皿中贴壁生长、增殖;经ALP和VonKossa染色证实其有成骨潜能;标准BMSCs细胞浓度-OD值曲线显示细胞浓度和OD值呈线性正相关。结论:可以通过在体外分离纯化骨髓并诱导培养,获得足够数量、有成骨潜能的BMSCs作为骨组织工程的种子细胞。     

大鼠颌骨与胫骨骨髓基质细胞生物学特性和基因表达差异的比较

目的 :比较大鼠颌骨来源骨髓基质细胞(M-BMSCs)与胫骨来源骨髓基质细胞(T-BMSCs)生物学特性的差异。方法:体外通过全骨髓贴壁法,分离和培养SD大鼠M-BMSCs和T-BMSCs,取第3代细胞用于:1流式细胞检测鉴定表面标志;2MTT、细胞周期、克隆形成率检测细胞增殖能力差异;3成骨、成脂诱导及染色检测细胞多项分化潜能;4碱性磷酸酶(ALP)活性、染色、免疫荧光染色检测细胞成骨活性的差异;5荧光定量PCR检测Wnt1、Wnt5a、Hoxa11、Runx2、Ocn、Col I的表达差异和成骨诱导后各基因的表达变化。结果:1 M-BMSCs和T-BMSCs阳性表达CD29、CD44,阴性表达CD45;2MTT、细胞周期检测、克隆形成率显示T-BMSCs细胞增殖能力较高;3M-BMSCs在成骨诱导后矿化能力更强;而T-BMSCs成脂诱导形成脂滴的能力更强;4M-BMSCs表达ALP的水平更高;5荧光定量PCR示2种细胞的Wnt1、Wnt5a、Hoxa11、Runx2、Ocn、ColⅠ表达存在差异。结论:体外培养的M-BMSCs和TBMSCs有着不同的生物学特点,其相关基因Wnt1、Wnt5a、Hoxa11、Runx2、Ocn、ColⅠ的表达上存在差异。     

甲状旁腺素对共培养的髁突软骨细胞和BMSCs成骨分化的影响

目的:研究甲状旁腺素(PTH)在持续性或间歇性作用方式下对共培养的髁突软骨细胞和BMSCs分化和骨质形成的影响.方法:根据PTH应用方式不同分为3组:PTH持续应用组、PTH间歇应用组、空白对照组.用茜素红染色检测培养6 d和14 d后,各组细胞矿化结节的形成情况;用碱性磷酸酶检测试剂盒检测碱性磷酸酶活性,应用Western blot和Real-time PCR检测BMSCs成骨分化、骨形成相关蛋白和基因mRNA.结果:PTH间歇应用组在6 d和14 d时形成的矿化结节数量最多,而PTH持续性应用组形成的矿化结节在3组中数量最少.经过6 d和14 d的PTH作用,PTH间歇应用组的ALP活性,RUNX2、BSP和MMP13蛋白,成骨分化标志物RUNX2,ALP和骨形成相关基因OCN及OSX的表达,均明显高于PTH持续应用组和空白对照组(P<0.05).PTH持续应用组COL2a1的mRNA及成骨抑制基因SOST mRNA的表达量明显高于PTH间歇应用组(P<0.05).结论:间歇性应用PTH可明显促进共培养体系的成骨向分化及骨质形成,而持续性应用PTH则抑制该过程.     

冻存骨髓基质细胞和胶原膜在裸鼠体内的成骨研究

目的：研究经超低温冻存后的骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）和支架材料胶原膜BME-10X复合体植入裸鼠体内的成骨情况.方法：体外分离培养Beagle犬 BMSCs,冻存二代生长状况良好的BMSCs.12个月后,复苏冻存的BMSCs,并在体外构建BMSCs和0.5 cm×0.5 cm大小的BME-10X复合体.将胶原膜＋BMSCs＋矿化诱导培养液、胶原膜＋BMSCs＋基础培养液、单纯胶原膜＋矿化诱导培养液培养5 d后,植入裸鼠体内,并于术后第4、8、12周取出标本,进行大体观察和组织病理学分析.结果：单纯胶原膜＋诱导培养液组在植入胶原膜后,胶原膜边界清晰,膜边缘及内部基本没有细胞生长;在胶原膜＋BMSCs＋基础培养液组,术后第4周可见,胶原膜内有细胞长入,并有细小的条索状新生胶原形成,随着时间的延长,支架胶原逐渐分解,新形成的条索状胶原纤维变粗大;在胶原膜＋BMSCs＋矿化诱导培养液组,植入后也可见支架胶原的分解和更多的细胞生长,大量新生的胶原形成类骨质样组织.结论：冻存BMSCs复苏后进行体外培养扩增与诱导分化,并在在体内环境下复合胶原支架材料,仍然具有较强成骨能力.     

壳聚糖膜对人牙周膜细胞体外增殖的影响

目的　研究壳聚糖膜在体外培养条件下对人牙周膜细胞增殖的影响。方法　制备用于引导性组织再生的壳聚糖膜。体外培养人牙周膜细胞 ,用酶动力学观察在壳聚糖膜、聚四氟乙烯膜、壳聚糖膜浸出液及空白对照 4种条件下 ,人牙周膜细胞增殖的情况。结果　壳聚糖膜组的人牙周膜细胞增殖高于其他组 (P <0 .0 1) ,壳聚糖膜浸出液组人牙周膜细胞增殖高于聚四氟乙烯膜组和空白对照组 (P <0 .0 5 ) ,聚四氟乙烯组与空白对照组差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　体外培养时 ,壳聚糖膜可以促进人牙周膜细胞增殖。