靶向人CD106基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的：：构建人CD106基因RNAi慢病毒载体。方法：设计4条靶向CD106的RNA干扰靶点序列(Target 1、2、3、4),合成短发卡结构shRNA并退火成双链DNA,与慢病毒载体重组形成siRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定验证获得连接正确的克隆。经由293T细胞包装siRNA慢病毒颗粒,随后将其感染人口腔鳞癌HN12细胞,分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率。结果：构建的慢病毒载体的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度至少达到1×109 TU/ ml。siRNA慢病毒感染人HN12细胞,经Real-time PCR和Western blot检测目的基因CD106的mRNA和蛋白表达较阴性对照载体慢病毒感染组明显下降。结论：成功构建了人靶向CD106RNAi慢病毒载体,并能够在细胞水平上有效沉默靶基因。     

慢病毒介导COX-2基因沉默对舌鳞癌Tca8113细胞株药物敏感性的影响

目的:研究COX-2基因沉默表达对舌鳞癌Tca8113细胞药物敏感性的影响。方法:运用RNA干扰技术,构建慢病毒介导的针对COX-2基因的干扰载体,以其感染舌鳞癌Tca8113细胞,沉默其COX-2表达;采用Western-blot方法检测正常细胞以及敲除目的基因细胞COX-2蛋白表达水平;运用MTT方法观察Tca8113细胞在COX-2基因沉默后对平阳霉素及顺铂敏感性的变化。结果:western-blot结果显示,感染慢病毒载体后的细胞COX-2蛋白表达显著下降;MTT结果显示,对相同浓度的平阳霉素和顺铂,COX-2基因沉默组细胞生长抑制率较对照组细胞高(P<0.05)。结论:运用慢病毒介导RNA干扰技术,成功建立稳定沉默COX-2的舌鳞癌细胞株,COX-2沉默后增强了Tca8113细胞对平阳霉素及顺铂的药物敏感性。     

E2F-1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建和鉴定靶向E2F-1基因的RNA干扰慢病毒载体。方法：体外合成两对互补并编码靶向E2F-1基因的特异性短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）序列和一个阴性对照组的寡核苷酸,克隆到pLKO.1-PURO-U6（Age I/EcoR I）质粒载体中,经酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确,将以上质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒。各组病毒载体转染Tca8113细胞后,运用Real-Time PCR和Western检测三组E2F-1 mRNA和蛋白的表达水平。结果：经酶切和测序证明,pLKO.1-PURO-U6-E2F-1shRNA序列正确;转染后,各组慢病毒载体中,第一组质粒感染后的Tca8113细胞中E2F-1基因的核酸电泳条带明显减弱,Western检测出E2F-1蛋白的表达降低。结论：靶向E2F-1基因的shRNA慢病毒载体构建成功,并可特异性沉默E2F-1基因的表达,为研究E2F-1在口腔鳞癌的发生发展中的作用提供了初步的实验基础。     

靶向人端粒酶反转录酶RNA干扰载体质粒的构建与筛选

目的:设计靶向人端粒酶反转录酶的RNAi序列,构建shRNA表达载体质粒和hTERT真核表达质粒,采用共转染工具细胞筛选出有效靶点.方法:首先以EASYMsiRNA软件针对hTERT设计5个靶点siRNA序列和1条通用阴性对照序列,合成shRNA oligo表达框架,将其分别连接至经酶切消化的载体质粒、pGCsi-U6/Neo/GFP、pGCL-GFP,重组质粒转化1)H5α,阳性克隆进行PCR与测序鉴定;然后从cDNA文库中利用PCR钓取hTERT基因片段,与表达载体pEGFP-C1分别进行双酶切、纯化及定向连接、重组、转化,阳性克隆行PCR与测序鉴定,荧光镜检GFP表达;最后上述2个质粒系统共转染293T细胞,Western印迹检测hTERT蛋白表达水平,筛选最有效序列.应用SPSS16.0软件包对所得数据进行单因素方差分析.结果:BLAST检索5条hTERT siRNA序列均能100%命中,且不与其他基因同源:PCR鉴定及阳性克隆测序验证shRNA oligo与载体质粒成功连接、重组.hTERT基因PCR钓取片段产物大小1.4 Kp,经酶切与质粒连接,形成pEGFP-C1-hTERT表达载体,阳性克隆PCR、测序鉴定确定成功重组;转染293T细胞48h时荧光镜F可观察到GFP标记的hTERT融合蛋白.hTERT表达质粒和shRNA载体质粒共转染293T细胞,48h时Western印迹榆测结果显示:实验各组hTERT蛋白量均有不同程度减少,而内参对照B-aetin和GAPDH尤明显变化.经β-actin校正,得到各组hTERT蛋向相对表达量:KD No.1-5实验组与NC组相比,hTERT基因表达均得到不同程度的敲减(54.61%～76.84%.P＜0.05),其中No.4敲减效能最高.结论:5条RNAi设计序列均可有效、特异性地沉默hTERT基因的转录和表达水平,其中以5'-GCAAGTTGCAAAGCArrGGAA-3'敲减效能最优;构建外源基因的过表达载体质粒转染工具细胞,可作为RNAi敲减效率筛选的验绩标靶.     

载体携带小干扰RNA抑制Tca8113细胞血管内皮生长因子的表达

目的了解小干扰RNA（siRNA）对人舌癌细胞株Tca8113血管内皮生长因子（VEGF）表达的抑制作用。方法构建2对针对血管内皮生长因子的siRNA真核表达载体（Pu-VEGF-siRNA1,Pu-VEGF-siRNA2）,经脂质体Lipofectamine2000转染Tca8113细胞,以空载体组作实验对照组,未转染组作空白对照组。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫组化、酶联免疫吸附（ELISA）方法分别检测转染后的Tca8113细胞VEGF mRNA及蛋白表达。结果与实验对照组和空白对照相比较,转染Pu-VEGF-siRNA1和Pu-VEGF-siRNA2后Tca8113细胞的VEGF mRNA 和蛋白表达明显下降。结论通过RNA干扰技术能有效抑制舌癌Tca8113细胞VEGF mRNA和蛋白的表达。     

Naa10p 表达对舌鳞癌 Tca8113细胞平阳霉素敏感性的影响

目的：观察 N-α乙酰基转移酶（Naa10p）表达对舌鳞癌 Tca8113细胞平阳霉素（PYM）敏感性的影响。方法：采用慢病毒体系分别构建干扰及过表达 Naa10p 的 Tca8113细胞株,并设立相应的对照细胞 Tca8113-LV-NC,鉴定干扰和过表达效率,MTS 法检测药物处理后各处理组细胞对 PYM的敏感性。结果：干扰 Naa10p 的 Tca8113-LV-shNaa10p 细胞、过表达Naa10p 的 Tca8113-LV-Naa10p 细胞与对照细胞 Tca8113-LV-NC 对平阳霉素的半数抑制浓度（IC50）分别为（20．772±0．106）μg／ml、（2．157±0．123）μg／ml、（6．301±0．069）μg／ml（组间比较,P ＜0．05）。结论：下调 Naa10p 表达可降低口腔鳞癌细胞 Tca8113对平阳霉素的敏感性,上调 Naa10p 表达可增强口腔鳞癌细胞 Tca8113对平阳霉素的敏感性。     

靶向黏着斑激酶siRNA表达载体构建及转染Tca8113细胞的沉默效应

目的:构建靶向黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)基因的小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)质粒表达载体,转染人舌癌细胞Tca8113后观察其对FAK表达的抑制作用.方法:根据siRNA的设计原则,在人FAK mRNA序列中,设计并合成2条特异性靶序列寡核苷酸及2条无关对照序列,经退火成互补双链,再克隆到pGC-silencerTM-U6/Neo真核表达载体中,构建重组体pSilencer-FAK并进行酶切鉴定;转染重组质粒至Tca8113细胞中,经G418抗性筛选,获得稳定转染细胞系;运用免疫细胞化学和Westem-blot鉴定FAK的沉默效应.结果:质粒酶切证实目的寡核苷酸片段已被克隆到pGC-SilencerTM-U6/Neo载体中;psi-lencer-FAK转染细胞后,FAK基因的表达受到明显抑制.结论:成功构建了针对人FAK的siRNA表达载体,通过转染Tca8113细胞可有效地抑制细胞中FAK的表达.     

RNA干扰FAT10基因对舌癌细胞系Tca8113增殖和侵袭的影响

目的:应用RNA干扰技术抑制人舌癌细胞株Tca8113中FAT10基因的表达,探讨FAT10基因表达下调对舌癌细胞生物学行为的影响。方法:构建针对FAT10基因特异性siRNA真核表达载体pU-FAT10-siRNA,将其转染至舌癌细胞株Tca8113,采用RT-PCR、Western印迹等方法检测转染后的Tca8113细胞中FAT10的表达。通过流式细胞仪分析siRNA对舌癌细胞周期的影响,并通过细胞侵袭能力实验观察siRNA对Tca8113细胞恶性生物学行为的影响。结果:siRNA干扰Tca8113细胞后,FAT10的表达无论是在mRNA水平还是在蛋白质水平均显著下降(P<0.05),细胞周期被阻滞在G1期,细胞生长缓慢,体外侵袭能力下降。结论:通过RNAi技术阻断FAT10的表达,可抑制Tca8113细胞的生长、增殖、迁徙,提示FAT10基因在舌癌的发生发展过程中起重要作用。     

SIP1在人舌癌Tca8113细胞中的定位和融合蛋白表达鉴定的研究

目的检测Smad相互作用蛋白1(SIP1)在人舌癌Tca8113细胞系中的定位及融合蛋白的表达鉴定。方法 PCR扩增SIP1编码序列的全长,克隆到pCMV-Flag-MAT-Tag 1载体。利用共聚焦激光扫描显微镜观察SIP1和SIP1-Flag在人舌癌Tca8113细胞系中定位,并将构建好的Flag标签SIP1(SIP1-Flag)真核表达载体转染到人舌癌Tca8113细胞系中,提取蛋白进行Western blot检测,利用Flag标签抗体进行免疫沉淀纯化SIP1-Flag融合蛋白。结果构建了SIP1-Flag真核表达载体。SIP1和SIP1-Flag融合蛋白主要定位于人舌癌Tca8113的细胞核中,Western blot检测到SIP1-Flag融合蛋白表达,且在人舌癌Tca8113细胞中成功纯化SIP1-Flag蛋白。结论成功构建真核表达载体。SIP1和SIP1-Flag主要定位于细胞核,成功鉴定融合蛋白表达并纯化SIP1-Flag融合蛋白。     

MMP－2 siRNA促进口腔鳞状细胞癌Tca8113细胞凋亡作用的研究

目的：研究基质金属蛋白酶－2（MMP－2）siRNA对口腔鳞状细胞癌Tca8113细胞凋亡的作用。方法：采用MMP－2 siRNA慢病毒感染Tca8113,qPCR检测MMP－2表达,MTT检测细胞活性,Annexin－V单染检测细胞凋亡。结果：MMP－2 siRNA慢病毒成功抑制Tca8113中MMP－2 mRNA表达。MMP－2干扰组细胞活性显著低于阴性病毒组（P＜0．01）,且细胞凋亡率高于阴性对照组（P＜0．01）。结论：MMP－2干扰能促进Tca8113凋亡,起到抗肿瘤效应。