短片段一步法RT-PCR方法的建立

0　引言　传统 RT- PCR方法需要用反转录酶将 RNA先反转录成 c DNA,然后用 Taq酶对 c DNA进行 PCR扩增 ,而且往往需要巢式 PCR扩增才能提高结果的特异性和灵敏度 ,操作比较麻烦 .有人发现 Taq DNA聚合酶有一定的反转录活性 [1 ] ,可以实现只用 Taq DNA聚合酶进行反转录的单反应管一步法 RT- PCR扩增 .但是我们在实验过程中发现 ,利用Taq DNA聚合酶进行一步法 RT- PCR反应成功率往往不高 ,这可能是因为 Taq DNA聚合酶的反转录活性不高的原因造成的 .为此 ,我们重新设计了实验方法 ,以提高用 Taq DNA聚合酶进行 RT- PC…     

一步法RT-PCR检测手足口病EV71、CA16病毒核酸

目的检测手足口病病原核酸,了解濮阳市手足口病病因和不同标本检测状况。方法对濮阳市辖区内手足口病43例住院患者的咽拭子、疱疹液和血清样本进行一步法RT-PCR检测。结果 43例患者的72份标本中,病原核酸EV71阳性23份,阳性率为31.94%。其中,咽拭子阳性率为39.53%(17/43),疱疹液阳性率为66.67%(6/9),血清阳性率为0%(0/20),CoxA16未检出。结论濮阳市手足口病流行由肠道病毒EV71引起,不同标本中疱疹液和咽拭子病毒含量多。     

双抗体夹心一步法及两步法测HBsAg的结果分析

目的分别用双抗体夹心一步法及两步法检测200份慢性乙肝患者标本（亦作为阳性对照标本）及临床随机体检标本372份和186份排除乙肝病毒感染的阴性对照标本,并对结果进行分析比较,以寻找一种更适合基层医院的最简便快速价廉的方法。结论根据2种方法的检测结果对双抗体夹心一步法及两步法测HBsAg的结果及方法进行比较后本人认为对于HBeAg阴性的标本,用一步法和两步法检测HBsAg的结果是完全吻合的;而对于极少数皿BeAg阳性珈BsAg阴性的标本可用两步法检测HBsAg,以排除是否HBsAg浓度过高的“帚现象”引起的假阴性亦即钩镰效应。     

铁皮石斛RNA提取及RT-PCR检测

目的有效地提取铁皮石斛高质量的RNA,为研究环境胁迫对铁皮石斛生长与代谢影响的分子表达机制奠定基础。方法建立声波处理的刺激组与对照组,改良苯酚-氯仿法制备的RNA,分光光度法检测其量,1.0%变性琼脂糖凝胶电泳检测其完整性;所得的总RNA经过RT-PCR扩增,6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测显示其差异cDNA片段。结果提取的总RNA A260/A230为3.16,A260/A280为1.96,产量达0.27μg/m g,电泳条带清晰,完整性良好,可筛选出明显的差异cDNA片段,分子质量在240~600 bp。结论用该方法能高质高量地提取富含多糖的药用植物总RNA。     

酶免疫竞争一步法和两步法检测抗-HBe的结果比较

目的比较酶免疫竞争一步法和两步法检测抗-HBe的结果。方法对一步法HBeAg和抗-HBe结果同时阳性的45份血清标本,再用两步法进行检测,比较2种方法的结果。结果一步法HBeAg和抗-HBe结果同时阳性的45份血清标本,两步法检测抗-HBe结果仅有21份阳性,差异有统计学意义。结论对于一步法HBeAg和抗-HBe结果同时阳性的血清标本,应该用两步法复检,确保检验结果准确。     

检测4种热休克基因表达水平的RT-PCR体系的建立及其应用

目的建立能同时检测人Jurkat细胞中4种热休克基因mRNA表达水平的RT-PCR体系。方法采用基因克隆、基因重组、体外转录、RT-PCR技术,建立能同时检测细胞中4种热休克基因的RT-PCR体系,并将此体系用于检测SW13细胞中热休克基因的表达。结果构建了用于4种热休克基因mRNA检测的内参照质粒,并经体外转录成内参照RNA(i-RNA);用于SW13细胞中结果显示:hsp70、hsp90α呈典型的热诱导表达,hsp60和hsp90β具有较高水平的组成性表达,并且呈不同程度的热诱导表达。结论新构建的RT-PCR体系可以用于检测人Jurkat细胞中4种热休克基因mRNA的表达水平。     

无偿捐血者HBsAg三种试剂检测结果比较分析

目的分析比较三种乙型肝炎表面抗原检测试剂在血液筛查中的应用价值。方法采用试剂厂家提供的ELISA试剂(两步法)、进口试剂和国产ELISA试剂(一步法)对3600份无偿献血标本进行平行实验,对单试剂筛查为HBsAg阳性的样本进行确证实验。结果以进口试剂为对比试剂,评估国产ELISA试剂(两步法)的灵敏度、特异度和符合率分别为96.12%、99.63%和99.28%,国产ELISA一步法的灵敏度、特异度和符合率分别为90.86%、98.92%和98.11%。结论应选择高灵敏度的试剂,以提高乙肝表面抗原的检出率,保障临床用血安全和提高临床乙肝的确诊率。     

方丝弓一步和两步关闭曲法的比较分析

目的 对标准方丝弓矫治器关闭间隙的二种方法,即一步和两步关闭曲法的优缺点进行评价.方法 采用前瞻性配对设计,对20例拔除4个第一前磨牙的轻、中度前突的安氏Ⅱ类1分类错(牙合)应用杭州爱丽斯方丝弓矫治器的病例,分两组分别采用一步关闭曲法和两步关闭曲法关闭拔牙间隙,对两组关闭间隙前后的X线头颅片分别进行测量分析比较.结果 两步法在节省支抗上略优于一步法,但差异无统计学意义.一步法在时间上要明显短于两步法,在维持前牙覆(牙合)及前牙转距方面无显著差别.结论 一步关闭曲法在标准方丝弓临床应用中可能会更易被接受.     

鹌鹑肝组织胱硫醚β-合酶基因RT-PCR的实验研究

[目的]建立一种有效的鹌鹑肝组织胱硫醚β-合酶(CBS)RT-PCR,为实现CBS Real-time PCR提供条件。[方法]采取一步法,改进一步法,异硫氰酸胍法(重复抽提)和异硫氰酸胍法(一步法)四种方法提取总RNA,以CBS cDNA共有序列设计鹌鹑CBS引物,进行CBS RT-PCR引物筛选。[结果]除改进一步法外,其他三种方法提取的总RNA完整性好;除异硫氰酸胍法(一步法)外,其他三种方法提取的总RNA的A260/A280都在1.8以上纯度。异硫氰酸胍法(重复抽提)提取的总RNA极少残留DNA。[结论]四种方法都能较好地扩增CBS片段,一步法最省时。但异硫氰酸胍法(重复抽提)抽提得到的RNA质量较好.     

一种用Tripure试剂从冻存组织分离纯化RNA的方法

目的 探索一种使提取的冻存组织RNA纯度和完整性均较高的方法。方法 在Tripure分离试剂说明书基础上，结合异琉氰酸肥等提取RNA的方法，对提取组织RNA的操作步骤进行调整、改进。结果 用此法提取的冻存组织RNA，经电泳鉴定及进一步RT—PCR检测，显示RNA的纯度及模板性较好。结论 用此法提取的冻存组织RNA质量稳定可靠。     

细胞角蛋白19基因诊断淋巴结微转移癌灶的意义

目的研究淋巴结转移情况以判断肿瘤预后,指导综合治疗。方法应用细胞角蛋白19（cyto－keratin19,CK19）RT－PCR方法对上皮性肿瘤及淋巴结进行CK19mRNA检测。结果5例正常淋巴结无CK19mRNA表达;15例乳腺癌、10例胃癌、11例大肠癌均表达CK19mRNA;82个淋巴结中,组织学检查11个有肿瘤转移,其CK19RT－PCR也为阳性,其余71个无肿瘤浸润淋巴结,经CK19RT－PCR发现16个表达CK19mRNA。结论CK19RT－PCR方法提高了淋巴结转移的检出率,在上皮性肿瘤患者的其它部位（外周血、骨髓）微转移癌灶的检测中有推广应用价值。     

从福尔马林固定-石蜡包埋淋巴组织抽提RNA的影响因素研究

目的探讨从福尔马林固定-石蜡包埋(FFPE)淋巴组织提取RNA的影响因素.方法以新鲜淋巴组织为对照,改变福尔马林固定时间及组织裂解方法,采用22对TCR Vβ CDR3区域特异性引物,观察从FFPE淋巴组织提取RNA的产量及其作为RT-PCR模板的扩增效率.结果蛋白酶K法提取效率显著高于Trizol法,所提取RNA的可扩增性随福尔马林固定时间的延长而下降,TE 70 ℃孵育60 min去修饰处理可显著提高所提RNA的可扩增性.结论从FFPE组织提取RNA完全可行,尽量短的固定时间、蛋白酶K消化及去修饰处理是必要的.     

微小RNA在神经系统及髓鞘发生的调节作用

微小RNA通过转录后水平调节基因的表达在细胞的发育过程中发挥关键作用。研究表明,微小RNA是神经系统中重要的调节因子。而构成轴突的髓鞘是中枢神经系统的重要组成部分,微小RNA与神经退行性疾病以及髓鞘的发生也有非常重要的关系。本文就近年来微小RNA与神经系统以及髓鞘的发生中可能的调控作用进行了综述。     

采用改进的差示PCR技术分离胃癌差异表达基因及其临床意义(英文)

目的：建立优化的差示PCR条件；运用建立的条件分离胃癌GC7901与胃粘膜GES－1细胞株之间的差异表达基因；根据获取的序列，设计引物并运用于检测胃癌组织、血、活检胃粘膜标本，拟筛选出检出率与符合率高的数对引物，建立胃癌基因诊断方法．方法：LJGC7901与GES－1细胞株为研究对象，探索mRNA差示PCR的最佳反应条件，运用优化的条件分离细胞株之间的差异表达基因；以回收的片段作探针，打点杂交证实为真正的差异片段后，对产物进行直接测序及同源性检索；设计引物，采用RT－PCR方法检测胃癌组织、血、活检胃粘膜标本．结果：优化的差示PCR条件为：前5轮PCR循环采用94℃35s，40℃2min，72℃30s，后35轮PCR循环采用94℃45s，55℃2min，72℃1min，最后在72℃延伸7min；分离回收差异条带154条，从中选出17个片段作探针，打点杂交证实在两细胞株之间呈差异表达；对17个片段进行了测序，其中17个新序列被GenBank接受，接受号为AF054162至AF054172，AF071052至AF071058；其中5个序列引物在26例胃癌标本中检出覆盖率为100％，在9例病理确诊的胃癌患者活检胃粘膜中检出率100％，在17例病理确诊为胃癌患者血标本中检出率为53％．结论：优化了mRNA差示PCR技术条件；分离出154个差异表达的基因片段；筛选出17个新序     

逆转录聚合酶链反应检测HCV RNA血标本保存条件分析

目的 确定用于丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ逆转录聚合酶链反应测定的血清（浆）标本的最佳收集和保存条件。方法 按的不同条件处理,用逆转录聚合酶链反应测定ＨＣＶ ＲＮＡ。和高压消毒的离心管与未用高压消毒的离心管收集、保存ＨＣＶ ＲＮＡ血清,其阳性检出率有差异（Ｐ〈０．０５）。血凝固后４ｈ离心分离血清对ＨＣＶ ＲＮＡ阳性检出率不造成明显改变（阳性率为８５％）;１２ｈ后检测则变化明显（阳性率降至７５％）。