RNA干扰对VEGF在人卵巢癌细胞中表达及细胞增殖的影响

目的:探讨小发夹RNA(shRNA)载体介导抑制人卵巢癌细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达和对卵巢癌细胞增殖的影响.方法::采用脂质体介导的方法将抗VEGF小发夹状双链RNA真核基因表达载体转染到人卵巢癌细胞(HO-8910)中,用G418 筛选获得阳性克隆.用Western印迹法、RT-PCR检测VEGF基因在卵巢癌细胞中的表达;通过MTT及细胞周期分析观察其对卵巢癌细胞增殖的影响. 结果:转染特异性小发夹RNA质粒表达载体的HO-8910细胞中VEGF表达量明显减少;HO-8910细胞生长减慢,阻滞于G1期的增多,S期细胞减少.结论:VEGF小发夹RNA质粒载体可显著抑制HO-8910细胞中的VEGF基因的表达,抑制卵巢癌细胞的增殖,该研究为应用RNAi进行肿瘤的基因治疗提供了实验依据.     

RNA干扰对HeLa细胞VEGF表达和细胞增殖的影响

目的：探讨RNA干扰对HeLa细胞中血管内皮生长因子(VEGF)表达和细胞增殖的影响,为人宫颈癌的治疗提供理论依据。方法：构建针对VEGF165的RNA干涉质粒,稳定转染HeLa细胞,设HeLa组、对照组和干涉组,用RT-PCR方法检测稳定细胞株中VEGF mRNA的表达,Western blotting和ELISA方法检测VEGF165蛋白的表达,MTT及流式细胞术检测VEGF siRNA作用下的细胞增殖,Hoechst33342染色检测VEGF siRNA作用下细胞凋亡的变化。结果：成功建立了VEGF siRNA的稳定细胞株,与对照组比较,干涉组VEGF的mRNA 和蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。 与对照组比较,稳定转染VEGF siRNA的细胞株在24 、48 和72 h的 细胞生长抑制率分别为12.8%±5.4%、17.4%±3.7%和27.2%±5.7%,细胞增殖明显受到抑制(P＜0.01)。与对照组比较,Hoechst33342染色显示VEGF siRNA对HeLa细胞的细胞凋亡率没有影响。结论：VEGF siRNA可以有效抑制HeLa细胞中VEGF mRNA和蛋白的表达,抑制细胞的增殖,提示VEGF在宫颈癌的发生、发展中具有重要作用,抑制VEGF的表达有望成为一种治疗宫颈癌的途径。     

RNA干扰沉默c-Myc基因对胶质瘤细胞增殖及VEGF表达的影响研究

背景：通过抑制人类多形性胶质母细胞瘤细胞株中c-Myc基因的表达,探讨c-Myc癌基因在体外对胶质瘤细胞增殖、凋亡及VEGF表达的影响。 方法：1.构建以c-Myc基因为靶向的shRNA干扰质粒pCMYC,同时构建pHK质粒作为阴性对照。2.采用流式细胞术检测IN500Δ、IN500Δ-pHK及IN500Δ-pCMYC三组细胞的细胞周期及细胞凋亡变化情况。3.采用免疫组织化学法及WB法分别检测三组细胞中c-Myc及VEGF蛋白的表达情况。 结果：1.结果示IN500Δ-pCMYC细胞组IN500Δ细胞中c-Myc与VEGF mRNA表达降低,与IN500Δ细胞组及IN500Δ-pHK细胞组相比差异均有统计学意义(P<0.01);IN500Δ细胞组与IN500Δ-pHK细胞组IN500Δ细胞中c-Myc与VEGF mRNA表达水平均无显著性差异(P>0.05);2.统计分析显示IN500Δ组与IN500Δ-pHK组间细胞周期分布无显著性差异(P>0.05),IN500Δ组及IN500Δ-pHK两组与IN500Δ-pCMYC组间比较,细胞周期分布均存在显著性差异(P<0.01)。3.免疫细胞化学染色结果显示,IN500Δ细胞及IN500Δ-pHK细胞中c-Myc与VEGF阳性细胞表达水平均高,而两组中c-Myc与VEGF表达之间相比均无显著性差异(P>0.05);IN500Δ-pCMYC细胞中c-Myc与VEGF阳性细胞表达水平均显著降低,与IN500Δ及IN500Δ-pHK细胞组相比有显著性差异 (P<0.05)。WB检测结果示IN500Δ-pCMYC细胞组IN500Δ细胞中c-Myc与VEGF的蛋白表达降低,与IN500Δ细胞组及IN500Δ-pHK细胞组相比差异均有统计学意义(P<0.01);IN500Δ细胞组与IN500Δ-pHK细胞组IN500Δ细胞中c-Myc与VEGF 的蛋白表达水平均无显著性差异(P>0.05)。 结论：沉默c-Myc基因在体内外均能够有效抑制IN500Δ细胞增殖并诱导大量肿瘤细胞发生凋亡,其机制可能是通过抑制VEGF的表达,从而降低肿瘤组织内的血管生成实现的。     

腺病毒介导RNA干扰抑制人结肠癌VEGF受体表达及肿瘤生长

目的:观察腺病毒介导的RNA干扰抑制人结肠癌中血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)表达及肿瘤生长的作用.方法:将RNA干扰pAd-Easy/VEGFR腺病毒载体用Lipofectamine 2000转染293细胞,制备携带人VEGFR的腺病毒,转染CW2细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察转染效率,通过RT-PCR和蛋白质印迹法检测VEGFR mRNA的表达;以MTT比色法测定活细胞数并绘制细胞生长曲线.同时,制备裸鼠CW2细胞移植瘤模型,注射腺病毒后,每天观察肿瘤生长情况.应用免疫组化法检测微血管密度(MVD).结果:pAd-Easy/VEGFR重组腺病毒成功构建,转染效率为99.7%.RT-PCR、 Western印迹实验结果显示转染pAd-Easy/VEGFR后,VEGFR的表达明显被抑制.细胞生长曲线表明,重组载体转染后细胞生长明显减缓.体内实验表明,pAd-Easy/VEGFR治疗后肿瘤生长慢并伴有较低的MVD.结论:pAd-Easy/VEGFR介导的VEGFR shRNA能有效抑制CW2细胞中VEGFR的表达,并能抑制肿瘤生长.     

血管内皮生长因子干扰RNA对人鼻咽癌CNE一2Z细胞VEGF表达调控的实验研究

目的：研究血管内皮生长因子（VEGF）的特异性小片段干扰RNA（siRNA）对低分化人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGF表达的抑制作用，为鼻咽癌的治疗提供新的途径。方法：体外培养人鼻咽癌细胞CNE-2Z，并分成正常氧状态培养组（20％）和低氧（1％）培养组。采用脂质体（LF2000）将VEGF siRNA转染两组细胞，并采用RT—PCR、ELISA检测鼻咽癌细胞在正常氧状态和低氧状态下VEGF mRNA和蛋白质表达的差异。结果：与未转染组和转染空载体组相比，在正常氧和低氧状态下，VEGFsiRNA均能明显抑制VEGFmRNA的表达（P〈0．01）；正常氧状态下VEGFsiRNA的抑制效率比低氧状态高。正常氧状态下：未转染组、转染空载体组、转染VEGFsiRNA组CNE-2Z细胞培养上清液中VEGF165的含量分别为：423．92、419．68和328．86pg／mL；低氧状态下VEGF165的含量分别为：813．62、799．89和500．96pg／mL，转染VEGF siRNA组VEGF的表达下调。结论：VEGF siRNA能有效地、特异地抑制人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGF mRNA和蛋白质的表达，因而有望成为治疗鼻咽癌的一种有效方法。     

姜黄素对人结肠癌Lovo细胞VEGF表达的影响

目的 研究姜黄素体外对人结肠癌Lovo细胞血管内皮生长因子VEGF表达的影响。方法不同浓度（0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L）姜黄素处理2013年8月—2014年2月中南大学提供的人结肠癌细胞株Lovo24 h后,用Real-time PCR检测姜黄素对人结肠癌细胞株血管内皮生长因子VEGF m RNA表达的变化,用Western blot法检测姜黄素对人结肠癌细胞株VEGF蛋白表达的变化。结果人结肠癌Lovo细胞经过姜黄素处理24 h后,5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L姜黄素组VEGF m RNA及蛋白的表达均明显下降,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论姜黄素能下调人结肠癌Lovo细胞VEGF的表达,并呈剂量依赖,这可能是姜黄素抑制结肠癌Lovo细胞增殖及侵袭性的机制之一。     

RNA干扰抑制视网膜母细胞瘤细胞血管内皮生长因子的表达

目的利用RNA干扰（RNAi）技术,研究血管内皮生长因子（VEGF）编码基因的siRNA对人视网膜母细胞瘤（RB）细胞的影响,从而探讨通过抑制血管内皮生长因子在视网膜母细胞瘤组织中的表达来治疗视网膜母细胞瘤的机理。方法将VEGF编码基因特异的siRNA转染入视网膜母细胞瘤细胞,采用RT PCR和Western blot技术检测siRNA处理前后RB细胞VEGF基因表达变化。MTT法检测siRNA处理前后RB细胞生长的抑制情况。结果RT PCR和Western blot均显示VEGF特异性siRNA对视网膜母细胞瘤细胞血管内皮生长因子基因的表达有抑制作用,MTT法检测RB细胞生长的抑制情况显示,抑制率可达40%。结论VEGF特异性siRNA的特异性基因沉默作用对RB细胞VEGF基因的表达有抑制作用。     

血管内皮生长因子RNA干扰效应对鼻咽癌生长的影响

目的 研究RNA干扰（RNA interference）效应对人鼻咽癌低分化上皮细胞株CNE血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）基因表达及肿瘤生长的抑制作用.方法 体外转录试剂盒合成VEGF siRNA;荧光素标记试剂盒标记siRNA;脂质体法将siRNA转入CNE细胞株.荧光显微镜下观察siRNA的转染效率;ELISA检测siRNA对VEGF蛋白表达的抑制作用;用VEGF siRNA转染过的CNE细胞注射入裸鼠,监测裸鼠肿瘤的大小,并采用HE染色,光镜下观察VEGF siRNA对肿瘤组织的影响.结果 在VEGF siRNA转染后的CNE细胞株,VEGF的表达得到有效地抑制.对鼻咽癌异种移植肿瘤裸鼠内的治疗观察表明,肿瘤生长在治疗3周后显著减少,病理切片HE染色siRNA组肿瘤的坏死灶增多.结论 体外转录合成的siRNA能特异有效地下调VEGF基因的表达,提示用2＇-脱氧修饰的VEGF特定siRNA能作为一种有效的肿瘤制剂,为抗鼻咽癌基因治疗提供了新的思路.     

血管内皮生长因子干扰RNA对人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGF表达调控的实验研究

目的研究血管内皮生长因子(VEGF)的特异性小片段干扰RNA(siRNA)对低分化人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGF表达的抑制作用,为鼻咽癌的治疗提供新的途径。方法体外培养人鼻咽癌细胞CNE-2Z,并分成正常氧状态培养组(20%)和低氧(1%)培养组。采用脂质体(LF2000)将VEGFsiRNA转染两组细胞,并采用RT-PCR、ELISA检测鼻咽癌细胞在正常氧状态和低氧状态下VEGFmRNA和蛋白质表达的差异。结果与未转染组和转染空载体组相比,在正常氧和低氧状态下,VEGFsiRNA均能明显抑制VEGFmRNA的表达(P<0.01);正常氧状态下VEGFsiRNA的抑制效率比低氧状态高。正常氧状态下:未转染组、转染空载体组、转染VEGFsiRNA组CNE-2Z细胞培养上清液中VEGF165的含量分别为:423.92、419.68和328.86pg/mL;低氧状态下VEGF165的含量分别为:813.62、799.89和500.96pg/mL,转染VEGFsiRNA组VEGF的表达下调。结论VEGFsiRNA能有效地、特异地抑制人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGFmRNA和蛋白质的表达,因而有望成为治疗鼻咽癌的一种有效方法。     

RNA干扰抑制c-myc基因表达对D341细胞增殖的影响

目的探讨应用小干扰RNA（siRNA）技术抑制髓母细胞瘤D341细胞株的c-myc基因对D341细胞的生长、细胞周期及凋亡的变化。方法制备特异性针对c-myc基因的siRNA,转染D341细胞,实时定量RT-PCR、Western blot检测c-myc基因表达情况,流式细胞仪进行细胞周期及凋亡检测。结果siRNA转染D341细胞后,c-myc基因表达在转染后24h抑制效率最高,c-myc蛋白在48h抑制效率最高,并随siRNA浓度的增大,沉默c-myc基因效率增高。RNA干扰抑制D341细胞c-myc基因后,细胞生长停滞于G1期。结论针对c-myc基因的siRNA对D341细胞c-mycmRNA及蛋白有明显抑制作用,细胞生长受到抑制,有望成为髓母细胞瘤的新的治疗途径。     

MMP-2、MMP-9及VEGF在结肠癌中的表达及其与肿瘤转移的相关性

目的探讨基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及血管内皮生长因子（VEGF）在结肠癌中的表达,并分析其与肿瘤转移的相关性。方法 86例经病理证实的结肠癌患者,采用免疫组化SP法检测MMP-2、MMP-9及VEGF在结肠癌组织及正常结肠组织中的表达,分析三者间的相关性及其与肿瘤转移的相关性。结果结肠癌组织中MMP-2、MMP-9及VEGF表达水平及阳性率均显著高于正常结肠组织（P〈0.05、0.01）,其中有淋巴结转移的结肠癌组织中MMP-2、MMP-9及VEGF阳性表达率高于无淋巴结转移者（P〈0.05）;MMP-2、MMP-9与VEGF表达之间呈显著正相关（r=0.72,P〈0.05）。结论结肠癌组织中MMP-2、MMP-9及VEGF高表达与肿瘤转移密切相关,三者可作为反映结肠癌进展的重要指标,为判断患者的预后提供依据。     

特异性基因沉默对Machado-Joseph病ATXN3变异表达的抑制作用

目的 利用RNAi技术,观察不同siRNA在体外对Machado-Joseph病变异基因表达的抑制作用,为其应用于临床打下基础。方法 本研究分为变异型ATXN3组、野生型ATXN3组及空病毒载体组(对照组)。通过设计针对ATXN3变异基因的特异性siRNA,构建重组型慢病毒载体转染HEK293T细胞,采用Real-time PCR及Western blot检测ATXN3 mRNA和蛋白的表达水平,从而对siRNA体外抑制Machado-Joseph病变异基因的效果进行评估。结果 Real-time PCR分析表明,在共转染表达人变异型ATXN3基因和siRNA ATXN3 Mut载体的细胞中,变异型ATXN3组中ATXN3 mRNA的表达较对照组明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),而野生型ATXN3组中ATXN3 mRNA的表达较对照组仅轻微下降,差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot结果表明,与对照组比较,变异型ATXN3组ATXN3蛋白表达被siRNA ATXN3 Mut 1~4明显抑制,差异有统计学意义(P<0.05),野生型ATXN3组中ATXN3蛋白表达仅被siRNA ATXN3 Mut 1~4轻度抑制。结论 特异性siRNA可以选择性沉默变异型ATXN3,说明RNAi是Machado-Joseph病治疗的潜在方向。     

内皮抑素和血管内皮生长因子在喉鳞癌和声带息肉中的表达及意义

目的 探讨内皮抑素和血管内皮生长因子(VEGF)在喉癌和声带息肉中的表达及意义。方法 用免疫组化法检测48例喉癌和20例声带息肉患者手术切除标本内皮抑素和VEGF的表达。结果 ①喉癌组织中内皮抑素的高表达率和VEGF的阳性表达率分别为62．5％和68．8％。内皮抑素和VEGF呈正相关(P=0．005)，在有颈淋巴结转移的喉癌标本中内皮抑素高表达率和VEGFP阳性表达率明显高于非转移组(P=0．012)；②声带息肉中VEGF无表达，内皮抑素表达低于喉癌组织，二者无相关性。结论 内皮抑素和VEGF的表达可作为预测喉癌患者的预后因素。     

Effects of shRNA Targeting VEGF on VEGF mRNA Expression in Gastric Cancer Cells

In order to investigate the inhibitory effect of plasmid-mediated short hairpin RNA tar-geting vascular endothelial growth factor (VEGF) on the expression of VEGF mRNA in human gas-tric cancer cells, a plasmid vector for transcribing specific short hairpin RNA targeting VEGF ( pU6-VEGF ) was constructed, and then transfected into human gastric cancer cells using Lipofec-tamine2000. The VEGF mRNA expression level was detected by RT-PCR. RPMI1640 was used for blank control, and pSilencer 1.0-U6 empty plasmid for the negative control. Results showed the clone and sequence analysis revealed that the recombinant plasmid vector of pU6-VEGF was successfully constructed. The VEGF mRNA expression levels in blank control group, experimental group (pU6-VEGF) and negative control group (pSilencer1.0-U6) were 100%, 49% and 94%, respectively, indicating VEGF mRNA expression in the cells transfected with pU-VEGF vector was inhibited sig-nificantly as compared with blank control group and negative control group. It was concluded that the short hairpin RNA could significantly inhibit the expression of VEGF mRNA, which provided an experimental basis for treating human cancer with anti-angiogenesis.     

斑蝥酸钠对人肝癌细胞HepG2的增殖作用及血管内皮生长因子表达的影响

目的研究斑蝥酸钠对人肝癌细胞的增殖作用及其对血管内皮生长因子(VEGF)的表达的影响,探讨斑蝥酸钠抗肿瘤的作用机制。方法体外培养人肝癌细胞株(HepG2),用不同浓度的斑蝥酸钠作用于肝癌细胞,采用MTT法观察不同浓度和作用时间下斑蝥酸钠对细胞增殖的影响,采用免疫组化法检测血管内皮生长因子的表达情况。结果在一定浓度范围内斑蝥酸钠对肝癌细胞有明显增殖抑制作用,且降低了VEGF的分泌水平,并呈时间-剂量依赖关系。结论斑蝥酸钠对肝癌细胞的增殖有抑制作用,且减低了细胞内血管内皮生长因子蛋白的表达,表明斑蝥酸钠在抑制肝癌生长的作用机制之一是通过抑制肿瘤血管生成发挥作用的。     

人血管内皮生长因子mRNA靶向siRNA表达载体的构建和表达

目的:构建人血管内皮生长因子(VEGF)mRNA靶向siRNA表达载体,观察其表达情况.方法:设计人VEGF靶向的发夹样siRNA,依据设计,合成2条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSUPERneo-GFP载体,转化扩增后得到重组载体pSUPERneo-GFP-siVEGF,进行序列测定.用脂质体转染法将重组载体转染食管癌细胞株Eca109,采用RT-PCR检测转染细胞VEGF mRNA的表达水平. 结果:经过酶切鉴定与测序,pSUPERneo-GFP-siVEGF构建成功.稳定转染该重组体的Eca109细胞VEGF mRNA表达水平明显降低.结论:成功构建了针对VEGF mRNA的siRNA载体, 转染细胞后可显著抑制VEGF mRNA的表达.