华支睾吸虫重组蛋白应用于ABC-ELISA检测特异性循环抗体的研究

目的 评价重组蛋白在华支睾吸虫病诊断上的价值，探索以重组蛋白替代天然抗原用于ELISA等血清学方法诊断华支睾吸虫感染的可能性。方法 分别使用重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶(CysB)与华支睾吸虫成虫可溶性抗原(CAA)，以ABC-ELISA检测华支睾吸虫病、其它寄生虫感染及健康人血清特异性IgG．比较两种抗原用于检测的敏感性与特异性。结果 共检测了112份华支睾吸虫感染血清，使用重组抗原CysB与成虫粗抗原CAA的阳性检出率分别为92．9％(104／112)及94．6％(106／112)；分别检测健康人血清56例、日本血吸虫病血清20例及肺吸虫病血清10例．对于两种抗原，华支睾吸虫特异性IgG检测阴性率均相同．上述三类血清的阴性率分别为96．5％(54／56)、95％(19／20)及90％(9／10)。结论 华支睾吸虫重组蛋白CysB用于血清特异性抗体检测具有较高的敏感性及特异性，与成虫可溶性抗原(CAA)的诊断应用价值相近，有望成为应用于华支睾吸虫病诊断的替代抗原之一。     

华支睾吸虫染色体组型的初步研究

本文以华支睾吸虫的精原细胞和卵原细胞为材料,分析了该虫的染色体组型。结果表明其染色体数目,2n=14,n=7。核型的组成是:大型染色体4个,小型染色体10个,可配成7对。根据染色体的大小、形态和着丝粒的位置可分成两组:第一组第1号染色体为大型亚中部或中部着丝粒染色体,第2号染色体为大型亚中部着丝粒染色体;第二组第3～7号染色体为五对小型亚端部着丝粒染色体。     

华支睾吸虫分泌排泄蛋白诱导宿主细胞自噬参与致病的分子机制

目的 探讨华支睾吸虫分泌排泄蛋白（Cs ESP）诱导宿主细胞自噬参与致病的机制。方法 建立华支睾吸虫感染的小鼠模型,分为感染组和对照组,感染组每鼠经口灌胃囊蚴50个,对照组每鼠灌入等体积生理盐水。体外培养人肝星状细胞LX-2,采用不同浓度Cs ESP(0、1、5、10、20、30、50μg/mL)刺激LX-2细胞,Western blot检测感染组和对照组中小鼠肝组织及活化的LX2细胞中自噬相关分子微管相关蛋白1轻链3(LC3B)和自噬相关蛋白16L1(ATG16L1)的蛋白水平。采用Cs ESP与自噬抑制剂三甲基腺嘌呤（3-MA）、氯喹（CQ）或自噬诱导剂Earle’s平衡盐溶液（EBSS）、雷帕霉素（Rapamycin）共同刺激LX-2细胞,分为Control（正常细胞）组、二甲基亚砜（DMSO）组、Cs ESP(50μg/mL)+3-MA(10 mmol/L,预处理2 h)组、3-MA(10 mmol/L)组、Cs ESP(50μg/mL)+CQ(30μmol/L,预处理8 h)组、CQ(30μmol/L)组、Cs ESP(50μg/mL)+EBSS（预处理3 h）组、EBSS组...     

不同剂量的华支睾吸虫囊蚴感染大鼠的实验研究

目的观察不同剂量的华支睾吸虫囊蚴感染后大鼠粪便中虫卵检出率及肝组织的病理变化.方法分离采自疫区麦穗鱼体内的囊蚴,分别以50、100和200个囊蚴经口感染3组大鼠,同时设对照组.生理盐水涂片法检查大鼠粪便中虫卵,虫卵检出率达100%时宰杀动物,取肝脏作组织切片.结果感染组大鼠感染后第20d粪便虫卵检出率为78.8%;第30d为90.9%;第40d为96.9%;第45d检出率为100%.对照组均未检出虫卵.结论感染后第45d虫卵检出率达高峰;200个囊蚴可作为动态观察宿主状态的感染剂量.     

抗华支睾吸虫抗体Fab段基因的克隆及重组表达载体的构建

为了制备抗华支睾吸虫基因工程抗体,本文从感染华支睾吸虫患者的淋巴细胞中提取总RNA,逆转录成cDNA。用相应的引物进行PCR,扩增出约700bp的重链Fd段和轻链κ、λ基因,经Xho　I和Spe　I,SacI和 Xba　I双酶切后,分别和质粒载体pComb3连接,再经电穿孔转化大肠杆菌XL 1-blue菌株,将轻链和重链Fd基因先后克隆人pComb3中,成功地构建了抗华支睾吸虫Fab段抗体基因的表达载体,为进一步构建噬菌体抗体库奠定基础。     

左旋吡喹酮对体内华支睾吸虫作用的超微结构研究

采用抗血吸虫新药左旋吡喹酮治疗大鼠实验性华支睾吸虫病,对检获的华支睾吸虫成虫进行光镜和电子显微镜观察.发现本药对华支睾吸虫皮层的严重损害是其重要的杀虫方式之一.本研究结果为临床和现场应用左旋吡喹酮治疗华支睾吸虫病提供了依据.     

华支睾吸虫感染兔模型治疗前后抗体消长规律的研究

目的 通过对华支睾吸虫感染兔模型的研究,了解有效治疗前后血清抗体的消长规律,为探讨特异性抗体检测用于疗效考核的价值提供参考.方法 自感染的鱼体分离华支睾吸虫囊蚴,经口感染7只家兔,14周后给予吡喹酮治疗,使用SPA-ELISA法检测感染及治疗前后血清IgG抗体,观察针对华支睾吸虫粗抗原的抗体消长规律.结果 7只实验兔均感染成功,抗体水平在感染后2～4周内显示不同程度的上升,至第4周均达较高水平,8～12周继续上升至峰值(0.143～0.307).经过有效驱虫治疗,特异性抗体水平总体上呈现下降趋势,大部分兔(71.4%)在治疗5周后下降显著.到死亡或饲养结束,71.4%的实验兔A值降至0.1以下,为感染前的1.28～1.80倍.此外,解剖观察显示,完全驱虫治疗7或10个月后的3只兔肝仍可见病理性结节.结论 华支睾吸虫感染后IgG抗体水平的上升较早,部分兔感染后约2周就有明显上升,使用高敏感度的抗体检测方法有助于对部分感染者进行早期诊断、早期治疗.有效驱虫治疗后,大部分实验动物显示抗体水平先快速后缓慢下降的规律,血清抗体滴度的动态观察具有一定的疗效考核价值.此外,本研究显示单纯驱虫治疗并不能使华支睾吸虫感染动物的肝脏病理改变很快恢复,提醒我们在防治工作中须重视该寄生虫寄生所引起的长期肝脏损害,将预防感染放在第一位的同时,对感染者的治疗应联合使用肝脏康复药物.     

血脂水平与华支睾吸虫致病性的初步研究

目的比较高血脂小鼠和正常血脂小鼠感染华支睾吸虫后的肝脏病理变化及炎症因子水平,以研究血脂水平对华支睾吸虫致病性的影响。方法通过向BALB/c小鼠投食高脂饲料建立高血脂小鼠模型,用相同囊蚴数感染高血脂小鼠和正常血脂小鼠,比较感染1个月后小鼠相关病理指标。通过Masson染色(Masson′s trichrome staining)判断肝胆纤维化程度,使用免疫组化和实时荧光定量PCR(qPCR)检测肝脏α-平滑肌蛋白(α-SMA)定位情况和转录水平,用流式细胞术检测小鼠脾细胞在刀豆素(ConA)刺激48 h培养上清中细胞因子表达水平。结果与正常血脂感染组小鼠相比,高血脂感染组小鼠出现较显著的肝胆管扩张、肝实质及汇管区出现大量的胶原纤维增生、小胆管增生等病变。高血脂感染组α-SMA转录水平升高,并在肝脏组织汇管区及增生的纤维间隔内表达。高脂感染组脾细胞培养上清中白介素6(IL-6)和IL-10表达水平比正常血脂小鼠高(P0.05),高脂感染组IFN-γ水平比高脂未感染组低(P0.05)。结论高血脂可能使华支睾吸虫感染所致的肝脏胶原纤维增生、胆管扩张更明显,血脂水平高低还可影响华支睾吸虫感染后宿主的免疫应答。     

TLR4在华支睾吸虫感染致小鼠肝纤维化作用的研究

目的探讨TLR4基因在华支睾吸虫感染小鼠致肝纤维化中的作用。方法建立感染华支睾吸虫C3H/HeN(TLR4野生型)与C3H/HeJ(TLR4基因突变型)小鼠模型,在感染后1d、7d、2W、4W、8W、12W取小鼠肝脏,切片并进行HE和Masson染色,观察病理变化。结果 C3H/HeN小鼠肝脏大体病变从2W开始,随感染时间延长而加重;C3H/HeJ小鼠从2W开始,4W加重,至8W已明显减轻。观察HE、Masson染色肝脏切片示随感染时间的延长,C3H/HeN小鼠前期肝纤维化逐渐加重,至8W起趋于稳定;2W~12W纤维化评分均高于感染前(P0.01)。C3H/HeJ小鼠肝纤维化评分2W升高,4W达高峰并显著高于感染前(P0.01),至8W明显下降。与C3H/HeN比较,感染后2W、4W、8W、12W C3H/HeJ小鼠肝纤维化程度轻(P0.01)。感染后7d,C3H/HeN小鼠的HE染色切片上可见嗜酸性粒细胞,4W达高峰,此后明显减少。感染后2W、4W、8W,C3H/HeJ小鼠嗜酸性粒细胞较C3H/HeN小鼠少(P0.05)。结论 TLR4基因缺失可能在华支睾吸虫感染致肝纤维化过程起一定的阻制作用,从而减缓肝纤维化的进程。     

华支睾吸虫钙调节蛋白的生物学特性及与肝纤维化的关系

目的对华支睾吸虫成虫（Clonorchis sinensis, Cs）钙调节蛋白（CaM）进行生物学及功能分析,以确定其在肝纤维化中的作
用。方法从Cs cDNA质粒文库中寻找CsCaM全长序列,以BLASTx搜索其同源序列并进行比对分析。以生物信息学进行同
源比对、理化性质分析及功能域预测。以分子生物学方法进行原核克隆,大肠杆菌表达,亲和层析纯化,并将纯化蛋白免疫大
鼠,产生多克隆抗体。ELISA检测CsCaM抗体滴度及产生曲线。免疫印迹实验分析CsCaM重组蛋白纯化及其抗体识别效果。
免疫组化分析其组织定位;腹腔注射法建立CsCaM致大鼠肝纤维化模型。结果重组、表达及纯化了CsCaM,其编码150 位
氨基酸,理论相对分子质量23 400。结构域预测其具有EF手位模序。pET-30a-CsCaM重组质粒其目的蛋白表达于宿主菌
BL21 E. coli上清,相对分子质量约23 400。总IgG抗体滴度于2~4 周达较高峰,效价大于1∶51 200。免疫组织化学定位显示
CsCaM在成虫睾丸表达丰富。CsCaM腹腔注射大鼠的肝脏均显示不同程度病变,HE染色可见炎症反应较严重,可见气球样
变、门管区炎及碎片状坏死;网状纤维染色显示小胆管周围胶原增生,有轻到中度纤维化。结论CsCaM促进大鼠肝脏炎症病变
及纤维化的作用,提示其可能参与了华支睾吸虫病致肝纤维化的作用。
     

MicroRNA-133表达对人胆管癌细胞QBC939迁移和侵袭的影响

目的 探讨MicroRNA-133(miR-133)表达对人胆管癌细胞QBC939迁移、侵袭的影响,探寻其中可能存在的分子机制.方法 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测人胆管癌细胞QBC939 miR-133各亚型的表达,选择适合的亚型进行实验.将人胆管癌细胞QBC939分为3组:干扰组(转染miR-133...     

长链非编码RNA CCAT1对人乳头状甲状腺癌侵袭和迁移能力的影响

目的检测长链非编码RNA CCAT1在人乳头状甲状腺癌中的表达,并观察下调表达CCAT1对人乳头状甲状腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响。方法检测人正常甲状腺细胞Nthy-ori 3-1及人乳头状甲状腺癌细胞TPC-1中CCAT1的水平,在TPC-1细胞中转染CCAT1 siRNA质粒,利用Transwell小室及划痕实验观察下调表达CCAT1对细胞侵袭和迁移能力的影响,通过Western blot检测BRAF、MUC15、RKIP蛋白的变化。结果人乳头状甲状腺癌细胞TPC-1中CCAT1的水平明显高于人正常甲状腺细胞Nthy-ori 3-1;在TPC-1细胞中下调表达CCAT1后能够明显抑制细胞的侵袭和迁移能力;Transwell侵袭实验和迁移实验显示下调表达CCAT1组TPC-1细胞的穿膜数与对照组比较明显减少。划痕实验中下调表达CCAT1后细胞间距较对照组明显增大,提示细胞运动能力减弱。同时下调表达CCAT1可明显降低细胞中BRAF、MUC15的表达,增高RKIP蛋白的表达。结论人乳头状甲状腺癌中长链非编码RNA CCAT1较正常甲状腺细胞明显升高;在乳头状甲状腺癌中下调表达CCAT1可抑制细胞的侵袭、迁移运动能力,并且可能通过影响BRAF、MUC15、RKIP蛋白的表达发挥上述功能。     

重组质粒pEGFP-N1-EMMPRIN对胃癌SGC-7901细胞侵袭和迁移的影响

目的 构建人细胞外金属蛋白酶诱导因子（EMMPRIN）重组质粒,观察其在胃癌SGC-7901细胞中的表达及对细胞侵袭和迁移的影响。方法 从结肠癌细胞株SW-480中提取总RNA,通过RT-PCR获得EMMPRIN基因,连接至载体pEGFP-N1,构建重组质粒pEGFP-N1-EMMPRIN,通过脂质体Lipofectamine 2000转染胃癌SGC-7901细胞;RT-PCR和Western blotting分别检测EMMPRIN mRNA和蛋白在SGC-7901细胞中的表达,Transwell实验检测EMMPRIN对SGC-7901细胞侵袭和迁移的影响。结果 重组质粒pEGFP-N1-EMMPRIN构建成功,并在SGC-7901细胞中表达,RT-PCR和Western blotting检测示转染后SGC-7901细胞中EMMPRIN mRNA和蛋白表达均增加,Transwell实验检测示转染后SGC-7901细胞的侵袭和迁移能力均显著增强。结论 EMMPRIN可显著增强肿瘤细胞的侵袭与迁移能力。     

MicroRNA-338-3p通过下调SMO表达抑制结直肠癌细胞的侵袭与迁移

目的 探讨microRNA-338-3p (miR-338-3p)对结直肠癌细胞侵袭与迁移能力的影响及其调控机制.方法 脂质体分别转染miR-338-3p前体(pre-miR-338-3p)和miR-338-3p特异性抑制剂(miR-338-3p-inhibitor)至人结直肠癌SW620及SW480细胞系中,应用实时荧光定量PCR(Real-time RT-PCR)检测细胞中miR-338-3p表达状况,运用半定量RT-PCR及Westernblot分析Smoothened(SMO)mRNA及蛋白表达状况,Transwell侵袭、迁移实验检测转染前后细胞体外侵袭迁移能力;在经anti-SMO-siRNA预先处理的SW480细胞中转染miR-338-3p-inhibitor,检测转染细胞中SMO蛋白的表达变化以及侵袭能力的改变.结果 通过生物信息学网站预测SMO可能是miR-338-3p的作用靶基因;SW620细胞中miR-338-3p表达水平较SW480细胞减低,而SMO蛋白增高.转染pre-miR-338-3p至SW620细胞,miP-338-3p表达上调,SMO蛋白表达降低,且肿瘤细胞的侵袭及迁移能力下降;而转染miR-338-3p-inhibitor至SW480细胞后,miR-338-3p表达下降,SMO蛋白表达上升,肿瘤细胞侵袭、迁移能力增强,且此种增强效应可被an-ti-SMO-siRNA所部分逆转,说明miR-338-3p确实是通过抑制SMO而发挥抗癌作用.结论 MiR-338-3p通过下调SMO表达而抑制结直肠癌细胞侵袭与迁移.     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3的免疫诊断价值评估

目的探讨重组日本血吸虫信号蛋白14-3-3（rSj14-3-3）间接ELISA用于血吸虫病免疫诊断的价值。方法表达并利用纯化的rSj14-3-3建立间接ELISA法，比较其与可溶性虫卵抗原（SEA）ELISA和间接血凝试验（IHA）检测急慢性日本血吸虫病患者的阳性率及其它寄生虫患者和正常人血清的交叉反应。结果rSj14-3-3-ELISA、SEA-ELISA和IHA3种方法的敏感性分别为90．8％、94．2％和90．0％，特异性分别为87．0％，84．8％和84．8％，差异无显著性（P〉0．05）。结论rSj14-3-3抗原间接ELISA法具有可用于日本血吸虫病免疫诊断的价值。     

14-3-3σ蛋白在人类恶性肿瘤中的研究进展

14-3-3蛋白是高度保守的可溶性酸性蛋白家族,近年的研究表明,它们在细胞有丝分裂、生长、分化、增殖和死亡等过程中起重要的调控作用。其中14-3-3σ主要存在于上皮细胞,具有组织特异性,可以与细胞内多种信号蛋白相互作用,促进DNA损伤后的细胞周期G2期阻滞,调控细胞的生长、分化和增殖等多种生物学功能,在肿瘤发生发展过程中表达异常,可能由p53突变或启动子CpG岛超甲基化引起,与人类恶性肿瘤的发生发展及预后密切相关。该文作者仅就14-3-3σ蛋白在人类恶性肿瘤中的研究进展作一综述。     

MiR-671-5p通过负向调控SMAD3抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭

目的 探讨miR-671-5p影响骨肉瘤的迁移侵袭的相关机制。方法 通过NCBI在线数据库筛选骨肉瘤中差异表达的微小RNA（miRNA）、预测miRNA的靶蛋白并进行功能分析;实时荧光定量PCR（qRT-PCR）用于检测转染过表达miR-671-5p质粒后con组和miR-671-5p组骨肉瘤细胞中miR-671-5p的表达情况;通过Transwell实验检测转染质粒后骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力;Western blot实验检测相关蛋白在骨肉瘤细胞中的表达情况;荧光素酶报告基因检测重组人SMAD家族成员3（SMAD3）的 3’UTR中是否含有miR-671-5p的结合位点。结果 MiR-671-5p在骨肉瘤组织和细胞中表达下调（P<0.05）。qRT-PCR证明转染过表达miR-671-5p质粒后,细胞转染成功（P<0.05）。过表达骨肉瘤细胞中的miR-671-5p后细胞的迁移和侵袭能力明显降低（P<0.05）,并且miR-671-5p能够抑制骨肉瘤细胞的上皮间质转化（EMT）（P<0.05）;Western blot结果显示SMAD3在骨肉瘤细胞中表达上调（P<0.05）;荧光素酶报告基因检测证实miR-671-5p与SMAD3的3’UTR之间存在结合位点（P<0.05）;Western blot结果显示转染过表达SMAD3质粒后,SMAD3表达明显升高（P<0.05）,而miR-671-5p能明显抑制SMAD3的表达（P< 0.05）;Transwell实验证明SMAD3能够促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力（P<0.05）,而miR-671-5p则能够逆转这种促进作用（P<0.05）。结论 MiR-671-5p能够通过负向调控SMAD3抑制骨肉瘤细胞迁移和侵袭能力。     

合并感染华支睾吸虫对慢性乙肝患者凝血指标的影响

目的 分析乙型肝炎合并感染华支睾吸虫患者凝血相关指标的变化,为临床诊断和治疗以及预后监测提供参考价值。方法 将收集的患者标本分为6个组,分别是健康组40例、慢性乙肝组47例、慢性乙肝肝硬化组47例、单纯感染华支睾吸虫组40例、慢性乙肝合并感染华支睾吸虫组30例及慢性乙肝肝硬化合并感染华支睾吸虫组27例,并检测凝血4项指标做统计分析,比较各组之间凝血指标的变化差异。结果 与健康组相比,单纯华支睾吸虫组的纤维蛋白原（FIB）水平升高,凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）指标延长,同时乙肝感染组及合并感染组的凝血酶时间（TT）、PT、APTT指标延长,FIB指标下降,差异有统计学意义（P<0.05）;与慢性乙肝组相比,慢性乙肝肝硬化组与合并感染乙肝组的PT、APTT、TT指标延长,FIB指标水平下降,差异有统计学意义（P<0.05）;同时与慢性乙肝肝硬化组和合并感染乙肝组相比,合并感染乙肝肝硬化组的PT、APTT、TT指标显著延长,FIB指标水平显著下降,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 合并感染华支睾吸虫会进一步加重乙肝患者的凝血功能障碍,影响疾病的治疗和预后,并且慢性乙肝患者随着疾病的进展至肝硬化会加重凝血功能发生障碍。因此,在治疗乙肝患者的同时要警惕是否有华支睾吸虫的感染,以进一步指导临床用药和监测预后。     

DCLK1敲除对食管鳞癌细胞迁移和侵袭能力的影响

目的 研究双皮质素样激酶1（doublecortin-like kinase 1,DCLK1）的敲除对食管鳞癌细胞迁移和侵袭能力的影响及其潜在的作用机制。方法 使用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向敲除食管鳞癌细胞（Kyse450,Kyse70）的DCLK1基因。通过细胞划痕实验和Transwell实验评估DCLK1敲除对食管鳞癌细胞迁移和侵袭能力的影响。Western blotting法检测DCLK1敲除细胞系中上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关转录因子的表达变化。通过癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atla,TCGA）数据库进一步分析食管鳞癌患者（n=95）中DCLK1表达和EMT相关转录因子之间的相关性。结果 CRISPR/Cas9基因编辑技术能够有效地敲除食管鳞癌细胞系DCLK1基因并影响其表达。DCLK1缺失显著抑制食管鳞癌细胞的体外迁移和侵袭能力（P<0.05）,并上调上皮标志物E-cadherin的表达,下调间质标志物如Vimentin、ZEB1、Slug和Snail的表达（P<0.05）。另外TCGA数据库分析显示食管鳞癌患者中DCLK1与EMT相关转录因子存在相关性。结论 DCLK1敲除可通过抑制EMT进程影响食管鳞癌细胞的迁移和侵袭。     

RUNX3基因对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响

目的 研究RUNX3基因对乳腺癌细胞迁移及侵袭的影响,并探讨其分子作用机制.方法 分别用RUNX3的真核表达载体pFlag-RUNX3和对照载体pFlag-control转染乳腺癌MDA-MB-231、BT-549细胞,CCK-8细胞增殖实验检测RUNX3基因高表达后对2种乳腺癌细胞增殖的影响;细胞迁移和侵袭实验检测RUNX3基因高表达对2种乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响;人类肿瘤转移PCR芯片研究RUNX3基因高表达后乳腺癌细胞中转移相关基因的表达水平; RT-PCR和Western blot方法检测RUNX3基因表达后对2种乳腺癌细胞中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）mRNA和蛋白表达的影响;明胶酶谱实验检测RUNX3基因表达后对2种乳腺癌细胞分泌活性MMP-2的影响.结果 在2种乳腺癌细胞中过表达RUNX3能够抑制细胞的迁移和侵袭能力.在84个肿瘤转移相关基因中MMP-2受RUNX3的影响最显著.结论 RUNX3通过MMP-2通路调节乳腺癌细胞的迁移与侵袭.