EGFRvⅢ的siRNA对胶质瘤细胞凋亡和增殖的影响

目的研究EGFRvⅢ的siRNA对U87-EGFRvⅢ胶质瘤细胞中EGFRvⅢ的表达及其对细胞增殖和凋亡的影响。 方法化学方法合成特异针对EGFRvⅢ的siRNA,转染U87-EGFRvⅢ细胞后,利用半定量RT-PCR法检测细胞中EGFRvⅢ的mRNA表达,采用蛋白印迹法和免疫荧光法检测细胞中EGFRvⅢ的蛋白表达水平,MTT法检测siRNA对胶质瘤细胞增殖的作用,Annexin V-FITC/PI法检测siRNA对细胞凋亡的作用。结果RT-PCR、蛋白印迹法和免疫荧光法均可显示EGFRvⅢ siRNA可使EGFRvⅢ的基因和蛋白表达显著下降,48 h内可使蛋白含量下降(757±31)%;MTT法和Annexin V-FITC/PI检测结果显示siRNA可抑制U87-EGFRvⅢ细胞的增殖并促进其凋亡。 结论EGFRvⅢ siRNA可特异地抑制EGFRvⅢ在胶质瘤细胞中的表达,抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。     

人脑胶质瘤SHG—44cDNA文库的构建和鉴定

从人脑胶质瘤体外细胞系SHG－44中抽提总RNA，亲和纯化分离mRNA．逆转录合成cDNA，经重组连接，体外包装，感染大肠杆菌Y1090后建成的SHG－44cDNA文库，其库容量含9．25×105原代重组子，重组百分比94．9％，克隆效率为1．04×10pfu／μgcDNA．同时，以兔抗牛GFAP多抗为探针对该文库进行免疫筛选，得到了两个GFAP相关基因的cDNA克隆，在表达水平上，该cDNA文库含GFAP基因的频率为1．2×10-5，从而证实文库中有目的基因的有效表达，为与此相关的分子生物学研究提供了一个有用的工具。     

HSV—tk基因治疗人脑胶质瘤SHG44的实验研究

为了研究脑肿瘤的基因治疗，构建了含有ｐｇｋ启动子驱动的ＨＳＶ－ｔｋ基因的反转录病毒载体ｐＬＮＴＫ，并成功地对人脑胶质瘤ＳＨＧ４４细胞。经体实验证实，ＳＨＧＬＮＴＫ对阿昔洛韦（Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ，ＡＣＶ）的杀伤敏感性高于ＳＨＧ４４约１０００倍，＾３Ｈ－ＴＤＲ掺入法证实，ＡＣＶ能够明显抑制ＳＨＧＬＮＴＫ的ＤＮＡ合成。体内实验证实，ＡＣＶ可抑制ＳＨＧＬＮＴＫ细胞在裸小鼠全内的肿瘤形成，原位基因转 治疗裸     

siRNA沉默hTERT基因表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的应用小干扰RNA（small interferingRNA，siRNA）抑制乳腺癌MCF-7细胞hTERT的表达，探讨其对乳腺癌细胞增殖和凋亡的效应。方法体外化学合成针对hTERT基因的siRNA序列，在脂质体介导下转染MCF-7细胞，实时定量PCR检测hTERTmRNA表达水平，Westernblot检测hTERT蛋白表达水平，流式细胞仪检测细胞凋亡状况，MTT法检测细胞增殖活性，平板克隆形成实验检测克隆形成率。结果所设计的3对针对不同靶点的siRNA与对照组相比均可有效抑制hTERT的表达，hTERTsiRNA转染MCF-7细胞48h后，siRNAl-siRNA3组hTERTmRNA表达分别为（35．3±4．2）％、（30．7±2．8）％、（31．3±3．6）％，与阴性对照组（96．4±2．8％）相比，差异有统计学意义。MTT结果显示MCF-7细胞增殖能力显著降低，转染48h后，siRNAl～siRNA4细胞抑制率分别为（57．6±3．6）％、（61．3±4．3）％、（65．6±6．3）％和（3．1±4．5）％，细胞克隆形成能力下降，凋亡率明显增加。结论体外化学合成的hTERTsiRNA可以有效地抑制MCF-7细胞hTERT的表达，从而抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。     

RNA干扰介导EphB4基因表达下调对胶质瘤细胞系U251生长的影响

目的：探讨靶向EphB4基因的小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）对胶质瘤细胞EphB4 mRNA表达及细胞生长的影响。方法：体外化学合成针对人EphB4出基因的小干扰RNA并转染恶性胶质瘤U251细胞系后，RT-PCR法检测EphB4 mRNA表达的变化，CCK-8检测法观察RNA干扰对肿瘤细胞增殖活性的影响，FCM检测细胞周期变化，划痕实验观察细胞的迁移能力，采用Transwell小室穿膜细胞的数量来反应细胞的侵袭能力。结果：U251细胞转染siRNA-EphB4 100nmol／L后，EphB4 mRNA的表达水平下降了75．0％，细胞增殖抑制表现为剂量依赖性，FCM检测与阴性对照相比，细胞周期不同程度阻滞于亚G。期；并且细胞的迁移能力与对照组比较有所下降，Transwell小室穿膜细胞与对照组比较明显减少。结论：siRNA—EphB4能够明显靶向并抑制U251细胞中EphB4基因的表达，而EphB4基因表达下调可使U251细胞增殖受到影响，细胞周期出现凋亡峰。转染siRNA-EphB4后U251细胞的迁移和侵袭能力受到不同程度的抑制。提示抑制EphB4基因表达有可能成为胶质瘤治疗的新方法。     

外源性IFN-β基因对裸鼠SHG44胶质瘤的诱导凋亡研究

目的: 探讨β干扰素基因对人脑胶质瘤的诱导凋亡作用,以及人β干扰素裸DNA治疗人脑胶质瘤的可行性和作用机制。 方法: 建立裸鼠SHG44胶质瘤模型,用脂质体包埋法将IFN-β基因的真核表达载体pSV2IFNβ注入裸鼠皮下SHG44脑胶质瘤,观察肿瘤生长情况并计算肿瘤体积,通过免疫组化、TUNEL染色以及电镜,了解IFN-β基因诱导人脑胶质瘤细胞凋亡的作用。 结果: IFN-β在荷瘤裸鼠瘤体内获得表达,裸鼠皮下胶质瘤生长受到抑制,并诱导SHG44胶质瘤细胞凋亡。 结论: IFN-β裸DNA能够抑制人脑胶质瘤生长并诱导胶质瘤细胞凋亡,该实验为IFN-β基因治疗人脑胶质瘤的应用奠定了初步基础。     

雷公藤红素对荷SHG44胶质瘤裸鼠的抑瘤试验

背景与目的：胶质瘤是颅内常见恶性肿瘤，治疗效果一直不令人满意，本文探讨雷公藤红素治疗人脑胶质瘤的丌丁行性。方法：建立BALB／c裸小鼠SHG-44胶质瘤同种移植动物模型，将34只荷瘤裸鼠随机分为5组，空白对照组、高、中、低剂量雷公藤红素作用组、阳性对照组，采用腹腔内注射给药方法。雷公藤红素按三种浓度4mg／kg、2mg／kg、1mg／kg分组给药，每日1次，每周5天；阳性对照顺铂组按2mg／kg给药，每周两次；空白对照组只喂养不做任何处理。共给药四周。全部荷SHG44胶质瘤裸鼠于给药后第28天断颈处死并剔出肿瘤，将肿瘤组织分块处置。定期观察肿瘤生长情况测量肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线并计算抑瘤率。结果：5组荷SHG44胶质瘤裸鼠的移植瘤体积（处死后测量）比较，差异显著（F=5．519，P=0．002）；与空白对照组相比。雷公藤红素4mg／kg组、雷公藤红素2mg／kg组均能抑制肿瘤生长（P〈0．05），其体积抑瘤率分别为35％、26．9％。结论：雷公藤红素能明显抑制荷SHG44胶质瘤裸鼠的移植瘤生长，并存在剂量依赖性。     

Snail沉默和过表达对ADM诱导MDR作用的研究

目的:研究乳腺癌细胞MCF-7中Snail表达与多柔比星(ADM)诱导的多药耐药(MDR)的关系,揭示上皮-间质转化(EMT)对乳腺癌细胞多药耐药的影响.方法:构建snail真核表达载体pCDNA-Snail和RNA干扰载体pSUPER-siRNA,将载体转染乳腺癌细胞MCF-7;用多柔比星对细胞进行诱导.利用细胞毒性实验和多柔比星外排实验,对细胞的耐药状况进行评价;通过流式细胞术测量耐药细胞中P-糖蛋白(P-gP)表达,Real-Time PCR测量耐药细胞中MDR1、Snail mRNA的表达.结果:细胞毒性实验和多柔比星外排实验结果显示,细胞转染pCDNA-Snail和pSUPER-siRNA后经多柔比星诱导相对耐药指数(RR)分别为111. 3和13.7,细胞内药物荧光强度分别为9.30±0.97和87.40±9.13;Real-Time PCR显示相对于未转染细胞,转染pCDNA-Snail后MDR1,Snail mRNA的表达明显升高,P＜0.01,P-gp表达也显著升高,P＜0.01;转染pSUPER-siRNA细胞则出现相反变化(P＜0.01).结论:Snail沉默和过表达分别使乳腺癌细胞的耐药能力降低或升高.     

siRNA介导的STAT3基因沉默对宫颈癌HeLa细胞凋亡和化疗敏感性的影响

目的:应用siRNA介导的STAT3基因沉默,研究其对HeLa细胞凋亡和化疗敏感性的影响.方法:体外合成靶向STAT3的siRNA-1和siRNA-2,并用脂质体转染HeLa细胞,RT-PCR检测干扰STAT3 mR-NA敲减的效率,蛋白质印迹法检测敲减后STAT3蛋白的表达;通过记录生长曲线观察干扰后细胞的增殖情况.用AnnexinV/PI双染,结合流式细胞仪检测细胞早期凋亡率.MTT法检测肿瘤细胞对几种化疗药物的敏感性.结果:siRNA使STAT3表达下调,mRNA水平抑制率为74.8%和60.4%;蛋白表达水平抑制达68.0%和59.0%.干扰后HeLa细胞增殖缓慢,早期凋亡率明显增加.对顺铂、长春瑞滨和吉西他滨有增敏作用.结论:siRNA介导的STAT3沉默可以抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖,诱导凋亡,增加对化疗药物的敏感性,可望成为一种新的治疗策略.     

siRNA沉默DNA聚合酶β基因对胃癌BGC-823细胞增殖的影响

目的:观察siRNA沉默DNA聚合酶β(DNA polymerase β,pol β)基因后对胃癌BGC-823细胞增殖的影响.方法:用实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative PCR,RFQ-PCR)和Western印迹法检测先前构建好的转染不同siRNA载体的各组细胞中pol β mRNA和蛋白质表达水平,用FCM法和裸鼠体内成瘤实验检测各组细胞的增殖情况.结果:转染pol β靶向siRNA的BGC-823细胞中pol β mRNA和蛋白质表达水平均明显降低,且siRNA载体pRNAT-U6.1-sipolβ2(抑制程度83%)的沉默抑制作用强于siRNA载体pRNAT-U6.1-sipolβ1(抑制程度56%);与无关siRNA对照组、空载体对照组和空白对照组相比,转染pRNAT-U6.1-sipolβ1组细胞的S期比例及细胞增殖速度明显下降,而转染pRNAT-U6.1-sipolβ2组细胞的S期比例以及细胞增殖则明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05).结论:DNA pol β高表达和近乎完全抑制的超低水平表达都不利于维持细胞的生理状态;BGC-823细胞中pol β表达通过siRNA沉默到合适的低水平,对肿瘤的生长可以起到抑制作用.     

X射线诱导C6胶质瘤细胞凋亡的研究

目的：探讨X射线能否诱导胶质瘤细胞凋亡及剂量-效应关系。方法：用不同剂量X射线照射细胞，并分别在不同时间段用倒置显微镜、电镜观察形态变化；DNA凝胶电泳观察阶梯状条带形成；流式细胞仪检测凋亡峰及细胞凋亡百分率。结果：20Gy照射后48h观察组细胞凋亡率最高(38．49％)。结论：放射可诱导胶质瘤细胞凋亡，20Gy的照射剂量对胶质瘤有最强的诱导凋亡作用，但不存在时间效应关系。     

RNAi沉默β-arrestin2基因对人乳腺癌Bcap37细胞凋亡的影响

目的:通过体外实验观察β-arrestin2的小分子干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）对人乳腺癌Bcap37细胞凋亡的影响。方法:针对β-arrestin2基因设计siRNA序列,克隆到空载体PGPU6/GFP/Neo,转化DH5α菌株,提取质粒,进行测序分析。在脂质体lipofectamineTM2000的介导下转染Bcap37细胞,同时转染空白对照组及阴性对照组。转染后用定量Western blot 检测Bcap37细胞β-arrestin2蛋白的表达情况,流式细胞仪检测Bcap37细胞的凋亡情况。结果:我们的研究表明,β-arrestin2的siRNA能有效下调β-arrestin2的表达,与对照组相比,β-arrestin2干扰组β-arrestin2的表达明显下降（P＜0.05）;β-arrestin2干扰组Bcap37细胞凋亡率显著高于对照组。结论:β-arrestin2干扰组能有效降低β-arrestin2的表达,有效促进Bcap37细胞凋亡;β-arrestin2可能成为乳腺癌基因治疗的一个新靶点。     

siRNA沉默人组织因子基因对大肠癌侵袭转移能力影响的观察

目的:应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)的手段抑制人类结肠癌细胞内组织因子(tissue factor,TF)基因表达,从而探讨对其侵袭转移能力的影响.方法:首先构建携带有针对TF基因有效的siRNA序列的真核细胞表达质粒pSU-PER-TF,用此质粒转染人类结肠转移癌细胞系LoVo,应用RT-PCR和蛋白质印迹法从RNA及蛋白质水平检测证实细胞内源性TF基因被敲减后的表达水平变化,通过Matrigel体外侵袭实验进一步考证对细胞侵袭转移能力所造成的影响.结果:RT-PCR及蛋白质印迹法结果显示,与转染pSUPER质粒的LoVo细胞相比,转染重组干扰质粒pSUPER-TF-1的细胞其内源性TF基因的表达水平被显著敲减.Matrigel体外侵袭实验证实,转染pSUPER质粒的LoVo穿膜细胞均数为(220±7.0)个,而转染pSUPER-TF-1质粒的LoVo穿膜细胞均数为(102±4.0)个,两组差异有统计学意义,t=25.293,P=0.008.结果表明,转染pSU-PER-TF-1质粒的LoVo细胞侵袭转移能力显著下降.结论:以TF基因作为靶点应用RNA干扰技术敲减其表达可以明显降低LoVo细胞体外侵袭转移能力,为结肠癌的临床治疗提出新的思路,可以作为结肠癌治疗的一个新靶点.     

siRNA沉默livin的表达对人结肠癌HT-29细胞增殖、凋亡及侵袭的影响

目的:探讨小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)沉默人结肠癌HT-29细胞livin表达对HT-29细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。方法:合成靶向livin的双链siRNA(livin-siRNA),转染HT-29细胞,RT-PCR及Western blotting检测HT-29细胞中livin mRNA及蛋白的表达,MTT实验检测HT-29细胞的增殖,流式细胞术检测HT-29细胞周期分布及凋亡,细胞侵袭实验检测HT-29细胞侵袭性的变化,caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3活性的变化。结果:Livin-siRNA转染后48 h,与空白组、阴性对照组及脂质体组相比,livin-siRNA转染组HT-29细胞中livin mRNA水平明显下降(0.073±0.007 vs 0.395±0.082、0.423±0.025、0.418±0.032,P<0.05),其蛋白表达也明显下调(0.106±0.003 vs 0.456±0.065、0.473±0.078、0.491±0.045,P<0.05)。转染96 h后,livin-siRNA组HT-29细胞增殖能力明显低于对照组及脂质体组(0.564±0.102 vs0.833±0.127、0.860±0.153,P<0.05),且细胞凋亡率升高[(16.5±2.8)%vs(2.4±0.5)%、(3.7±1.0)%,P<0.05]。侵袭实验显示,livin-siRNA转染后,穿过Matrigel膜的HT-29细胞数量明显少于对照组及脂质体组[(31.3±4.5)vs(101.3±8.6)、(97.4±7.8)个,P<0.05)]。livin-siRNA组HT-29细胞的caspase-3活性低于对照组(0.160±0.023 vs 0.347±0.058,P<0.05)。结论:siRNA沉默livin的表达可抑制HT-29细胞的增殖,诱导细胞凋亡,抑制细胞的侵袭。     

蛋白激酶Cα在人神经胶质瘤耐药细胞株凋亡中的作用

背景与目的：蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）参与肿瘤的发生、发展及预后。本研究探讨蛋白激酶Cα（Protein kinase Cα,PKCα）在人神经胶质瘤耐药细胞株SHG-44／ADM发生细胞凋亡中的作用和机制。方法：应用阿霉素浓度递增和间歇诱导法建立SHG-44／ADM耐药株．采用PKCα激活剂PMA和抑制剂Staurosporine分别干预SHG-44/WT和SHG44／ADM细胞株．激酶分析PKCα活性,荧光分光光度计检测细胞内阿霉素浓度．流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果：PKCα激活剂PMA增强细胞PKCα和MDR-1的活性．同时降低细胞凋亡率：PKCα抑制剂Staurosporine抑制细胞PKCα和MDR-1的活性．增加细胞凋亡率。结论：PKCα通过MDR-1参与神经胶质瘤耐药细胞的凋亡．     

转染P53基因对胶质瘤细胞株SHG44裸鼠致癌性的作用研究

 目的:探讨转染野生型P⁵³(wt-P⁵³)和突变型P⁵³(mtP⁵³)基因,对人胶质瘤细胞株SHG44裸鼠致瘤性的影响及意义.方法:采用质脂体介导法,分别将wt-P⁵³和mt-P⁵³基因导入人胶质瘤细胞株SHG44,体内外检测转导细胞的生长状况和裸鼠致瘤性.结果:转染mt-P⁵³基因的细胞株,G418筛选细胞集落数、软琼脂平皿细胞集落数以及裸鼠瘤组织重量和体积,均显著高于对照组(P <0.01);而转染Wt-P⁵³ 基因的细胞株均显著低于对照组(P<0.01),表明导入wt-P⁵³基因的细胞株,瘤细胞生长速度明显低于对照细胞株和导入.mt-P53基因的细胞株,即导入mt-P⁵³基因的细胞株瘤细胞生长速度最快,而导入Wt-P⁵³基因的细胞株瘤细胞生长速度最慢.结论:Wt-P⁵³基因能有效地抑制人胶质瘤细胞生长;mt-P⁵³基因则可以明显地促进瘤细胞生长.     

siRNA介导的Bcl-xL基因沉默诱导人乳腺癌细胞凋亡的研究

目的研究siRNA(small interfering RNA)对MCF-7细胞株Bel—xL基因表达的抑制作用及对癌细胞增殖抑制和凋亡诱导作用。方法体外转录法合成特异针对人Bel—xL基因的siRNA；荧光标记法标记Bel—xL siRNA；脂质体法将siRNA转入MCF-7细胞株；流式细胞术检测siRNA的转染效率；半定量RT—PCR法检测siRNA对Bcl—xL基因表达的抑制作用；MTT法检测siRNA对细胞生长增殖抑制作用；荧光染色法观察siRNA诱导细胞凋亡的作用。结果siRNA的转染效率在一定剂量范围内随浓度的增加而增加，siRNA转染组Bcl—xL mRNA表达水平可下调约72％，在对照组内mRNA表达水平无明显改变。细胞生长增殖抑制率在一定范围内具有剂量依赖性和时间依赖性。荧光显微镜下观察肿瘤细胞发现，siRNA50、100、200nmol／L转染组出现典型的凋亡形态学变化。结论脂质体法对siRNA的瞬时转染效率较高，体外转录合成的siRNA能特异有效下调Bel—xL基因的表达，瞬时转染Bel—xL siRNA能有效抑制乳腺癌细胞增殖并诱导其凋亡。低剂量Bcl—xL siRNA对瘤细胞显示了显著的抗增殖作用。