血管内皮生长因子121反义核酸抑制人胰腺癌细胞体外促血管生成能力

目的:探讨VEGF121反义核酸对体外培养胰腺癌细胞促血管生成能力的影响,以期通过抑制VEGF引起的肿瘤血管生成来达到抑制肿瘤生长的目的。方法:将稳定转染有VEGF反义核酸pcDNA3-ASVEGF121的胰腺癌细胞系BxPC-3在体外条件下培养,采用免疫组化检测肿瘤细胞表面VEGF及Flk-1表达水平。通过测定ECV-304生长曲线检测培养液上清对血管内皮细胞生长的影响。通过培养液上清体外血管生成试验检测肿瘤细胞体外促血管生成能力。结果:VEGF反义核酸转染BxPC-3细胞后,肿瘤细胞表面VEGF蛋白水平受到明显抑制,VEGF受体Flk-1表达水平上调。对血管内皮细胞ECV-304的促生长作用减弱。体外血管生成试验显示VEGF反义核酸能抑制肿瘤细胞体外促血管生成能力。结论:人反义VEGF121能显著抑制胰腺癌细胞表面的VEGF表达,抑制肿瘤细胞体外促血管生成能力。     

非霍奇金淋巴瘤抗血管新生治疗的部分机制研究

目的观察沙立度胺(反应停)辅助治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)的临床效果,并测定治疗前后淋巴瘤组织微血管密度(MVD)及血管内皮细胞生长因子(VEGF)、核因子-κB(NF-κB)活性的变化。方法采用免疫组化方法测定实验组17例及对照组14例NHL患者淋巴瘤组织中的VEGF、NF-κB、MVD表达。结果两组病例的有效率[完全缓解(CR) 部分缓解(PR)]分别为70.6%和64.3%,差异无统计学意义(P>0.05)。但CR患者随访6个月以后,实验组1例复发,对照组3例复发;治疗后MVD、VEGF与对照组相比差异有统计学意义,MVD(42.3±19.2)%vs(57.8±19.8)%,VEGF(21.3±5.4)%vs(31.7±5.8)%(P<0.05,P<0.01),NF-κB与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论反应停联合化疗可以维持NHL患者的持续缓解状态,减少复发;其通过降低NHL患者淋巴瘤组织中VEGF的表达,从而减少其MVD而抑制血管新生来达到此作用的。     

反义血管内皮生长因子对乳腺癌细胞生长的抑制作用

目的　构建表达反义血管内皮生长因子165(VEGF165)的真核表达载体,观察其对人乳腺癌细胞MCF- 7的影响,探讨反义基因治疗乳腺癌的可行性。方法　应用基因重组技术,将人VEGF165cDNA反向克隆入pcDNA3真核表达载体中,构建VEGF165反义基因的真核表达载体,将此表达载体转染人乳腺癌细胞MCF -7,观察转染前后MCF 7的VEGF165表达及细胞生长周期。结果　成功构建出VEGF165反义RNA真核表达载体,反义质粒转染后MCF -7细胞VEGF165表达下降,G1期细胞增加,S期细胞减少,细胞增殖能力降低。结论　VEGF165反义RNA能够明显减少人乳腺癌细胞株MCF- 7内VEGF165的表达,抑制乳腺癌细胞的增殖,证明了反义基因干预治疗的有效性,为乳腺癌的基因治疗进行了有益探索。     

能量多普勒检测膀胱癌血流相对灌注率及其与MVD、VEGF表达的相关性

目的 探讨能量多普勒(PDI)技术检测膀胱癌肿瘤内血流相对灌注率及其与微血管密度(MVD)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的关系.方法 采用经直肠PDI技术检测45例膀胱癌患者肿瘤内血流信号,计算相对灌注率,术后采用免疫组化技术检测肿瘤MVD及VEGF表达.结果 肿瘤内血流相对灌注率与MVD、VEGF阳性表达呈正相关.MVD、VEGF表达与膀胱癌的病理分级及浸润程度相关.VEGF表达阳性者MVD高于VEGF表达阴性者.结论 能量多普勒超声联合上述免疫组化指标可从不同角度反映膀胱癌的血管生成特征,有助于对膀胱癌血管生成进行评价.     

VEGF在恶性淋巴瘤的表达及与MVD的相关性研究

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)在恶性淋巴瘤的表达,及与微血管密度(MVD)的关系。方法采用免疫组化法对恶性淋巴瘤淋巴结病理组织进行免疫学分类,及测定VEGF及微血管密度。结果(1)恶性淋巴瘤组织VEGF高表达,微血管密度增高,与对照组比较差异显著(P<0.01);(2)VEGF主要表达于淋巴瘤淋巴结外带,于肿瘤细胞及其周围细胞胞浆、血管内皮细胞及微血管周围表达;⑶非霍奇金恶性淋巴瘤VEGF与MVD呈正相关(P<0.01)。结论恶性淋巴瘤形成时已有VEGF高水平表达及丰富的微血管形成;VEGF由瘤细胞及周围组织细胞分泌,沉积于血管内皮细胞周围;非霍奇金淋巴瘤VEGF的分泌与微血管的形成相关。     

胰腺癌中血管内皮生长因子的表达和微血管密度及意义

目的:分析在胰腺癌中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达情况和微血管密度(mi- crovessel density,MVD),探讨血管生成因素在胰腺癌发展过程中的作用。方法:选取43例胰腺癌标本及相同数目的正常胰腺组织作为对照,应用免疫组化方法检测VEGF表达和计数MVD。结果:胰腺癌VEGF阳性率及MVD均明显高于正常胰腺组织(P<0.05);胰腺癌中淋巴结转移组VEGF和MVD明显高于无淋巴结转移组,TNM分期高者VEGF和MVD高于分期低者,胰腺癌VEGF表达与MVD明显相关(P<0.05);根据VEGF和MVD水平高低分组,高水平组生存时间明显短于低水平组(P<0.05),MVD是唯一的独立影响胰腺癌生存时间的因素(P<0.05)。结论:(1)VEGF对于胰腺癌的血管生成、肿瘤生长和转移具有重要意义。(2)VEGF与MVD之间具有良好的一致性,两者均是反映肿瘤血管生成情况的理想指标。(3) VEGF和MVD可作为判断胰腺癌生物学行为和预后的指标。     

非霍奇金淋巴瘤患者血浆血管内皮细胞生长因子浓度测定的临床意义

血管新生机制是恶性肿瘤的重要发病机制.血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是参与血管新生作用最强最具特征性的促血管生成介质,它可刺激血管生成,促进内皮细胞的增殖与迁移,使血管通透性增加.国外的许多研究证实在非霍奇金淋巴瘤中存在着血管新生,而且VEGF及受体在非霍奇金淋巴瘤的多种细胞系中表达,血清VEGF水平已成为非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)的一项独立预后因素.本研究中我们主要应用酶联免疫吸附测定(ELISA)的方法检测NHL患者血浆VEGF浓度,旨在探讨NHL患者血浆VEGF(P-VEGF)与临床病情的关系.     

乳腺癌血管生成相关因素的检测及意义

目的　探讨检测乳腺癌组织血管生成相关因素及其临床意义。方法　采用能量多普勒检测 80例乳腺癌内血流信号并通过图像分析技术定量测定肿瘤内血管阳性反应总面积 ,同时采用免疫组化技术进行血管内皮生长因子 (VEGF)测定和肿瘤内微血管密度 (MVD)计数。结果　乳腺癌组织中VEGF表达阳性率为 44 .4% ,VEGF阳性病例血管阳性反应总面积、MVD值高于阴性病例 (P <0 .0 1) ,三者与一般临床病理因素无关 ,但与组织学分级及腋窝淋巴结转移密切相关。VEGF阳性表达者五年生存率 ( 3 9.4% )明显低于阴性表达者 ( 76.1% ) (P <0 .0 1)。结论　PDI定量检测肿瘤血管阳性反应总面积与MVD计数、VEGF测定相结合 ,能全面反映肿瘤血管生成状态。VEGF阳性表达者血管生成活跃 ,肿瘤血管阳性反应总面积、MVD值高 ,其预后差。     

淋巴瘤细胞Raji细胞血管内皮细胞生长因子表达及基质胶中ECV304细胞血管形成与雷公藤内酯醇的干预

目的:观察雷公藤内酯醇对淋巴瘤细胞系Raji细胞血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达、合成分泌以及对基质胶中ECV304细胞血管形成的影响.方法:实验于2005-08/2006-02在华中科技大学同济医学院公共卫生学院分子生物学实验室完成.①MTT法检测3.125,6.25,12.5,25,50nmol/L的雷公藤内酯醇在作用12,24,36,48,60,72h对Raji细胞增殖的影响.②RT-PCR法检测12.5,25,50 nmol/L雷公藤内酯醇处理Raji细胞24 h后,细胞VEGFmRNA表达的变化.③ELISA法检测25 nmol4/L雷公藤内酯醇处理Raji细胞24 h后,细胞培养上清VEGF的分泌鼍.④采用血管形成实验检测雷公藤内酯醇对ECV304细胞在基质胶中血管形成的影响.结果:①雷公藤内酯醇以时间和剂量依赖方式抑制Raji细胞增殖,24 h半数抑制浓度为25 nmol/L.②Raji细胞内VEGFmRNA主要为VEGF 165和VEGF121,雷公藤内酯醇明显抑制其表达,呈剂量依赖方式.③雷公藤内酯醇明显抑制gaji细胞VEGF的分泌量(P＜0.01).④Raji细胞培养上清、10 μg/L VEGF处理的Raji细胞培养上清可促进ECV304细胞在基质胶中形成血管,而25 nmol/L雷公藤内酯醇处理的Raji细胞培养上清加入基质胶则未见血管形成.结论:雷公藤内酯醇以时间和剂量依赖性方式抑制淋巴瘤细胞增殖、VEGF的表达分泌及血管形成.     

肾细胞癌与良性肾肿瘤组织微血管密度和血管内皮细胞生长因子表达的对比研究

目的：通过检测肾细胞癌、肾脏良性肿瘤标本中的微血管密度（MVD）及血管内皮细胞生长因子（VEGF）表达情况,研究不同性质肾脏肿瘤血管生成的差异。方法：肾细胞癌标本39例,良性肾脏肿瘤标本12例。采用“热点（hotpoint）”法计数MVD,VEGF的定量标准为VEGF染色强度与阳性细胞百分比分值的乘积。结果：MVD、VEGF在肾细胞癌和良性肾脏肿瘤均有表达。肾细胞癌组织MVD（18．3±6．9）计数／视野,VEGF乘积值3．63±2．5（×400）,转移者MVD和VEGF乘积值分别为（26．2±7．8）计数／视野、5．83±2．4,未转移者MVD和VEGF乘积值分别为（14．4±4．6）计数／视野、2．06±2．7;12例良性肾脏肿瘤MVD为（2．5±1．3）计数／视野,VEGF乘积值为0．32±0．2。肾细胞癌组织MVD和VEGF表达显著高于良性肾肿瘤（P〈0．01）,转移组肾细胞癌MVD和VEGF表达显著高于未转移组（P〈0．01）;肾细胞癌组织MVD与VEGF统计学上呈正相关（r=0．684,P〈0．001）。结论：肾细胞癌MVD及VEGF表达均显著高于良性肾脏肿瘤,提示不同性质的肾脏肿瘤其血管生成情况不同．转移肾细胞癌血管生成水平亦高于未转移肾细胞癌,提示血管生成与肾细胞癌转移相关,肾细胞癌组织MVD和VEGF表达水平呈正相关     

重组VEGF165在哺乳动物细胞中表达及其生物学活性

目的构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-血管内皮生长因子(VEGF)165并在哺乳动物细胞中实现目的基因的表达,对目的蛋白进行鉴定和生物学活性分析。方法分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至哺乳动物细胞NIH 3T3并进行抗生素压力筛选,采用双抗夹心ELISA、SDS-PAGE和免疫印迹方法对目的蛋白在转染细胞中的特异表达进行鉴定,在血管内皮细胞ECV304上对表达产物的细胞结合活性和促增殖活性进行分析。结果构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-VEGF165成功转染NIH3T3,获得加压筛选的重组细胞,目的基因得到稳定表达,目的蛋白能与血管内皮细胞ECV304特异结合,并具有促内皮细胞增殖活性。结论应用pcDNA3.1(+)-VEGF165载体转染的NIH 3T3细胞可稳定表达具生物学活性的VEGF165重组蛋白。     

抗血管内皮生长因子发夹状核酶基因抑制白血病细胞裸鼠体内生长和肿瘤内血管生成

目的探讨抗血管内皮生长因子(VEGF)发夹状核酶基因对白血病细胞裸鼠体内生长和肿瘤内血管生成的影响。方法采用脂质体介导的方法将抗 VEGF 发夹状核酶基因真核表达载体pcDNA-RZ 转染白血病细胞系 K562,G418抗性筛选获得阳性克隆;抽提基因组 DNA,用 PCR 方法验证核酶基因已转入 K562细胞;荧光定量 PCR 和免疫印迹反应检测白血病细胞中 VEGF mRNA 和蛋白表达量的改变;将白血病细胞皮下接种 BALB/c 裸鼠,观察转染细胞在裸鼠体内成瘤及生长情况;组织形态学和免疫组织化学法检测裸鼠移植瘤微血管密度(MVD)。结果抗 VEGF 发夹状核酶基因真核表达载体 pcDNA-RZ 转入白血病细胞系 K562(K562/RZ),G418筛选两周获得阳性克隆,PCR 检测证实核酶基因整合入白血病细胞基因组 DNA;与 K562及 K562/PC 细胞(转染空质粒的 K562细胞)相比,K562/RZ 细胞 VEGF mRNA 和蛋白的表达量明显降低。接种 K562、K562/PC 和 K562/RZ 细胞组小鼠肿瘤终体积分别为(3.21±0.89)cm~3,(3.42±1.01)cm~3,(1.71±0.94)cm~3;肿瘤重量分别为(4.43±0.87)g,(3.96±0.94)g,(2.24±0.56)g;瘤体内 MVD 分别为4.70±1.25,4.67±1.31和1.80±1.55。以上各组之间的差异均有统计学意义(P<0.01)。结论转导抗 VEGF 发夹状核酶基因能减少白血病细胞中 VEGF 的合成,细胞裸鼠致瘤能力明显减弱,瘤体内血管形成能力降低。     

有利于创伤修复愈合的人血管内皮细胞生长因子真核表达质粒的构建

目的构建人血管内皮细胞生长因子(VEGF)的真核表达质粒pcDNA3-VEGF.方法采用PCR技术和DNA重组技术,将编码人VEGF的cDNA序列克隆至表达载体pcDNA3.1(+)上,挑取阳性克隆扩增后,提取DNA进行酶切鉴定和测序.结果从HepG2细胞中克隆出VEGF121基因的cDNA片段,该序列由Kozak序列,翻译起始密码子ATG,信号序列,编码序列和终止密码子等部分组成.DNA测序表明,VEGF121基因的cDNA序列正向插入到pcDNA3.1(+)的多克隆位点上.结论本研究获得了VEGF121基因的真核达质粒pcDNA3-VEGF,为进一步研究VEGF的转基因治疗奠定基础.     

VEGF-C mRNA在宫颈癌组织中的表达及其临床意义

目的　探讨血管内皮生长因子C(VEGF C)mRNA在宫颈癌组织中的表达及其与宫颈癌临床病理特征和血管生成的关系。方法　以逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测VEGF CmRNA在 5 1例宫颈癌组织中的表达 ,以CD34抗体免疫组织化学染色检测宫颈癌组织的微血管密度 (MVD)。结果　 5 1例宫颈癌组织中有 35例 ( 6 8 6 3% )VEGF CmRNA表达阳性 ,淋巴结转移的宫颈癌组织中的VEGF C的表达阳性率( 6 3 6 % ,2 1/31) ,明显高于淋巴结阴性的宫颈癌组织 ( 2 0 0 % ,4 /2 0 ) ,差异有显著意义 (P <0 0 1) ,微血管密度高的宫颈癌组织中VEGF CmRNA表达阳性率 ( 6 2 5 % ,2 0 /32 )明显高于微血管密度低的宫颈癌组织 ( 2 6 .3% ,5 /19) (P <0 0 5 )。结论　VEGF CmRNA表达对宫颈癌淋巴结转移和血管生成具有重要作用     

HLA-E真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达与鉴定

本研究旨在亚克隆HLA-E真核表达载体，并使其在HLA-I类阴性的靶细胞K562细胞上获得稳定表达。首先采用PcR方法从多顺反子表达载体(pG/A2E)扩增出目的片段A2／ E cDNA，与真核表达载体pcDNA3．1( )重组，构建成HLA—E真核表达载体pcDNA3．1( )／A2E，然后采用脂质体转染的方法将重组质粒转入K562细胞，最后经G418筛选及有限稀释，利用抗HLA-E特异的单克隆抗体K0126-3进行FACS检测，以观察HLA—E分子在靶细胞表面的表达情况。结果显示，HLA-E分子在经pcDNA3．1( )／A2E转染的靶细胞表面获得表达(27．76％)，而经空载体pcDNA3．1( )转染的靶细胞则未获得表达。结论：成功构建了pcDNA3．1( )／A2E真核表达载体，并使HLA-E分子在HLA-I类阴性的K562细胞表面表达，为进一步研究HLA-E作用的分子机制以及探索HLA-E与NK受体之间的相互作用和HLA-E体外表达对NK细胞功能的影响奠定了基础。     

p27kip1及其出核相关分子激活蛋白1辅因子在淋巴瘤细胞中的表达及相互关系

目的 探讨p27^kip1及其出核相关分子激活蛋白1（AP-1）的辅助因子Jab1在淋巴瘤细胞中的表达变化及相互关系。方法 采用血清饥饿合并释放方法同步化处理淋巴瘤细胞系Jurkat和Raji细胞，分别采用Western blot及RT—PCR技术检测p27^kip1、Jab1在淋巴瘤细胞中的蛋白表达水平和mRNA表达水平变化；采用来普霉素B（LMB）刺激增殖过程中的淋巴瘤细胞，检测p27^kip1、Jab1的表达变化；构建人Jab1基因的pcDNA3．1-myc-Jab1的真核表达质粒，脂质体转染Jurkat细胞，配合免疫荧光技术检测p27^kip1的亚细胞定位情况；免疫沉淀检测Jurkat和Raji细胞中p27^kip1与Jab1的结合情况。结果 血清饥饿导致Jurkat和Raji细胞生长周期停滞，p27^kip1蛋白总量增加，Jab1蛋白总量减少。血清释放后两者的蛋白水平呈现相反的表达变化，而p27^kip1mRNA水平无明显改变。LMB可以抑制由血清释放引起的细胞增殖，在此过程中p27^kip1表达上调，Jab1表达下调。转染Jab1真核表达质粒的Jurkat细胞p27^kip1定位有明显的改变。免疫沉淀结果显示在Jurkat和Raji细胞中p27^kip1与Jab1相互结合。结论 Jab1可能通过与p27^kip1结合来介导p27^kip1的核内外分布并影响其表达，进而影响p27^kip1的功能状态，从而参与调控淋巴瘤细胞的生长。     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞

背景：血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义。目的：克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性。方法：采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和DNA测序的方法对提取和重组DNA进行鉴定。pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定。结果与结论：构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段。提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性。