人类卵子改良程序化冷冻和玻璃化冷冻的比较研究

【】目的：研究两种冷冻方法对人类卵子冻融结果的影响。方法：分为程序化冷冻卵子与玻璃化冷冻卵子两组,对于卵子冻融后的复苏率、受精率以及优质胚胎率等指标进行比较。结果：程序化冷冻组卵子的复苏率(71.05%,108/152)显著低于(P<0.05)玻璃化冷冻组(81.75%,103/126),但优质胚胎率(41.07%,23/56)显著高于(P<0.05)玻璃化冷冻组(30.23%,13/53),而受精率、卵裂率及囊胚形成率无统计学差异。结论：玻璃化冷冻卵子可以获得较高的复苏率,但使用改良程序化冷冻试剂盒冻融卵子,可能较玻璃化冷冻获得更好发育潜能。     

小鼠卵母细胞程序化和玻璃化冷冻效果的比较

目的 本实验通过建立小鼠的实验模型,比较程序化和OPS玻璃化冷冻效果,探讨卵子冷冻的具体方法 ,为卵子冷冻技术应用于临床提供实验依据.方法 通过促排卵获取小鼠MII期卵母细胞,随机分组,观察不同冷冻方法 、高浓度的冷冻保护液,对卵子的成活及进一步发育潜能的影响;不同的IVF前培养时间对冻融卵子的受精及继续发育的影响.结果 (1)OPS玻璃化冷冻组与程序化冷冻组的存活率、受精率、卵裂率及6-8cell胚形成率均无显著差异.(2)玻璃化冷冻组与暴露组的卵母细胞存活率分别为35.3%,100%,有显著性差异(P＜0.05).暴露组与对照组比较的受精率、卵裂率,无显著性差异(P＞0.05).而暴露组与对照组的6-8cell的胚形成率分别为41%,63%,两组比较,有显著差异(P＜0.05).(3)无论OPS玻璃化冷冻法还是程序化冷冻法,冻融后的培养2 h组和培养1 h组的,受精率、卵裂率,两组比较,均有显著性差异(P＜0.05).结论 本实验证实,OPS玻璃化冷冻法至少可以达到程序化冷冻法同样的效果,而OPS玻璃化冷冻法有好于程序化冷冻法的趋势.加之,其简便、省时、经济等优点,因而,更有发展前景.     

不同冷冻载体对小鼠成熟卵母细胞玻璃化冷冻的影响

目的:探讨玻璃化冷冻小鼠成熟减数第二次分裂中期(MⅡ期)卵母细胞的最佳冷冻载体及冷冻方法。方法:用乙二醇和蔗糖为玻璃化冷冻保护剂,将小鼠成熟MⅡ期卵母细胞分为冻融、暴露和对照组。冻融组分别采用普通麦管、封闭式拉细麦管(CPS)和开放式拉细麦管(OPS)作载体,采用玻璃化快速冷冻和快速复温的方法冻存小鼠成熟卵母细胞;暴露组卵母细胞仅暴露在冷冻和复苏液中,不进行冷冻;对照组卵母细胞不接触冷冻和复苏液。观察各组处理后卵子回收、受精、卵裂等情况。结果:冻融组普通麦管、CPS和OPS处理的卵母细胞回收率分别为92.0%、92.3%和72.3%,OPS处理卵母细胞的回收率显著低于普通麦管和CPS处理的卵母细胞(P<0.001);普通麦管、CPS和OPS处理的卵母细胞复苏存活率分别为43.5%、72.2%和76.5%,CPS和OPS处理卵母细胞的复苏存活率显著高于普通麦管组处理的卵母细胞(P<0.001)。冻融、暴露和对照组的卵裂率分别为38.6%、69.2%和73.5%,冻融组显著低于暴露和对照组(P<0.001)。结论:CPS法在玻璃化冷冻保存成熟的卵母细胞方面有价值。     

人卵子玻璃化冷冻原因及其技术在辅助生殖中的应用

目的探讨人卵子玻璃化冷冻的原因及其技术在辅助生殖中的可行性和临床应用价值。方法回顾性研究2008年1月~ 2018年10月在南方医科大学南方医院生殖医学中心行卵子玻璃化冷冻的26例患者共27个取卵周期,分析卵子玻璃化冷冻原 因、卵子解冻后受精情况及临床妊娠结局。结果26例患者27个取卵周期共冷冻卵子274枚,卵子冷冻原因主要包括取卵日男 方精子数量及质量差无可用精子、男方处于各种疾病急性期不适宜取精及男方因各种原因未能到场取精等。共19个周期行卵 子解冻,该19个周期共冻存卵子217枚,解冻后存活176枚,卵子解冻存活率81.11%,其中131枚卵子解冻后行卵胞浆内单精子 注射,正常受精98枚,正常受精率74.81%;卵裂88枚,卵裂率89.80%（88/98）;共形成可移植胚胎53枚,其中优质胚胎36枚,优 质胚胎率36.73%（36/98）。15个移植周期共移植胚胎27枚,临床妊娠率为53.33%（8/15）,活产率为33.33%（5/15）。随患者年龄 增加,与<35岁组相比,≥35岁组患者卵子复苏率（82.76% vs 74.42%,P=0.211）、临床妊娠率（77.78% vs 16.67%,P=0.041）及活 产率（55.56% vs 0,P=0.044）均呈下降的趋势。结论卵子玻璃化冷冻可作为不孕夫妻取卵当日因男方因素不能提供精子患者 的临床补救措施;卵子玻璃化冻融后的受精率、临床妊娠率结局良好,卵子复苏率与年龄存在相关性,女性≤35岁者冻卵能够获 得满意的临床妊娠结局。     

解冻液I温度设定的不同对小鼠卵母细胞玻璃化冻融效果的影响

『』 目的 探讨预热至37℃的解冻液I和预热至室温(22℃)的解冻液I对小鼠卵母细胞玻璃化冻融效果的影响。 方法 对6周龄昆明系雌鼠进行促排卵,脱去颗粒细胞后选取形态良好的MII期卵母细胞,用含不同浓度DMSO+EG的磷酸盐缓冲液(5%DMSO+5%EG,10%DMSO+10%EG,20%DMSO+20%EG+30%蔗糖)对其进行玻璃化冷冻,储存2天后对小鼠卵子进行解冻复温。将卵子随机分为2组,一组投入预热至37℃的解冻液I(含30%蔗糖的磷酸盐溶液),另一组投入预热至室温(22℃)的相同浓度的解冻液I中,再分别移至预热至室温(22℃)的解冻液II,III和IV(含20%,10%,5%蔗糖的磷酸盐溶液),随后对两组卵母细胞的复苏率进行统计比较。 结果 共计对119枚小鼠卵子进行玻璃化冻融,其中61枚置于预热至37℃的解冻液I,有52枚存活良好,复苏率为82.25%(52/61),其余58枚置于预热至室温(22℃)的解冻液I进行解冻,有23枚存活良好,复苏率为39.66%(23/58),37℃组的复苏率显著高于室温(22℃)组(P<0.01)。 结论 虽然降低平衡时的温度可以减少高浓度玻璃化冷冻保护剂对卵子的毒性作用,但较快的升温速度可以帮助卵子快速通过-120℃～-35℃的危险阶段,而37℃的解冻液I环境较之室温(22℃)能更好的加速这一过程,避免重结晶对细胞的致命损伤。     

不同胚胎冷冻方法对人类早期胚胎解冻后的复苏效果及临床结局的影响

目的 比较玻璃化冷冻与程序化冷冻对人类早期胚胎解冻后复苏效果及临床结局的影响.方法 辅助生殖技术获取的剩余可利用人类胚胎2 884枚,其中采用玻璃化冷冻复苏666个周期,解冻胚胎1 516枚、复苏1 383枚、移植胚胎1 375枚;程序化冷冻复苏506个周期,解冻胚胎1 368枚、复苏1 090枚、移植1 077枚.比较两种方法的复苏效果及临床结局.结果 玻璃化冷冻组胚胎复苏率、胚胎完整率分别为92.02％、92.11％,高于程序化冷冻组的79.68％、69.63％(P＜0.05);两组种植率、临床妊娠率、周期取消率、多胎妊娠率、早期流产率、新生儿胎龄、早产率、新生儿出生体重、出生缺陷率比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 玻璃化冷冻较程序化冷冻有更高的胚胎复苏率及胚胎完整率,胚胎利用率高,两种冷冻方法的临床结局相似,适用于人类胚胎的冷冻.     

激光打孔技术在小鼠卵子保存上的运用研究

目的比较卵子冷冻复苏后、以及复苏卵子经过激光打孔后,与新鲜精子、冷冻复苏精子体外受精,受精率的变化。方法 (1)通过免疫荧光染色技术,判断卵子冷冻前后透明带糖蛋白-2、微丝以及细胞核的变化;(2)冷冻C57BL/6J小鼠卵子,复苏后一部分卵子打孔,一部分不打孔,然后与9个品系的新鲜精子和冷冻精子体外受精,比较各组受精率的变化。结果 (1)新鲜卵子组透明带糖蛋白-2、微丝及细胞核结构清晰,而冷冻组以及冷冻剂处理组,微丝结构略有变化,透明带糖蛋白-2受到不同程度的损伤,而细胞核在冷冻前后无明显变化;(2)9个品系的新鲜精子与C57BL/6J复苏卵子受精率为17.6%～42.9%,平均为29.6%;新鲜精子与复苏打孔卵子受精率为29.1%～72.3%,平均为49.7%,差异显著(P<0.05);9个品系复苏精子与复苏卵子体外受精率为5.4%～23%,平均为15.5%;复苏精子与复苏打孔卵子受精率为16.7%～48.6%,平均为28.8%,差异显著(P<0.05)。结论 (1)冷冻对卵子的透明带糖蛋白-2有较大的损伤,对微丝有一定的影响,但是对染色体没有影响;(2)冷冻卵子复苏后,体外受精率下降明显,但是复苏卵子经过激光打孔后,可以显著提高体外受精率。     

玻璃化冷冻人卵母细胞体外受精－胚胎移植9例临床分析

目的：探讨人卵母细胞玻璃化冷冻在体外受精－胚胎移植（ IVF-ET）中的应用效果。方法行IVF-ET 治疗、因取卵日男方因素无法进行受精的患者9例,对其成熟卵子进行玻璃化冷冻保存,解冻后进行卵胞浆内显微授精（ICSI）,记录卵子复苏、受精、卵裂及移植后妊娠情况。结果9例患者共解冻复苏58枚卵子,复苏率68．2％（58／85）;复苏后进行ICSI的成熟卵子中,受精40枚,形成胚胎34枚,受精率69．0％,卵裂率85．0％。7个移植周期共移植胚胎15枚,临床妊娠3例,临床妊娠率42．9％。结论人卵母细胞玻璃化冷冻可以获得一定的临床妊娠率,在IVF-ET中可作为临床治疗的选择之一。     

抗冷冻蛋白Ⅲ对小鼠胚胎冷冻保护的作用

目的将抗冷冻蛋白III(AFPIII)应用于小鼠2-细胞期胚胎玻璃化冷冻保存,观察其对细胞微丝骨架结构和冷冻复苏后发育潜能是否有保护作用。方法收集小鼠2-细胞期胚胎1 200枚,随机分为新鲜对照组、玻璃化冷冻组和添加AFPIII玻璃化冷冻组(AFPIII终浓度为500 ng/mL),每组400枚,其中200枚胚胎进行复苏后囊胚培养,200枚进行细胞微丝的免疫荧光染色,比较各冷冻组胚胎复苏存活率和其后的囊胚形成率以及各组微丝完整胚胎比率。结果添加AFPIII玻璃化冷冻组胚胎复苏率高于玻璃化冷冻组,差异有统计学意义(P<0.05)。新鲜对照组和添加AFPIII玻璃化冷冻组囊胚形成率、微丝完整胚胎比率均高于玻璃化冷冻组,差异有统计学意义(P<0.05);新鲜对照组和添加AFPIII玻璃化冷冻组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 AFPIII对小鼠2-细胞期胚胎玻璃化冷冻有保护作用。     

冷冻载体对小鼠卵母细胞玻璃化冷冻效果影响的研究

目的探讨不同冷冻载体对小鼠卵母细胞快速玻璃化冷冻回收率、复苏率和解冻后胚胎发育潜能的影响。方法以小鼠卵母细胞为实验材料,以玻璃化冷冻方法冻存小鼠卵母细胞,分别以冷冻叶片（A）组、冷冻小钩（B）组、电镜铜环（C）组、自制冷冻叶片（D）组为冷冻载体冷冻小鼠卵母细胞,通过对解冻后卵子回收率、复苏率、卵子受精率及早期胚胎发育率等分析判断冻存效果。结果回收率D组明显低于其他3组,差异有统计学意义（P〈0.01）;D组与其他3组卵母细胞冷冻保存后卵子复苏率、胚胎受精率、继续发育潜能的比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 4种玻璃化冷冻载体都是小鼠卵母细胞快速玻璃化冷冻保存中可行的冷冻载体,自制叶片组的卵子回收率明显低于其他3组,需更进一步熟练叶片制作的技术和实验人员操作技能。     

促性腺激素在促排卵周期未成熟卵母细胞体外培养中的应用

目的 评价卵泡刺激素和人绒毛膜促性腺激素在促排卵周期未成熟卵母细胞体外培养过程中的应用价值。方法 收集控制性超促排卵周期行单精子显微注射(ICSI)过程中得到的未成熟卵母细胞(MⅠ期和GV期), 随机分为加促性腺激素培养组和不加促性腺激素培养组, 培养24~28 h后成熟卵母细胞进行ICSI授精, 并观察胚胎发育情况, 记录成熟率、受精率、卵裂率和优胚率。结果 对于MⅠ期卵母细胞, 是否使用促性腺激素不影响其24 h成熟率、受精率、分裂率和优胚率(P>0.05)。对于GV期卵母细胞, 培养液中加入促性腺激素能提高优质胚胎率(31.3% vs 4.2%, P<0.05), 但两组的成熟率、受精率和卵裂率差异无统计学意义(P>0.05)。结论 控制性超促排卵中获得的未成熟卵母细胞进一步体外培养, 无论是否添加促性腺激素都可自然成熟, 在GV期卵母细胞的体外培养过程加入促性腺激素可获得更高的优胚率。     

细胞松弛素B和解冻方法对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响

 【目的】探讨细胞松弛素B和解冻程序对玻璃微细管法（GMP）玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响。【方法】以小鼠MII期卵母细胞为模型，研究冷冻前细胞松弛素B预处理、不同解冻程序对小鼠卵母细胞冷冻效果的影响；随后对经GMP玻璃化冷冻的卵母细胞直接进行培养以检测冷冻是否诱发孤雌发育。【结果】与对照组相比．细胞松弛素B预处理的卵母细胞存活率、受精率、卵裂率及囊胚率没有显著差异（89．3％vs91．3％．44．0％vs40．4％，30．0％vs27．7％，4．0％vs6．4％；P〉0．05）；采用连续浓度梯度递减解冻法的受精率明显高于间断浓度梯度递减解冻法（57．4％vs40．4％；P〈0．05），且前者的卵裂率和囊胚发育率也相对较高f40，2％vs27，7％，14．5％vs6．4％；P〉0．05）。冷冻复苏后卵母细胞的孤雌发育率稍高于未经冷冻的卵母细胞（17．1％vs3．2％；P〉0．05）。【结论】细胞松弛素B预处理对MII期小鼠卵母细胞的GMP玻璃化冷冻保存效果没有影响：采用连续浓度梯度递减解冻法能明显提高复苏后卵母细胞的体外发育能力。     

玻璃化冷冻与慢速程序冷冻法保存人MⅠ期卵母细胞的效果比较

目的:探讨玻璃化冷冻与慢速程序冷冻法对人未成熟卵母细胞的存活及胚胎发育潜能的影响。方法:体外受精-胚胎移植中获得的251个MⅠ期卵母细胞随机分3组,第1组94个先玻璃化冷冻保存,第2组63个先慢速程序冷冻保存,两组冻融后的未成熟卵母细胞再进行IVM,用ICSI技术对成熟卵母细胞完成授精,并进行体外胚胎培养。第3组94个MⅠ期卵母细胞先进行IVM,再进行玻璃化冷冻保存,与第1组先玻璃化冷冻保存再IVM的顺序不同,冻融后同样用ICSI技术对获得的成熟卵母细胞完成授精,并进行体外胚胎培养。结果:玻璃化冻融组复苏存活率、体外成熟率、受精率、及卵裂率均高于慢速程序冻融组(P均<0.05);先玻璃化冷冻再IVM与先IVM再玻璃化冷冻的复苏存活率、体外成熟率、可用卵比率、受精率及卵裂率无统计学意义(P均>0.05)。结论:玻璃化冻融人未成熟卵母细胞能获得更好的冷冻保存效果;玻璃化冷冻与IVM的顺序不影响未成熟卵母细胞的利用。     

短时受精在体外受精-胚胎移植治疗周期中的应用价值

目的比较体外受精-胚胎移植（IVF-ET）治疗中精卵孵育不同时间对胚胎质量的影响。方法按精卵共孵育时间不同将280个周期采集到的卵子3342枚随机分为短时受精组（A组,精卵共同孵育4-6h后随机选取1／2数量卵子脱颗粒细胞）、长受精组（B组,所剩1／2数量卵子,精卵孵育过夜）。分别比较两组的受精率、多精受精率、卵裂率、优质胚胎率、临床妊娠率和胚胎种植率。结果两组的受精率、多精受精率和卵裂率比较差异无统计学意义（P〉0．05）;A组的优质胚胎率、临床妊娠率和胚胎种植率显著高于B组（P〈0．05）。结论缩短精卵孵育时间不影响受精率及卵裂率,相反能提高胚胎质量,从而提高临床妊娠率。     

玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞的影响

目的：通过比较玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞冷冻复苏、体外成熟、胚胎发育及细胞骨架的影响,寻求最佳的卵子冷冻方案。方法：玻璃化冷冻生殖泡期卵（GV）、成熟中期卵（MⅡ）及体外成熟卵（IVM-MⅡ）,解冻复苏后,分别作体外成熟、体外受精（IVF）、胚胎培养或固定作免疫荧光标记,统计复苏率、成熟率、受精率、囊胚率、细胞骨架正常率。结果：GV冷冻组、MⅡ冷冻组及IVM-MⅡ冷冻组三组复苏率差异无显著性（65%vs 60.92%vs 69.93%,P〉0.05）。GV冷冻组的成熟率显著低于对照组（79.6%vs 96.19%,P〈0.01）。GV冷冻组、MII冷冻组及IVM-MⅡ冷冻组三组受精率均明显低于对照组（P〈0.01）,且IVM-MⅡ冷冻组受精率显著低于MⅡ冷冻组（18.06%vs 31.34%,P〈0.01）。IVM-MⅡ冷冻组囊胚率低于MⅡ冷冻组和对照组,差异均有显著性（28.57%vs 52.38%,P〈0.05;28.57%vs 57.14%,P〈0.01）。GV冷冻组染色体和纺锤体均正常率均高于IVM-MⅡ冷冻组（53.85%vs 26.67%,P〈0.05）。IVM-MⅡ冷冻组细胞骨架三项指标均显著低于对照组,差异均有显著性（P〈0.05,P〈0.01）。结论：GV卵先玻璃化冷冻再体外成熟,其细胞骨架损伤较小,胚胎发育较好。     

OPS玻璃化冷冻小鼠MII期卵效果观察

目的　以小鼠为研究模型 ,探讨MII期卵母细胞冷冻后纺锤体和染色体改变的有效观察方法。研究OPS玻璃化冻存成熟卵的可行性。　方法　运用激光扫描共聚焦显微镜 (LSCM)的光学切片和三维图像重建技术 ,系统研究了OPS玻璃化冷冻对小鼠MII期卵纺锤体和染色体的影响。　结果　冷冻组卵复苏后存活率达 5 8% ,纺锤体和染色体形态正常率分别为 46%和 5 2 % ,与对照组 ( 76%和 70 % )相比 ,差异具显著性 (P <0 0 5 )。暴露组卵纺锤体和染色体结构正常率较对照组略有下降 ,但无统计学差异。　结论　LSCM能够清晰有效地观察冷冻对卵母细胞纺锤体和染色体影响。应用OPS玻璃化方法能够有效冻存卵母细胞     

不同激光辅助孵化对玻璃化冷冻和慢速程序冷冻卵裂期胚胎移植妊娠率的影响

目的:研究分析两种激光辅助孵化方法对玻璃化冷冻和慢速程序冷冻卵裂期胚胎移植妊娠率的影响。方法:对2013年11月到2014年7月期间在我院接受冷冻胚胎移植的160例患者进行临床研究,随机分为两组,对照组为进行激光透明带打孔辅助孵化,研究组进行激光透明带薄化辅助孵化,比较组间患者的临床妊娠结局。结果:胚胎经程序冷冻后,研究组胚胎种植率(19.1%)显著高于对照组(12.3%),差异有统计学意义(P<0.05),而解冻后卵裂球存活率(82.21%vs.77.43%)与临床妊娠率(37.5%vs.32.5%)无显著差异(P>0.05);胚胎经玻璃化冷冻后,研究组和对照组解冻后卵裂球存活率(87.48%vs.87.41%)、胚胎的临床妊娠率(37.5%vs.35.0%)、种植率(17.5%vs.15.1%)相比较均无统计学差异(P>0.05);研究组中来源于两种冷冻方法的卵裂期胚胎解冻后卵裂球存活率(87.48%vs.82.21%)、临床妊娠率(37.5%vs.37.5%)和种植率(17.5%vs.19.1%)无统计学差异(P>0.05)。结论:激光透明带削薄优于激光透明带打孔用于辅助孵化,不影响患者的妊娠率,可减少对胚胎的损害。     

精子的获取方式和数量对卵浆内单精子注射治疗男性不育疗效的影响

目的:探讨获取不同的精子来源和数量与卵浆内单精子注射(ICSI)临床结局的关系。方法:比较在IC-SI周期使用不同精子来源(射出精子组比附睾和睾丸精子组)和精子数量(严重少精组比极度少精组)其受精率、卵裂率、优质胚胎率及临床妊娠率。结果:总受精率70.8%,卵裂率95.7%,优质胚胎率47.1%,31个周期获得临床妊娠(35.6%)。射出精子和附睾、睾丸精子两组的受精率、卵裂率、优质胚胎率、临床妊娠率均无显著性差异(P>0.05)。极度少精组的ICSI操作时间比严重少精组要长(P<0.05),但两组间受精率、卵裂率、优质胚胎率、临床妊娠率均无显著差异(P>0.05)。结论:在ICSI周期使用不同来源和不同数量的精子不影响其受精和妊娠结局,然而对于极度少精者实施ICSI时可增加配子在外暴露时间。     

卵母细胞第一极体形态与卵胞浆内单精子显微注射受精率和胚胎质量的关系

目的:了解人卵母细胞第一极体形态与卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)后正常受精率、卵裂率和优质胚胎率的关系。方法:选择行ICSI治疗的110个周期中1017枚人卵母细胞。将卵母细胞第一极体分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四种类型,采用3种来源的精子[手淫取精精子、附睾穿刺/睾丸活检(PESA/TESA)取精精子、冷冻精液精子]授精。ICSI操作后,了解各型第一极体卵母细胞受精率、卵裂率和优质胚胎率。结果:手淫取精患者:各型第一极体卵母细胞正常受精率和卵裂率比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中Ⅲ、Ⅳ型正常受精率低于Ⅰ和Ⅱ型,Ⅱ型卵裂率低于Ⅰ和Ⅲ型。PESA/TESA取精患者:各型第一极体卵母细胞正常受精率和取卵后第3天优质胚胎率比较,差异有统计学意义(χ2=8.488和6.789,P=0.044和0.034),Ⅰ型正常受精率低于Ⅱ和Ⅲ型,Ⅰ和Ⅲ型第3天优质胚胎率高于Ⅱ型。冷冻精液取精患者各指标比较,差异无统计学意义。结论:排除精子来源对受精的影响,正常受精可能和卵母细胞第一极体形态有关。