以ECHO克隆系统构建人生长激素的哺乳动物表达载体

目的:构建ECHO克隆系统构建人生长激素的哺乳动物表达载体,以克服原核生物表达系统生产人生长激素存在的缺陷。方法:实验于2002-08在解放军广州军区广州总医院医学实验科进行。①先把人生长激素基因片段克隆到ECHO系统的供载体中,构建供载体pUni/Lox-HGH。②让该供载体与具Lox位点的受载体在Cre重组酶的作用下融合,构建出人生长激素的哺乳动物表达载体pcDNA4.1/pUni-HGH,使人生长激素基因处于CMV启动子的调控下,EcoRI单酶切及BamHI/EcoRI双酶切鉴定重组质粒。结果:由琼脂糖凝胶电泳和序列测定证实,用ECHO克隆系统构建的融合质粒中,确实含有人生长激素带内含子的基因序列。结论:用ECHO克隆系统可以构建人生长激素的哺乳动物表达载体,且方便、快捷,为取代原核生物表达系统生产人生长激素,提供了依据。     

人KiSS-1基因克隆及其慢病毒载体的构建

背景：慢性病毒载体技术是目前转基因中最有效和最成功的方法，技术操作简便。目的：克隆转移抑制基因KiSS-1基因不含信号肽的表达序列，构建人KiSS-1基因的慢病毒表达载体。设计、时间及地点：开放性实验于200609／2007-12在福建师范大学发育学院实验室完成。材料：载体pNL-IRES2-EGFP由福建师范大学发育学院实验室保存。方法：从人正常胎盘组织中提取总RNA，经反转录-聚合酶链反应得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列，行将其克隆到慢病毒载体pNL-IRES2-EGFP中，构建其表达质粒pNL-IRES2-EGFP-KiSS-1。主要观察指标：KiSS-1目的基国片段的克隆，重组表达质粒pNL-IRES2-EGFP-KiSS-1的酶切鉴定及测序。结果：经酶切鉴定和基因序列测定，证实重组入载体pNL—IRES2-EGFP的片段为目的基因开放阅读框的核苷酸序列。结论：成功构建了重组质粒pNL-IRES2-EGFP-KISS-1。     

人骨形成蛋白2真核表达载体的构建和体外表达

背景：骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP-2）是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，被认为是最具有前途的骨诱导物质。目的：构建人骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况。设计、时间及地点：自身对照实验，于2005-07／2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成。材料：pcDNA3．1（＋）载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠；成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供。方法：从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA，利用反转录．聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA，将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM．T-hBMP-2重组质粒载体，转化到大肠杆菌DH5n后筛选阳性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3．1真核表达载体，将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体，提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后，用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞，反转录-聚合酶链反应检测BMP．2的表达。主要观察指标：①人骨肉瘤细胞总RNA反转录-聚合酶链反应结果。②重组质粒pGEM．T-hBMP-2和pcDNA3．1-hBMP-2的构建和酶切鉴定。③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达。结果：人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后，获得1．2kb条带。经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因，重组质粒pcDNA3．1-hBMP-2构建正确；该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2。 结论：实验成功克隆人骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体。     

人血小板源性生长因子A基因发夹结构小干扰RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的：血小板源性生长因子对诱发视网膜色素上皮细胞移行、最终导致增生性玻璃体视网膜病变起到了重要作用。构建人血小板源性生长因子A具有发夹结构小干扰RNA（shRNA）表达质粒，以观察其对人血小板源性生长因子A基因表达的沉默效果。 方法：实验于2007—04／2007—07在吉林大学第一临床医院传染科研究室完成。根据血小板源性生长因子A基因mRNA序列，设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列，克隆到空载体pGPU6／GFP／Neo中，构建重组质粒，同时设计构建分别针对人GAPDH干扰质粒作为阳性对照,不针对任何特异基因的质粒作为阴性对照。通过酶切鉴定和测序验证阳性克隆。 结果：经重组质粒筛选，重组质粒测序鉴定与设计的shRNA转录模板序列相同，均证实重组质粒构建成功。 结论：利用RNA干扰技术路线可成功构建靶向人血小板源性生长因子A的发夹结构小干扰RNA表达载体。     

大鼠神经营养因子4基因克隆及表达载体的构建

目的：克隆大鼠神经营养因子4全长基因，构建真核细胞表达质粒。 方法：实验于2004—06／2005-12在昆明医学院神经病学研究所完成。选用成年SD大鼠，用反转录聚合酶链反应以大鼠海马总RNA为模板，应用基因重组技术将大鼠神经营养因子4的全长基因克隆到真核表达载体pcDAN3中，构建重组表达质粒。用限制性内切酶酶切分析和DNA测序对重组质粒载体pcDNA3-神经营养因子4进行鉴定。 结果：提取的总RNA电泳出现18S和28S两个条带，聚合酶链反应扩增目的基因为720bp的条带，测序结果为720bp。重组质粒的测序结果经比对与GeneBank上报道的序列一致（M86742），说明神经营养因子4基因已成功克隆至pcDNA3载体中。 结论：正确的克隆了大鼠神经营养因子4基因全序列。     

胰岛细胞瘤相关蛋白2胞内区与IgG Fc段融合基因疫苗的构建及鉴定

目的：构建及鉴定胰岛细胞瘤相关蛋白2胞内区（mIA-2i）和IgG Fc嵌合蛋白的真核表达载体pEGFP-N2／mIA-2i-mIgGFc。 方法：实验于2004-09／2005-07在南京医科大学病原生物学系完成。①采用反转录一聚合酶链反应方法从ICR小鼠的脑组织和脾脏中分别扩增胰岛细胞瘤相关蛋白2胞内区（mIA-2i）和IgG Fc段（mIgG Fc），并引入相应的酶切位点（XhoⅠ／BamH Ⅰ和BmH Ⅰ／EcoRⅠ）。②分别将扩增后的片段克隆入pUCm-T质粒，通过XhoⅠ／BamHⅠ双酶切和连接后，获得pUCm-T／mIA-2i-mIgG Fc重组质粒。③经过XhoⅠ／EcoRⅠ双酶切后，将融合基因mIA-2i-mIgG Fc克隆入真核表达载体pEGFP-N2。通过酶切、聚合酶链反应及插入片段序列测定对重组质粒pEGFP-N2／mIA-2i-mIgG Fc进行鉴定。 结果：①从ICR鼠的脑组织和脾脏中反转录-聚合酶链反应获得胰岛细胞瘤相关蛋白2胞内区和IgG Fc段。②通过基因工程操作，获得重组克隆质粒pUCm-T／mIA-2i和pUCm-T／mIgG Fc，并经酶切鉴定克隆成功。③获得重组克隆质粒pUCm-T／mIA-2i-mIgG Fc，经聚合酶链反应和双位点酶切鉴定重组成功。④获得重组质粒pEGFP-N2/mIA-2i-mIgG Fc和pEGFP-N2/mIA-2i，经聚合酶链反应、酶切及测序鉴定证实特异性片断插入真核表达载体成功。 结论：pEGFP-N2／mIA-2i-mIgG Fc真核表达载体的构建．为利用胰岛细胞瘤相关蛋白2基因疫苗预防非肥胖性糖尿病小鼠发生自身免疫性糖尿病的研究奠定了基础。     

人胰激肽释放酶基因的克隆及表达载体的构建

目的 :克隆中国人胰组织激肽释放酶基因 ,构建原核、真核表达载体 ,为开发生产人源激肽释放酶基因工程产品及人源激肽释放酶基因药物奠定基础。方法 :提取人胰腺组织总RNA ,逆转录后琼脂糖电泳初步鉴定PCR产物。将激肽释放酶cDNA回收、补平后插入克隆质粒KS ,酶切鉴定后 ,对激肽释放酶基因进行序列测定分析。用双酶切法 ,插入原核表达载体PET 2 8b ,真核表达载体pBacPAK9质粒中。酶切鉴定后 ,进行序列测定分析。结果 :本实验克隆的激肽释放酶基因与GenBank报告的激肽释放酶基因相比 ,碱基序列相同。测序分析表明人胰组织激肽释放酶基因经酶切 ,正确插入到原核表达载体PET 2 8b ,真核表达载体pBacPAK9质粒中。结论 :克隆并构建成功中国人组织激肽释放酶基因的原核、真核表达载体 ,可用于基因工程产品及基因药物的深入研究工作     

增强型绿色荧光蛋白基因与人血管内皮生长因子受体KDR基因胞外1-3区域融合表达载体的构建

目的构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与人血管内皮生长因子受体KDR基因胞外1—3区域（KDRn3）的融合基因真核表达载体，为研究KDRn3在抑制视网膜新生血管性疾病中的作用奠定基础。方法以质粒pcDNA3．1／KDRn3为模板，PCR扩增KDRn3基因，将目的片段克隆至pMD18-T载体，其产物双酶切后连接到质粒pEGFP-N1。结果酶切及琼脂糖电泳分析表明提取及纯化的重组质粒含有目的基因片段，大小正确。结论成功构建了EGFP与人KDRn3的融合基因真核表达载体pEGFP-N1／KDRn3。     

小鼠Oct4基因克隆及其真核表达载体的构建

背景：Oct4是第一个被发现只在多能细胞中表达的转录因子，其功能被认为是控制细胞多能性的决定性因素。Oct4的这种作用机制目前并未明确。目的：克隆小鼠Oct4基因，构建其真核表达载体pEGFP—N2-Oct4。设计、时间及地点：单一样本研究，于2007—06／09在江西省分子医学重点实验室完成。材料：TRIzol Reagent由Molecular Rearch CenterInc提供；真核表达质粒载体pEGFP—N2由南昌大学第二附属医院分子医学重点实验室提供。方法：用TRlzol Reagent提取小鼠胚胎干细胞总RNA，并经反转录．聚合酶链反应获得小鼠Oct4DNA，将该基因连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP—N2上，以构建重组质粒pEGFP—N2-Oct4。主要观察指标：总RNA鉴定结果，RT．PCR扩增产物小鼠Oct4分子质量的鉴定结果，重组表达载体的酶切鉴定结果，克隆质粒的测序结果。结果：获取小鼠胚胎干细胞Oct4基因的全序列cDNA。构建Oct4cDNA真核表达质粒时。将增强型绿色荧光蛋白报告基因融合在Oct4基因，并经酶切后DNA电泳鉴定及DNA测序证实。结论：构建重组质粒pEGFP—N2-Oct4成功，将增强型绿色荧光蛋白报告基因融合在Oct4基因的3’端，即保留了Oct4的生物学活性，又便于在研究Oct4生物学功能实验中可检测到蛋白表达。