贝氏柯克斯体实时荧光定量PCR方法的建立及对云南鼠标本检测

目的 建立贝氏柯克斯体荧光定量PCR方法并应用于云南省鼠标本的检测.方法 根据贝氏柯克斯体ISlllla基因设计引物和探针,以克隆的ISlllla基因片断(485 bp)作标准DNA模板,建立实时荧光定量PCR检测方法,并与普通巢式PCR方法进行比较.采用2种方法对云南玉溪自然界采集的鼠各类标本进行检测分析,计算2种方法的检出率.结果 实时荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(cycle threshold,Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=-0.999),重复性测试Ct变异系数(coefficient of variation,CV)为0.25%～3.98%,灵敏度为巢式PCR的10倍.以其他立克次体和常见病原菌共26种DNA为模板进行特异性检测,结果均为阴性.实时荧光定量PCR检测鼠血、肝脏、脾脏中的贝氏柯克斯体,阳性率分别为32.31%、61.29%、85.19%;巢式PCR法检测相应标本阳性率分别为27.69%、11.29%、74.07%;间接免疫荧光试验检测鼠血清中贝氏柯克斯体IgG抗体阳性率为26.15%.结论 本实验建立的实时荧光定量PCR比巢式PCR敏感,且具有良好的特异性,可用于人群和动物贝氏柯克斯体感染监测及临床标本的检测.     

PCR和DNA斑点杂交分析贝氏柯克斯体的核酸标识

目的确认贝氏柯克斯体特异的核酸标识。方法用PCR法特异扩增贝氏柯克斯体24kDa,27kDa、30kDa、34kDa、热休克蛋白B等表面蛋白基因,以及23SrRNA插入序列和16S23SrRNA间区序列等基因片段,从DNA电泳凝胶中回收纯化PCR扩增的目的DNA片段,用地高辛随机引物标记法标记目的DNA片段作探针,行DNA斑点杂交。结果PCR扩得的7个贝氏柯克斯体DNA片段探针只能与贝氏柯克斯体基因组DNA杂交而不能与其他种属的立克次体的基因组杂交,每种探针检测同源目的基因的灵敏度可达到10pg。结论这7种贝氏柯克斯体DNA片段是贝氏柯克斯体特异的DNA片段,可作为贝氏柯克斯体的核酸标识,基于它们的序列设计的引物和探针具有极高的贝氏柯克斯体种特异性。     

实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体

目的建立检测恙虫病东方体的实时荧光定量PCR(quantitative real-ti me PCR)方法。方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计引物和探针,以克隆的56kD基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.999)。荧光定量PCR检测恙虫病东方体的灵敏度约为套式PCR的100倍,并且具有良好的重复性。用该定量PCR检测其它相关立克次体和病原菌DNA样本,检出结果均为0。用该定量PCR检测恙虫病东方体实验感染小鼠的血、脾脏、肺脏、肝脏标本,结果脾脏中东方体出现最早和检出量最多,肝脏和肺脏次之。血中的恙虫病东方体量较低。结论本研究建立的荧光定量PCR方法具有很高的特异性和敏感性,可用于东方体感染早期血样本的快速检测作恙虫病感染早期诊断,并且可以定量分析评价恙虫病东方体感染的程度。     

贝氏柯克斯体被单核细胞吞噬及其在单核细胞内生长的初步研究

目的探讨贝氏柯克斯体被单核细胞吞噬及其在单核细胞内生长的规律。方法将泛影葡胺梯度超速离心纯化的I相贝氏柯克斯体(强毒株)与体外培养人单核细胞(THP-1)相互作用,用免疫荧光染色和显微镜检查单核细胞内贝氏柯克斯体。用Gamma射线灭活贝氏柯克斯体作平行实验。结果在4 h内分析单核细胞的吞噬作用,发现单核细胞内灭活贝氏柯克斯体的数量迅速增加,而活立克次体的数量无明显变化。在第1-6d的实验周期内,单核细胞内灭活贝氏柯克斯体数逐渐减少,第5d近于完全消失;而活贝氏柯克斯体的数量从第4d开始逐渐增加。结论单核细胞吞噬活贝氏柯克斯体的效率明显低于对灭活贝氏柯克斯体的吞噬;活贝氏柯克斯体可以在人单核细胞内缓慢生长繁殖,而灭活贝氏柯克斯体则在单核细胞内逐渐被清除。     

宁夏回族自治区奶牛感染贝氏柯克斯体的血清流行病学调查

目的调查宁夏回族自治区奶牛感染贝氏柯克斯体状况。方法通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检出奶牛血清贝氏柯克斯体抗体,总体阳性率为11.37%(103/906)。结果吴忠市和青铜峡市奶牛贝氏柯克斯体抗体阳性率分别为12.28%和10.44%;不同年龄组的抗体阳性率为9.86%至13.21%;未生育过的奶牛抗体阳性率最高为11.99%。结果显示地区、年龄和胎次均与贝氏柯克斯体感染无统计学差异(P0.05)。结论揭示了宁夏地奶牛贝氏柯克斯体感染普遍存在,对该地区人群健康构成潜在威胁。     

贝氏柯克斯体抑制单核细胞的杀菌活性

目的比较贝氏柯克斯体感染单核细胞和非感染单核细胞的蛋白谱,发现该柯克斯体感染诱导单核细胞表达蛋白。方法用贝氏柯克斯体I相毒株感染人单核细胞(THP-1),采用等电聚焦和SDS-PAGE双向电泳对感染单核细胞和非感染单核细胞同时做蛋白分离,用专业电泳图谱分析软件发现它们之间的差异表达蛋白,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪鉴定差异表达蛋白。结果质谱分析鉴定97个差异表达蛋白,经蛋白氨基酸序列数据库检索和生物信息学分析发现其中15个差异表达蛋白参与调节单核细胞的吞噬、杀菌、细胞凋亡等。结论贝氏柯克斯体侵入单核细胞诱导细胞某些蛋白分子差异表达,增强柯克斯体细胞内入侵、抑制单核细胞的杀菌活性和细胞凋亡,促进贝氏柯克斯体在细胞内生存。     

氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体组分Q热疫苗的免疫保护性评价

目的动物实验评价采用国内分离株研制的氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体组分Q热疫苗(CMRV)的免疫保护性。方法将三批小量制备的CMRV和灭活贝氏柯克斯体Q热疫苗(WCV)分别用1μg、10μg、100μg三个剂量皮下注射免疫BALB/c小鼠,4周后用初次免疫的一半剂量腹腔注射加强免疫1次,2周后用107的贝氏柯克斯体强毒株腹腔注射感染免疫小鼠,感染第7d活杀小鼠、摘取小鼠脾脏,用荧光定量PCR检测小鼠脾脏组织的贝氏柯克斯体。结果所有Q热疫苗免疫组的小鼠脾脏荷菌量均显著少于非免疫组,100μg免疫组的荷菌量显著低于10μg免疫组,10μg疫苗组显著低于1μg免疫组。每批CMRV免疫组与相同剂量WCV免疫组之间的贝氏柯克斯体含量无显著差异。结论国内分离株研制的氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体组分Q热疫苗具有与灭活Q热疫苗一样良好的抗贝氏柯克斯体感染的免疫保护性。     

实时荧光定量PCR检测五日热巴通体

目的 采用TaqMan-MGB探针建立检测五日热巴通体的实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）方法。方法 根据五日热巴通体特异的16-23S rRNA间隔区序列设计引物和探针，以克隆的16-23S rRNA间隔区基因片段作DNA模板，建立了检测五日热巴通体实时荧光定量检测方法。结果 建立的定量标准曲线的循环阈值（Ct）与模板拷贝数呈良好的线性关系（r=0．996）；与普通PCR相比较，荧光定量PCR检测的灵敏度约为它的200倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体和细菌，检出结果为阴性。实时荧光定量PCR检测五日热巴通体实验感染小鼠血、脾脏、肝脏和肺组织DNA样本，脾脏和肝脏样本中检出较高水平五日热巴通体DNA，血和肺部检出的目的DNA的水平较低。结论 本研究建立的检测五日热巴通体的实时荧光定量PCR法具有很高的检测灵敏度和特异性，可用于临床患者血样本的检测，作五日热的早期诊断。     

苣荬菜乙醇提取液抗贝氏柯克斯体的初步研究

目的初步探讨苣荬菜（北败酱）乙醇提取物的抗Q热病原菌－贝氏柯克斯体药效。方法用乙醇提取苣荬菜,1g 干生药获得1mL提取液;用贝氏柯克斯体腹腔感染Balb/c小鼠 (105菌体/只) 感染后第2d用倍比（5-160倍）稀释苣荬菜乙醇提取液腹腔给药,每天1次、连续给药5d;第7d处死小鼠并取小鼠脾脏组织提取DNA,用种特异性荧光定量PCR检测DNA。结果10、20、40、80倍稀释药物组小鼠脾脏贝氏柯克斯体载量约2～5倍少于非药物处理对照组,其中20倍稀释药物组的小鼠脾脏贝氏柯克斯体载量显著（5倍）少于对照组。结论我们的研究首次证明苣荬菜乙醇提取物对贝氏柯克斯体体内生长有明显的抑制作用,提示它具有潜在的抗贝氏柯克斯体药效。     

实时荧光定量PCR对兔戊型肝炎病毒(HEV)的检测及评估

目的 兔戊型肝炎病毒(HEV)是近年来新发现的,根据其分子生物学特征可能成为HEV的新基因型。为提高对兔HEV的检出率,本研究设计了针对兔HEV RNA的特异性引物和TaqMan探针并对其进行考评。方法 1)从GenBank中下载14条兔HEV全长序列,分别在其ORF1、ORF3片段的保守区域设计一条TaqMan探针和一对上、下游特异性引物,其中ORF1片段的探针及引物为C组,ORF3片段的为B组;A组的探针及引物为Jothikumar N等所报道的通用引物;2)制备相应的质粒标准品来构建定量标准曲线,并利用上述3套引物、探针对49份兔粪便及44份兔血液样品进行检测,将B、C组检测结果与A组的检测结果进行比较。结果 新建立了两套兔HEV定量PCR的TaqMan探针及引物(B、C组),其标准曲线的斜率分别为-3.455和-3.469;使用上述3套引物及探针(A、B、C组)对49份粪便标本进行荧光定量PCR检测,其HEV RNA阳性率分别为67.35%(33/49)、67.35%(33/49)、57.14%(28/49),平均HEV RNA(log copies/g)拷贝数为6.18、5.90、6.11;44份血液标本的HEV RNA阳性检出率分别为65.90%(29/44 )、56.82%(25/44)、50.00%(22/44),平均HEV RNA(log copies/mL)拷贝数为3.62、3.43、3.03;结果显示以上3组探针及引物均可用于粪便和血液标本的定量检测。结论 兔HEV虽然有其独特的基因结构,但使用HEV通用引物检测不影响检出率。     

Q热立克次体基因文库的构建

Q热立克次体七医株用6种限制性平端内切酶部分酶切,电泳回收0.2—7kb大小DNA片段,EcoRI位点甲基化,加上EcoRI接头,与去磷酸化λgtll DNA-EcoRI臂连接,经体外包装后感染E.coli Y1090,建成含2.6×10~6重组子的表达型基因文库。随机选择的噬菌体DNA经EcoRI酶切鉴定,重组子含大小不等的插入DNA片段。     

氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体组分Q热疫苗的安全性评价

目的评价采用国内分离株研制的氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体组分Q热疫苗(CMRV)的安全性。方法分别用3批CMRV和灭活贝氏柯克斯体Q热疫苗(WCV)致敏豚鼠,4w后用相同疫苗对致敏豚鼠作皮肤试验。结果CMRV致敏豚鼠与WCV致敏豚鼠的皮试点红肿大小在皮试后1～6d无显著差异,但是从第7d开始,差异显著。皮试后第14d采集接种部位组织做病理切片,WCV致敏豚鼠皮试点的表皮组织有局灶性变性、坏死,并见大量炎性细胞浸润。CMRV致敏豚鼠的皮试点组织基本正常,少数豚鼠偶见局灶性变性,但无坏死现象。3批CMRV致敏豚鼠皮试点组织病变程度相似,均显著轻于WCV致敏豚鼠。结论采用国内分离株研制的氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体组分Q热疫苗的免疫副作用显著轻于灭活Q热疫苗,具有更好的安全性。     

实时荧光定量PCR法分析结核分枝杆菌对异烟肼耐药的分析

目的利用实时荧光定量PCR技术快速检测异烟肼耐药结核分枝杆菌。方法收集到医院就诊的结核病疑似患者痰液样本,提取痰液样本的总DNA,利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术对结核分枝杆菌感染进行快速筛查,并与传统药敏试验进行比较,对两者的灵敏度、特异性、一致性进行比较分析。结果检测346例结核病人临床分离培养样本,药敏试验检出257例异烟肼敏感标本,101例异烟肼耐药标本;实时荧光定量PCR法共检测出异烟肼敏感和耐药标本225例98例,灵敏度为86.64%,特异性为93.92%,一致率为93.12%。结论跟传统药物敏感性实验相比,实时荧光定量PCR法检测速度快速、特异性强、灵敏度较高,可用于结核分枝杆菌耐异烟肼突变的快速检测,适于耐多药结核病的快速筛查。     

我国西北部分地区Q热分子流行病学调查

目的了解西北部分地区人群及媒介蜱Q热感染情况。方法采用布旗法采集游离蜱,应用巢式PCR扩增蜱Q热贝氏柯克斯体;采用间接免疫荧光法对当地居民进行血清Q热抗体检测。结果共检测11个蜱种2 460只蜱标本,有8个蜱种239只贝氏柯克斯体DNA阳性,总阳性率为9.72%。不同蜱种间阳性率差异有统计学意义(2χ=16.69,P<0.01),其中以青海血蜱阳性率最高,为59.38%;四省区阳性率差异有统计学意义(2χ=13.28,P<0.01),以宁夏阳性率最高,为17.96%。共采集当地居民血清725份,抗体检测阳性51份,不同职业人群抗体阳性率差异有统计学意义(χ2=4.03,P<0.05),以牧民阳性率为最高。相关危险因素调查显示,饲养牛羊、饲养的牛羊有不明原因流产、给牛羊接生时未采取保护措施等因素与血清学阳性率有关,其中前两个因素为危险因素,而接生时采取保护措施为保护因素。结论我国西北地区蜱及当地居民存在Q热感染现象。