Nested PCR检测HBV DNA技术的建立与应用

本研究建立一种Nested PCR技术检测HBV DNA,即采用内外两对引物分别进行连续两次扩增,使检测极限由一次PCR的10~(-2)Pg提高到10~(-5)Pg;经~(32)P标记寡核苷酸探针作Southern转移杂交以及BgIⅡ作酶切分析证实两次扩增均为特异性扩增。通过抗-HBe阳性、单项抗一HBc阳性和单项抗-HBs阳性三种血清的HBV DNA的检测,表明该方法确能检出标准PCR所不能检出的极低水平的HBV感染,对提高乙型肝炎的诊断水平及更准确地评价药物疗效有重要意义。     

以二氧化硅快速提取HBV－DNA用于双阶变温PCR检测

以异硫氰酸胍裂解血清释放核酸使被二氧化硅吸附，经乙醇洗涤后用水悬浮，上清即含纯化ＤＮＡ。结合双阶变温ＰＣＲ建立一种简单快速的血清ＨＢＶ－ＤＮＡ检测方法。该法只需检测１０ｕｌ血清，完成提取和扩增只要３ｈ．操作很易掌握。用之检测５６例ＨＢｓＡｇ＋／ＨＢｅＡｇ＋的血清、４２例ＨＢｓＡｇ＋／ＨＢｅＡｇ－的血清和５４例ＨＢｓＡｇ／ＨＢｅＡｇ的血清，结果ＨＢＶ－ＤＮＡ检出率分别为８６％、５７％和１３％。应用表明这是一种简捷有效的核酸纯化和扩增方法，适于对大量临床样本作检测之用。     

HBV—DNA不同模板制备进行多聚酶链基因扩增

本文采用 4.2mol/L异硫氰酸胍、25mmol/L柠檬酸钠、0.1mol/L2一巯基乙醇,0.5%(W/V)十二烷基肌氨酸钠作为裂解液进行一步法程序式抽提血清标本HBV—DNA模板用于多聚酶链基因扩增.该法与常规DSD抽提法及微量直接法进行比较,具有方法简单、稳定、不易污染且敏感性高.抽提过程可在1个小时内完成,经酶切及a~(32)P标记探针放射自显影鉴定PCR产物具良好特异性,该法尤其适应于大量临床标本的检测,值得推广使用.     

建立检测血清HBV DNA的多聚酶链反应技术

建立检测血清HBV DNA的多聚酶链反应技术。人工合成adr、adw和ayw三个业型HBV的两个共有序列NC1和NC2作为引物扩增一长428bp且含一BglⅡ酶切点的HBV C基因片段。含FD酶的反应体系在水浴93℃30秒、55℃60秒、72℃90秒依序循环30周期,当克隆HBV DNA模板最小加量为10 fg时,产物作琼脂糖凝胶电泳经溴化乙锭染色在紫外线下观察仍可见428 bp位置的阳性荧光带。阳性产物经BgⅠⅡ酶切后分为125 bp和303 bp的两个特异片段。同一条件下的阴性对照则出现阴性结果。这一技术用以检测经常规DNA提取的127例HBsAg阳性血清,结果HBV DNA检出率达88％,其中HBeAg阳性血清HBV DNA检出率为97％,抗HBeAg阳性血清HBV DNA检出率为82％。     

荧光偏振检测HBV DNA C区BCP双突变

目的：建立简便、灵敏的HBV DNA序列中BCP双突变点的检测方法．方法：采用终点终止法和偏振光检测技术进行点突变的检测．首先对HBV C区基因进行PCR扩增，然后用特异探针与扩增产物中待测核苷酸的下游序列杂交，使探针的3’端可以在DNA聚合酶的催化下，依据其互补链上的待测核苷酸连接上一个标有特定荧光素的ddNTP，然后检测该3’端带有荧光素的探针，根据检测到的荧光素种类和偏振光的强度可以判定待测点是何种核苷酸．结果：该方法可以检测出HBV基因序列中BCP双突变核苷酸类型以及检测1个拷贝的模板，并且可以从BCP野性株DNA序列中检出5％BCP双突变DNA序列．结论：该技术可以检测血清中HBV DNA C区BCP双突变．     

荧光定量PCR与ELISA法检测HBV-DNA结果分析

目的 :应用荧光定量PCR方法精确检测HBV -DNA的拷贝数 ,为临床判断病毒复制程度提供指标 ;对比分析荧光定量PCR方法和ELISA方法检测HBV -DNA的结果。方法 :用荧光定量PCR法检测 10 14例用ELISA法诊断为乙型肝炎病人的血清HBV -DNA拷贝数。结果 :10 14例病人中 ,病毒拷贝数≥ 1× 10 5的 4 99例 ,阳性率4 9.2 % ;HBeAg阳性患者的HBV -DNA拷贝数≥ 1× 10 5的阳性率显著高于HBeAg阴性患者。结论 :荧光定量PCR检测HBV病毒复制情况结果准确 ,对临床工作指导意义更大 ;HBeAg是一项重要指标。     

血清,白细胞HBV—DNA的PCR检测结果与HBV血清复制标志的关系

３０例慢性乙型肝炎患者中，有５３．３％的病人用ＰＣＲ可从血清和白细胞中检测出ＨＢＶ－ＤＮＡ；ＨＢｅＡｇ阳性和抗－ＨＢｃ－ＩｇＭ阳性的患者１００％可以检出ＨＢＶ－ＤＮＡ，而仅抗－ＨＢｃＩｇＭ阳性的患者ＨＢＶ－ＤＮＡ的检出率为６６．７％。１３例乙肝血清学复制标志阴性的病人中有５例（３８．５％）也可检测出ＨＢＶ－ＤＮＡ。在ＨＢｓＡｇ转阴的３例病人中有１例可从白细胞中检测出ＨＢＶ－ＤＮＡ。     

HBV－DNA与HBVm检测结果对比分析

目的: 了解乙型肝炎病毒 (HBV)感染者体内 HBV- DNA含量 , 并探讨其临床意义 . 方法: 本文采用荧光定量聚合酶链反应 (FQ- PCR)和 ELISA两种方法同时检测了 822份血清 , 并对结果进行了对比分析 , 结果: 266例 HBsAg(+ )、 HBeAg(+ )、 HBcAg(+ )组的血清 HBV- DNA检出率为 87. 22% (232例 ), 平均拷贝数为 1. 72× 109.ml; 211例 HBsAg(+ )、 HBeAb(+ )、 HBvAb(+ )组血清 HBV- DNA检出率为 21. 27% (47例 ), 平均拷贝数为 6. 66× 108/ml, 190例 HBsAg(+ )、 HBcAb(+ )组血清 HBV- DNA检出率为 37.37% (71例 ), 平均拷贝数为 4.56× 108/ml; 47例 HBVm全阴性组血清 HBV- DNA检出率为 8.51% (4例 ), 平均拷贝数为 1.54× 108/ml. 结论: HBVm阴性的病人也可能有 HBV- DNA阳性 , 因此为临床提供 HBV感染、复制及传染性的判断以及指导治疗 , HBV- DNA定量 PCR检测具有重要的意义 .     

荧光定量聚合酶链反应检测血清HBV DNA及临床应用价值

目的：应用光定量聚合酶链反应（FQ－PCR）技术检测血清HBV DNA,评价其临床应用价值。方法：选取乙型肝炎病毒感染各时期血清标本331例,用荧光定量PCR法测定HBV DNA浓度。结果：119例HBsAg,HBeAg,HBcAb阳性标本,HBV DNA阳性率为98．3％;182例HBsAg,HBeAg,HBcAb阳性的血清标本,阳性率为52．3％;HBsAg,HBeAg阴性标本20便,1例阳性。结论：FQ－PCR技术检测血清HBV DNA,可以反映乙肝病毒感染的实际情况及复制水平,为确定乙型肝炎的临床诊断,可为选择治疗方案和评估药物疗效提供较可靠的理论依据。     

FQ-PCR检测HBV DNA效果分析

目的检测血清中乙型肝炎病毒(HBV)DNA拷贝数,分析乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)与血清免疫标志物的关系。方法采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测血清样本中HBV-DNA含量;同时酶联免疫吸附法(ELISA)检测HBV血清标志物(HBVM),并对检测结果进行分析。结果在HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)组(大三阳组)和HBsAg(+) HBeAg(+)组HBV-DNA阳性率分别为96.1%（298/310）和96.6%（28/29）,病毒含量为：1.85×108copies/ml;HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)组(小三阳组)和HBsAg(+)HBcAb(+)组患者血清HBV-DNA阳性率分别为44.2%(80/181)和82.9%（31/41）,病毒含量为：4.8×106copies/ml。血清中HBeAg与HBVDNA含量密切相关。结论荧光定量PCR在乙肝的诊断、判断传染性强弱及评价抗病毒治疗效果方面具有较大的临床应用价值。     

PCR技术用于检测肝细胞癌石蜡包埋肝组织中的HBV DNA

用多聚酶链反应(PCR)技术检测了16例肝细胞性肝癌(HCC)患者癌灶和癌旁双份组织石蜡包埋标本中的乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)。以C基因引物扩增HBV-DNA,32份标本中检出率71.87％。以新鲜冷冻肝标本作对照检出率81.25％,二者相比无显著性差别(X~=0.57,P>0.05)。以质粒提取HBV-DNA作灵敏度测定,PCR-EB可达10fg,PCR-SBH可达lag。应用非放射性的地高辛素标记探针作杂交灵敏度达~32P标记探针的水平。     

乙型肝炎病毒荧光定量聚和酶链反应检测结果分析

乙肝病毒长期以来一直危害着人们的健康 ,乙肝患者血清病毒水平并非衡定不变 ,而是随肝脏炎症情况波动 ,乙肝病毒含量在病程中的变化规律一直为人们所关注 ,ＦＱ -ＰＣＲ结合ＰＣＲ和探针杂交荧光标记的优点 ,能够及时准确的反映患者所处的临床阶段及药物的疗效。1　材料和方法1.1. 　检测对象　收集表面抗原阳性血清 111例 ,其中ＨＢ ｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗ＨＢＣ阳性血清 4 7例 ,ＨＢｓＡｇ、ＨＢｓＡｂ、抗ＨＢＣ阳性血清 30例 ,ＨＢｓＡｇ、抗ＨＢＣ阳性血清 34例 ,同时收集ＨＢｓ、抗ＨＢＣ阳性血清 2 0例 ,抗ＨＢｓ阳性血清 2 9例 ,…     

血清、白细胞HBV－DNA的PCR检测结果与HBV血清复制标志的关系

３０例慢性乙型肝炎患者中，有５３．３％的病人用ＰＣＲ可从清和白细胞中检测出ＨＢＶ－ＤＮＡ；ＨＢｅＡｇ阳性和抗－ＮＢｃ－ＩｇＭ阳性的患者１００％可以检出ＨＢＶ－ＤＮＡ，而仅抗－ＨＢｃ－ＩｇＭ阳性的患者ＨＢＶ－ＤＮＡ的检出率为６６．７％。１３例乙肝血清学复制标志阴性的病人中有５例（３８．５％）也可检测出ＨＢＶ－ＤＮＡ。在ＨＢｓＡｇ转阴的３例病人中有１例可从白细胞中检测出ＨＢＶ－ＤＮＡ。     

标本因素对荧光定量PCR检测HBV DNA的影响

目的: 探讨标本溶血、黄疸、脂血对荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA的影响。方法: 荧光定量PCR检测无溶血、无黄疸、非脂血血清和溶血、黄疸、高脂血清标本的HBV DNA。结果: 溶血、黄疸、高脂血血清与无溶血、无黄疸、非脂血血清HBV DNA定量检测结果差异均无统计学意义(P>0.05)。结论: 标本溶血、黄疸、脂血对荧光定量PCR检测HBV DNA无干扰。     

建立简便HBV、DNA、PCR-ELISA检测方法

目的：建立一种敏感，特异的乙型肝炎病毒（HBV）DNA检测方法。方法：应用PCR扩增技术和核酸杂交技术结合酶促显色技术（即PCR-ELISA技术）来检测血清中的HBVDNA。结果：应用PCR-ELISA技术能够检出许多PCR琼脂糖凝胶电泳所检测不到的HBVDNA，大大地提高了检出率，而且，特异性强，结论：PCR-ELISA方法灵敏度高，特异强，检测结果数据化，不受主观因素的影响。     

多重PCR检测HBV和HCV方法的建立

目的:建立可同时检测血清HBVDNA和HCVRNA的多重PCR。方法:利用已知的基因序列设计了对于不同亚型HBV保守的C基因区的一对引物HBV-P623及对于不同亚型HCV高度保守的位于5’端非编码区(5’-NCR)的两对引物HCV-P289和HCV-P174,扩增经基因释放剂(Genereleaser)处理的HBV和HCV阳性血清。结果:多重引物、逆转录套式PCR反应体系可同时扩增HBV DNA和HCV RNA,分别在623bp和174bp处出现特异DNA扩增带。该反应体系具有较高的特异和敏感性,受检血清中仅含有10fgHBV DNA和5CID HCV RNA即可检出。血清标本不需要提取核酸,可直接进行PCR。用此体系检测30例输血后病人血清,其中15例为HBV感染,8例为HCV感染,7例为阴性。结论:多重PCR检测HBV及HCV的方法具有简便性和实用性。     

HBsAg携带者HBV DNA的检测及结果分析

本文用聚合酶链反应技术，检测了３８７例ＨＢｓＡｇ携带者人群中的ＨＢＶ ＤＮＡ，其阳性率为３５．９％，男性的阳性率（３９．１５％）高于女性（３２．８％），且随年龄的增高而明显下降，并与ＨＢｓＡｇ滴度呈正相关。认为可通过观察ＨＢｓＡｇ滴度来估计乙型肝炎病毒是否复制和具有传染性的指标。     

PCR与ELISA检测3815例血清中HBV—DNA的对比分析

为更清楚地了解乙肝病毒标志物和ＰＣＲ检测ＨＢＶ－ＤＮＡ之间的相互关系，我们用两种方法同时进行检测，结果表明：ＰＣＲ与血清标志物ＨＢｓＡｇ，ＨＢｅＡｇ，抗ＨＢｃ，抗ＨＢｅ有着良好的相关性，而且ＰＣＲ更灵敏，更特异，尤其对乙肝标志物全阴性的患者更具有价值。ＥＬＩＳＡ法也具有ＰＣＲ不可替代的作用。