RNA干扰抑制c-Met表达对喉癌Hep-2细胞体内外生长的影响

目的 采用RNA干扰(RNAi)技术抑制人喉癌Hep-2细胞c-Met基因表达,观察对其体外生物学活性和体内生长的影响.方法 构建能够表达针对c-Met的小干扰RNA的RNAi质粒和表达不针对任何已知mRNA的siRNA的阴性对照RNAi质粒,采用阳离子脂质体Lipofectamine2000作为转染试剂将其转染人喉癌细胞株Hep-2,通过RT-PCR及Western Blot方法检测转染效率,筛选出抑制效果最好的c-Met-siRNA序列;通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、运动实验及侵袭实验比较转染前后细胞的生长、运动及侵袭能力.在裸鼠喉癌皮下荷瘤模型模拟c-Met-siRNA基因治疗实验中,采用Western Blot法检测重组质粒对c-Met基因及MMP-9、VEGF基因表达的影响.结果 pSilencer2.0/c-Met-shRNA转染人喉癌细胞株Hep-2后,c-Met的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P值分别为0.003和0.02),细胞的生长、运动及侵袭均受到明显抑制(P值分别为0.001,0.004和0.004).肿瘤接种到裸鼠后第35天,重组质粒组肿瘤体积为(138±27)mm~3,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01);重组质粒组瘤体内c-Met、MMP-9、VEGF基因表达率比对照组明显降低(P<0.05).结论 c-Met-siRNA能成功下调靶基因的表达,并能显著抑制喉癌Hep-2细胞的生长、运动、侵袭及移植裸鼠成瘤后的生长,siRNA表达质粒介导的基因治疗有希望成为喉癌靶向性c-Met治疗的新策略.     

串珠素反义cDNA质粒转染对喉癌细胞Hep-2增殖能力的影响

目的：研究串珠素反义cDNA质粒转染对喉癌细胞Hep-2增殖能力的影响。方法：利用阳离子脂质体作为载体，把重组真核表达载体串珠素反义cDNA质粒pAP转染喉癌细胞Hep-2。通过RT—PCR、Westernblot及MTT法检测转染后Hep-2细胞串珠素mRNA、蛋白质表达及细胞增殖水平，并观察转染后Hep-2细胞对碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的反应性。将Hep2细胞分3组：①未转染的Hep-2细胞组（WT组）；②空载体ph8Apr—neol转染组（neo组）；③串珠素反义cDNA质粒pAP转染组（pAP组）。结果：将质粒pAP成功地转入Hep2细胞，获得了稳定表达串珠素反义cDNA基因的细胞系。串珠素mRNA和蛋白质水平在pAP组低表达，在WT组和neo组高表达，均差异有统计学意义（均P〈O．01）。在0．1％FCS的RPMI1640培养基培养下，WT组、neo组和pAP组细胞的增殖率均降低，但pAP组细胞的增殖与WT组和neo组细胞相比明显减低；在0．1％FCS加1μg／L bFGF的RPMI1640培养液培养下．WT组和neo组细胞增殖接近正常，但pAP组细胞的增殖能力较弱。结论：串珠素反义cDNA质粒转染可以有效抑制喉癌细胞Hep2的增殖能力。     

表达超抗原葡萄球菌肠毒素A的喉癌细胞的建立

目的:构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因真核表达载体并建立其稳定表达的喉癌细胞系。方法:根据标准葡萄球菌菌株ATCC13565中SEA基因序列,人工合成其编码区序列,然后亚克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP,构建pSEA-IRES-EGFP重组质粒,再将重组质粒转染至喉癌Hep-2细胞,G418筛选获得抗性单克隆,用RT-PCR和ELISA法鉴定SEA在喉癌细胞中的表达。结果:合成的SEA基因亚克隆至真核表达载体pires-EGFP后,测序证实克隆的SEA序列与GenBank中标准葡萄球菌菌株ATCC13565的编码区序列完全一致;重组质粒转染喉癌Hep-2细胞后,经筛选2周获得抗性单克隆,挑选单克隆,RT-PCR扩增获得特异的基因片段。经ELISA分析,发现细胞培养上清液中SEA蛋白的含量达pg级水平。结论:成功构建了超抗原SEA基因的重组真核表达载体,转染至喉癌Hep-2细胞后,SEA基因能够在细胞表达并持续分泌SEA蛋白。     

质粒载体介导CD基因对喉癌细胞的杀伤作用研究

目的构建含酵母菌自杀基因CD的质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CD,并利用该载体进行喉癌Hep-2细胞株转染研究,体外实验观察前体药物5-FC对稳定表达CD基因的喉癌Hep-2细胞株的杀伤作用.方法通过RT-PCR从酵母菌RNA内扩增出CD基因全长CDS序列,将其定向克隆到质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV中,重组体质粒经XhoI/HindⅢ双酶切鉴定,并对重组体中的CD基因片段进行序列分析,将鉴定好的阳性重组质粒pcDNA3.1(-)CMV.CD运用电穿孔法转入喉癌Hep-2细胞中.经300～600 μg/mlG418正筛选14 d和10 μg/ml前体药物5-FC负筛选,获得稳定表达CD基因的喉癌Hep-2细胞株,提取该细胞株细胞的总RNA,经RT-PCR鉴定CD基因的表达.MTT法观察不同浓度5-FC对稳定表达CD基因的喉癌Hep-2细胞及转染空白载体pcDNA3.1(-)CMV的对照组喉癌Hep-2细胞的杀伤作用.结果阳性重组质粒pcDNA3.1(-)CMV.CD经XhoI/HindⅢ双酶切后获得5353 bp的片段及496 bp的插入片段,DNA自动序列分析证明重组体质粒含完整的477 bp长的CD基因CDS序列.RT-PCR从转染细胞总RNA中扩出453 bp的预期片段.当添加不同浓度的5-FC时,表达CD基因的Hep-2细胞不同程度地被杀死,而对照组的细胞几乎未受到影响,两组细胞的相对生存率具有显著差异性(P<0.05).结论成功构建了质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CD,建立了稳定表达酵母菌CD基因的喉癌表达CD基因的Hep-2细胞株,表达CD基因的Hep-2细胞可以被5-FC杀死.     

Tiam1过表达调控喉癌生长及侵袭转移的体内外实验研究

目的 前期研究显示T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam1)与喉癌临床预后密切相关。为了进一步明确Tiam1对喉癌生物学行为的影响,通过上调Tiam1在喉癌细胞中的表达,观察Tiam1上调后对喉癌细胞体内外增殖和侵袭转移能力的影响。方法 通过质粒转染构建Tiam1稳定过表达的喉癌Hep-2细胞(Hep-2/Tiam1);本实验以pcDNA3(Mock)质粒作为转染对照。实验共分3组：空白对照组(Hep-2),转染pcDNA3(Mock)的Hep-2细胞株(Hep-2/Mock)和稳定转染Tiam1基因的Hep-2细胞株(Hep-2/Tiam1)。通过MTT、划痕实验及Transwell侵袭实验观察Tiam1过表达后对Hep-2细胞体外增殖、迁移及侵袭能力的影响。通过构建喉癌裸鼠移植瘤动物模型,进一步在体内水平观察Tiam1对喉癌的增殖及侵袭转移能力的影响。结果 MTT实验显示Hep-2/Tiam1与对照组Hep-2及转染空载体的Hep-2比较,各组之间细胞的增殖能力无明显差异(P>0.05)。划痕实验显示Hep-2/Tiam1细胞的迁移距离明显多于另两组(P<0.05)。Tr...     

Stat3反义核苷酸通过调节凋亡相关因子诱导喉癌细胞凋亡

目的:探讨反义Stat3基因诱导喉癌细胞凋亡的机制。方法:将设计好的已证实能诱导人喉癌细胞凋亡的Stat3反义寡核苷酸序列,应用脂质体瞬时转染法转染人喉癌Hep-2细胞,应用Western blot、PCR检测Hep-2细胞中Bcl-2,Bax及C-Myc基因及蛋白的表达情况。结果:Western blot和RT-PCR结果显示转染Stat3反义寡核苷酸细胞组,Bax的表达随反义寡核苷酸浓度增加,表达增强,而Bcl-2及C-Myc的表达则减弱。结论:反义Stat3寡核苷酸通过上调Bax,下调Bcl-2及C-Myc基因表达来参与其诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡的过程。     

XIAP反义寡核苷酸对喉癌Hep-2细胞化疗增敏作用的研究

目的 通过X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASODN)转染喉癌Hep-2细胞,探讨其对喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响.方法 体外培养人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞,应用脂质体法进行XIAP ASODN基因转染,荧光显微镜下观察计算转...     

靶向性基因导入系统介导p16基因对喉鳞状细胞癌抑制作用

目的 探讨一种新的靶向性非病毒型基因导入系统GE7-HA20介导P16基因对喉鳞状细胞癌的抑制作用。方法 建立喉癌裸鼠移植瘤模型;构建外源性基因(β-半乳糖苷酶报道基因及P16基因)和多肽载体系统复合物;在体内外观察P16基因对喉癌的抑制情况;LSAB法观察Hep-2细胞转染前后的P16表达。结果 靶向性多肽基因导入系统可将β-gal导入裸鼠移植瘤内呈阳性反应呈蓝染,LSAB显示转染后P16基因的表达明显升高,P16基因具有抑制肿瘤生长作用并有统计学意义(P<0.05)。结论 GE7-HA20系统借助于表皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor,EGFR)可靶向性将目的基因导入喉癌中并得到高效表达;体内外导入p16基因后可显著抑制喉鳞状细胞癌。     

反义端粒酶催化亚单位抑制喉癌细胞生长的离体实验研究

目的：探讨人端粒酶催化亚单位（hTERT)反义寡核苷酸对人喉癌细胞株Hep-2的生长抑制作用。方法；用脂质体包裹hTERT反义寡核苷酸转染体外培养的Hep-2细胞，分别于转染后24、48、72h用MTT法检测细胞增殖活性，转染的72h行HE染色及端粒酶活性测定。结果：转染后细胞增殖活性降低；细胞生长密度下降；端粒酶活性受到抑制。结论：hTERT反义寡核苷酸短期内可以降低端粒酶活性、抑制喉癌细胞的生长。     

CXCR4小干扰RNA对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的 探讨CXC族趋化因子受体4(CXCchemokine receptor 4,CXCR4)小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)对人喉癌细胞株Hep-2细胞裸鼠体形成的移植瘤淋巴结微转移的影响.方法 将与CXCR4mRNA互补的siRNA通过阳离子脂质体转染Hep-2细胞,用RT-...     

串珠素反义cDNA对人喉癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的：研究串珠素（perlecan）反义cDNA质粒（pAP）对喉癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤的影响。方法：应用pAP转染喉癌Hep-2细胞,建立人喉癌裸鼠移植瘤模型,观察裸鼠移植瘤的生长速度。分为3组：未转染的Hep-2细胞组（WT组）、空载体phβApr-neol转染组（neo组）及pAP转染组（pAP组）。用RT-PCR和免疫组织化学方法检测各组裸鼠移植瘤的perlecan mRNA和蛋白质的表达情况。结果：肿瘤生长4周后,WT组和neo组裸鼠移植瘤的平均体积较大,pAP组裸鼠移植瘤的平均体积较小,差异有统计学意义（P〈0.01）。perlecan mRNA在WT组和neo组高表达,在pAP组低表达,均差异有统计学意义（均P〈0.05）。perlecan蛋白在WT组和neo组高表达,定位于癌细胞的细胞核和细胞质,在pAP组低表达,均差异有统计学意义（均P〈0.01）。结论：pAP对喉癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤的发生、发展有重要影响。     

自杀基因质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CD的构建及进行喉癌Hep-2细胞株转染研究

目的:构建含酵母菌自杀基因CD的质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CD,并利用该载体进行喉癌Hep2细胞株转染研究,体外实验观察前体药物5FC对稳定表达CD基因的喉癌Hep2细胞株的杀伤作用。方法:通过RTPCR从酵母菌RNA内扩增出CD基因全长CDS序列,将其定向克隆到质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV中,重组体质粒经XhoI/HindⅢ双酶切鉴定,并对重组体中的CD基因片段进行序列分析,将鉴定好的阳性重组质粒pcDNA3.1(-)CMV.CD运用电穿孔法转入喉癌Hep2细胞中。经300～600mg/LG418正筛选14d和10mg/L前体药物5FC负筛选,获得稳定表达CD基因的喉癌Hep2细胞株,提取该细胞株细胞的总RNA,经RTPCR鉴定CD基因的表达。四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察不同浓度5FC对稳定表达CD基因的喉癌Hep2细胞及转染空白载体pcDNA3.1(-)CMV的对照组喉癌Hep2细胞的杀伤作用。结果:阳性重组质粒pcDNA3.1(-)CMV.CD经XhoI/HindⅢ双酶切后获得5353bp的片段及496bp的插入片段,DNA自动序列分析证明重组体质粒含完整的477bp长的CD基因CDS序列。RTPCR从转染细胞总RNA中扩出453bp的预期片段。当添加不同浓度的5FC时,表达CD基因的Hep2细胞不同程度地被杀死,而对照组的细胞几乎未受到影响,两组细胞的相对生存率差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建了质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CD,建立了稳定表达酵母菌CD基因的喉癌Hep2细胞株,表达CD基因的Hep2细胞可以被5FC杀死。     

榄香烯对真核细胞翻译起始因子家族表达和血管生成的抑制作用

目的探讨榄香烯对人喉鳞癌细胞株Hep-2细胞荷瘤裸鼠移植瘤生长的抑制作用，以及荷瘤中真核细胞翻译起始因子（eukaryotic initiation factor，eIF）家族成员（eIF4E、eIF4G）与肿瘤新生血管有关的碱性纤维母细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达情况。方法利用人喉鳞癌细胞株Hep-2细胞制造裸鼠喉癌模型（共7组42只）腹腔注射用药并观察肿瘤体积，生长曲线以及抑瘤率；使用免疫组织化学法检测榄香烯治疗后荷瘤中eIF4E、eIF4G、bFGF、VEGF的表达和微血管密度的变化。结果榄香烯可引起荷瘤体积和重量的减少，剂量越高作用越明显；榄香烯低、中、高剂量组抑瘤率分别为5．2％、41．7％和50．5％；榄香烯乳作用组eIF4E、eIF4G、bFGF、VEGF的表达较空白对照组低（P〈0．05）；榄香烯乳作用组的微血管密度低于其他各组（P〈0．05）。榄香烯100mg／kg抑瘤效率与顺铂3mg／kg相似，榄香烯100mg／kg和顺铂3mg／kg联合用药抑瘤率为51．2％。结论榄香烯可抑制人喉鳞癌细胞荷瘤的生长，其作用机制不仅与直接抑制蛋白合成有关，而且还与eIF家族成员引起相关蛋白bFGF和VEGF表达下降，抑制肿瘤血管生成有关。榄香烯和顺铂联合用药具有药物协同作用。     

缺氧诱导因子-1a反义寡核苷酸对喉鳞癌荷瘤裸鼠化疗的增敏作用

目的 探讨应用缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)反义寡核苷酸对荷瘤裸鼠化疗(顺铂)的增敏作用及可能的途径.方法 将肿瘤最大直径长至8～10 mm的裸鼠,选择20只随机分为四组:A组(正义+化疗),B组(反义+化疗),C组(化疗),D组(空白对照),每次注射反义寡核苷酸100μg/只(按脂质体:AS-ODN=1∶1进行包...     

缺氧诱导因子1α反义寡核苷酸对喉鳞状细胞癌的放疗增效作用

目的探讨缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）反义寡核苷酸结合放射对人喉鳞状细胞癌（简称喉癌）裸鼠移植瘤生长抑制敏感性的影响。方法对25只裸鼠建立喉癌裸鼠模型,分为5组：A组（正义放疗）、B组（反义放疗）、C组（空脂质体放疗）、D组（放疗）和E组（空白对照）,治疗期间每3 d测量1次鼠重、瘤体最大长径及最大垂直径,治疗21 d后将实验鼠脱颈处死,瘤体称重后应用流式细胞仪、免疫组化观察抑瘤、凋亡情况及相关蛋白表达。结果反义放疗组瘤重（1.037±0.106）g明显低于其余4组（P〈0.05）,抑瘤率（50.21±8.10）%和凋亡率（34.52±4.159）%明显高于其余4组（P〈0.05）。免疫组化PV法染色显示：HIF-1α正义放疗组胞浆有大量棕色颗粒沉积着色,而反义放疗组表达较少;正义放疗组p53表达于胞核呈棕色颗粒浓染,而反义放疗组表达较少;VEGF正义对照组胞浆有大量棕色颗粒沉积着色,而反义放疗组表达较少。流式细胞仪检测结果显示：反义放疗组的HIF-1α、p53、VEGF蛋白表达的荧光指数（fluorescen-ceindex,FI）分别为0.98±0.28、2.13±0.03、1.09±0.36明显低于其余4组（P〈0.05）。结论 HIF-1α反义寡核苷酸结合放疗可以抑制喉癌异体移植瘤的生长,增加肿瘤细胞凋亡率,其机制之一可能是HIF-1α的下调降低了喉癌组织中p53、VEGF的蛋白表达,因此HIF-1α反义寡核苷酸增加喉癌对放疗的敏感性。     

c—Met—siRNA对喉癌Hep-2细胞株生物学行为的作用

目的：探讨c—Met—siRNA体外对喉癌细胞株生长、运动及侵袭的影响。方法：采用阳离子脂质体Lipofectamine2000作为转染试剂,将pSilencer2．0／c—Met—shRNA转染人喉癌细胞株Hep-2,通过RT—PCR及Western—Blot方法检测转染效率,筛选出抑制效果最好的c—Met—siRNA序列;通过MTT法、运动实验及侵袭实验比较转染前后细胞的生长、运动及侵袭能力。结果：pSilencer2．0／c—Met—shRNA转染人喉癌细胞株Hep-2后,c—Met的mRNA和蛋白表达水平显著降低,细胞的生长、运动及侵袭均受到明显抑制。结论：c—Met—siRNA能成功下调靶基因的表达,并能显著抑制喉癌Hep-2细胞的生长、运动及侵袭,是潜在的喉癌治疗新方法。