乳腺癌患者化疗前后外周血B细胞BCR H-CDR3受体库动态变化特征

本文利用高通量测序(high-throughput sequencing,HTS)技术对早期乳腺癌患者化疗前后,随着WBC总数及淋巴细胞的变化对外周血B细胞BCR H-CDR3受体库进行分析,探讨化疗对其的影响。分别采集和分离3例进行TAC化疗的乳腺癌患者在化疗前、中、后的PBMC,提取其总DNA并采用多重PCR建库和制备BCR H-CDR3受体库后Illumina检测CDR3序列并分析。结果发现:1.TAC化疗前患者WBC、淋巴细胞绝对值均正常,而化疗中、后WBC、淋巴细胞绝对值虽仍正常,但较化疗前下降;2.P2化疗中较化疗前受体库多样性有所下降,化疗后较化疗中稍升高,但仍明显低于化疗前;P1、P3化疗中多样性都比化疗前高;化疗后,P1较化疗中降低,但高于化疗前,而P3化疗后较化疗中明显升高;3.3例患者化疗后出现不同程度IGHV取用丢失。由此提示:1.化疗后随着WBC、淋巴细胞绝对值的下降,P2乳腺癌患者在化疗中及化疗后受体库的多样性在整体水平上较化疗前有所下降,考虑是TAC对受体库的多样性造成损伤;而P1、P3化疗中与化疗后B细胞受体库多样性整体上都较化疗前高,可能是机体对化疗药物产生的应激反应不一致,TAC杀伤了高频克隆的B细胞,间接增加了CDR3受体库的多样性;2.3例早期乳腺癌患者化疗后出现不同程度IGHV取用丢失,提示化疗可能对B细胞IGHV表达和取用产生了一定的影响,并且IGHV-IGHJ家族取用和配对在不同时间点存在优势配对(0.03)现象,可能与乳腺癌相关抗原诱导有关;3.HTS检测化疗前后B细胞H-CDR3受体库变化可为揭示化疗对患者B细胞应答的影响及B细胞的免疫状态提供辅助。     

IFN-α治疗后发生HBsAg转阴的慢性乙型肝炎患者外周血免疫库谱特征分析

目的通过对慢性乙型肝炎患者经IFN-α治疗后出现HBs Ag转阴病例与未转阴病例外周血中T细胞受体β链(TCRβ,TRB)序列分析比较,探讨HBs Ag转阴病人外周血免疫库TCRβ的特征,为预测病人临床结局以及评价治疗效果提供新的指标。方法收集HBV感染病人的外周血样进行密度梯度离心获得淋巴细胞,冻存。待IFN-α治疗一段时间后,取HBs Ag转阴病例与未转阴病例相应的冻存细胞,提取RNA,逆转录为c DNA后通过多重PCR对TCRβ链的CDR3区序列进行扩增、纯化,高通量测序后将测序结果与IMGT数据库进行比对,以找到HBs Ag转阴病人外周血TRB-CDR3免疫组库的特征,分析人外周血TRB-CDR3多样性及其他免疫学特征与HBs Ag转阴之间的关系。结果 IFN-α治疗后HBs Ag转阴的患者TRB-CDR3的多样性高于未转阴患者,并表现出其特有的免疫学特征,包括高频取用的V、J家族、V-J家族配对、基因的插入、CDR3区长度分布等均与未转阴组有明显差异,而基因的缺失方面未发现差异。结论 IFN-α治疗后HBs Ag转阴的患者的免疫组库呈现明显的免疫学特征,可为临床疗效的预测提供新的切入点。     

B细胞BCR CDR3受体库的高通量测序分析概况

B细胞是介导机体体液免疫应答的主要细胞群,其识别、结合抗原主要依赖互补决定区(CDR),它决定着抗体的特异性,而互补决定区3(CDR3)比CDR1、CDR2更具多样性,通过观察机体B细胞BCR CDR3受体库的多样性、重叠率的大小、CDR3     

BCR组库分析乙肝疫苗接种反应及初步机理分析

目的接种乙肝疫苗是控制乙肝流行最经济有效的方法,通过对3次乙肝注射疫苗前后的B细胞库进行高通量测序分析,探讨注射乙肝疫苗后体液免疫的动态过程。方法将志愿者接种乙肝疫苗前后的外周血样进行密度梯度离心获得淋巴细胞并提取RNA,逆转录为cDNA后对B细胞受体H链的CDR3区序列进行高通量测序,以揭示注射乙肝疫苗前后B细胞应答的变化,分析人外周血B细胞受体CDR3的多样性以及序列变化与疫苗应答之间的关系。结果志愿者外周血B细胞受体CDR3的种类和数量在接种疫苗后都有所降低,并表现出其特有的免疫学特征,包括高频取用的V、D、J家族、V-J家族配对发生了改变,CDR3区氨基酸的取用和长度分布也发生显著变化;并且接种疫苗后,志愿者外周血中存在某些寡克隆异常增殖的情况。结论大部分志愿者在接种疫苗后,B细胞受体组库的多样性等发生特征性改变,并且出现某些疫苗接种相关的寡克隆。B细胞受体高通量测序技术可以从克隆水平上监控乙肝疫苗接种后抗体产生和表达的动态变化过程。     

单细胞TCR测序分析SARS-CoV-2感染患者不同感染时期免疫组库特征

目的：采用单细胞测序的方法,分析SARS-CoV-2感染患者不同感染时期免疫组库特征,探讨其可能的发病机制。方法：利用NCBI数据库获得数据,设置对照组、进展组和康复组。使用RStudio、Origin、Hipliot和Excel软件对单细胞测序数据进行分析。结果：TCR在识别抗原和清除病毒的过程中发挥重要作用,免疫组库特征在不同感染时期有很大差异。细胞的克隆数量均超过26.92%。α链CDR3长度分布集中在14个氨基酸上,而β链集中在15个氨基酸上。V和J区基因片段使用频率不同,TRAV13-1、TRAJ20、TRBV20-1、TRBJ2-1等基因的使用频率差异有统计学意义（P<0.05）。进一步V-J基因组合分析显示,对照组和进展组、对照组和康复组的单链V-J对使用频率差异均有统计学意义（P<0.05）。对照组αβ双链V-J对使用频率最高的是TRAV19-J34-TRBV4-1-J2-1,进展组αβ双链V-J对使用频率最高的是TRAV12-1-J30-TRBV19-1-J2-1,康复组αβ双链V-J对使用频率最高的是TRAV12-2-J52-TRBV7-9-J1-5。结...     

乙肝免疫球蛋白抗体的多样性

目的 基于重链可变区的编码基因序列对乙肝免疫球蛋白（HBIG）中的IgG抗体进行分类。方法 借用文献提供的引物,以HBsAb强阳性健康个体外周血中的总RNA为模板进行RT-PCR和Nested-PCR扩增,通过将产物克隆到T载体、随机挑选测序,分析并统计出插入子的V_H-J_H-C_γ组
合方式。结果 共获得56个有效克隆,全部为人V_H3-D-J_H-C_γ序列,可分成49种序列,其中5种序列有2或3个序列完全相同的克隆。4个Cγ功能基因也全部出现,其中IGHG2频率最高（28次）;23个V_H3功能基因有11个出现,其中频率最高的是IGHV3-23（29次）;23个D功能基因有16个出
现,其中频率最高的是IGHD1-26（8次）;6个J_H 功能基因则全部出现,其中频率最高的是IGHJ4（33次）。V_H3-D-J_H组合有33种,频率最高的是IGHV3-23/IGHD1-26/IGHJ4（8次）,其中5种与IGHG2拼接,但这5种V_H3-D-J_H-C_γ2序列仍有明显的差异。结论 成功地从HBsAb强阳性健康个体外周血中克隆到由VH3亚家族参与重排的IgG重链可变区序列;初步证实可变区序列不仅在V_H3-D-J_H-C_γ组合方式上具有极大的多样性,而且在序列上也具有明显的差异性;基于可变区测序对IgG抗体或B细胞进行分类是可行的,但需大大提高挑取克隆的数量或改用新一代大规模测序技术。     

从兔外周血直接克隆IgG重链可变区 

目的 从兔外周血总RNA中直接扩增出IgG重链可变区基因。方法 先从IMGT/GENE-DB数据库中获取编码大耳白兔免疫球蛋白（Ig）重链可变区（VH）的3个胚系基因片段VSUB>H/SUB>（IGHV）、D（IGHD）和JSUB>H/SUB>（IGHJ）,以及编码γ重链恒定区（CH）基因Cγ（IGHG）的cDNA序列,然后设计嵌套引物,以兔外周血总RNA为模板,进行RT-PCR和Nested-PCR扩增,产物经胶回收后克隆到T载体,随机挑选白色克隆测序,最后将序列用Bioedit软件的Local Blast功能比对出Cγ的基因型,同时提交到IMGT/V-QUEST分析出所属的VH、D和JH胚系基因。结果 获得25个克隆的插入子序列,每个克隆均为兔IgG重链可变区的编码基因,且包含了完整的VSUB>H/SUB>、D、JSUB>H/SUB>胚系基因片段,以及Cγ基因     

COMP特异性单抗15A11的表位特征研究北大核心CSCD

目的:鉴定RA相关自身抗原COMP的一株特异性单克隆抗体15A11的表位特征。方法:选用随机十二肽噬菌体库对m Ab 15A11进行三轮筛选,随机挑取40个单噬菌斑,提取DNA,测序;ELISA检测每个噬菌体克隆与m Ab 15A11结合的特异性;通过Clustal W2对特异性结合的噬菌体展示的十二肽和COMP进行氨基酸序列比对,Py MOL分析一致氨基酸所在肽链的二级结构及表位氨基酸之间的距离,初步确定m Ab 15A11的表位;变性和非变性Western blot、EDTA螯合Ca2+后ELISA分析以及合成多肽的ELISA实验进一步确定表位序列。结果:得到的40个测序噬菌体中,共有5个噬菌体克隆,ELISA确定克隆1和克隆2与m Ab 15A11特异性结合,其他克隆均为非特异性结合的噬菌体;氨基酸序列比对,在COMP上未发现与克隆1和克隆2噬菌体相同的连续氨基酸序列,提示m Ab 15A11的抗原表位可能为非线性表位;Py MOL分析表位氨基酸在COMP上的定位及距离,显示构象表位的合理性;变性Western blot分析为阴性,而非变性Western blot条件下为阳性;EDTA螯合Ca2+破坏COMP的构象后不能与m Ab 15A11结合,而未经处理的与m Ab 15A11结合,均说明m Ab 15A11表位是构象表位;合成多肽与m Ab 15A11的ELISA结果进一步确定了m Ab 15A11的构象表位序列。结论:鉴定了m Ab 15A11的表位是构象表位序列,且确定了该构象表位的氨基酸组成,为研究COMP抗体与抗原反应机制具有重要理论价值,并对类风湿性关节炎的检测有重要应用意义。     

高温致畸金黄地鼠神经管cDNA文库的构建与鉴定

目的:构建高温致畸金黄地鼠神经管cDNA文库。方法:在高温致神经管畸形动物模型上,提取高温致畸金黄地鼠胚胎神经管总RNA,用SMARTTMcDNA文库构建试剂盒反转录合成cDNA第1链,经LD-PCR合成全长双链cDNA,去除小于500 bp的片断后与λTriplEx2噬菌体左、右臂连接,体外包装,构建成未扩增cDNA文库,再进行文库扩增。测定未扩增和扩增文库的滴度及重组率;随机挑取噬菌斑,经PCR扩增,电泳检测所构建cDNA文库的质量。结果:未扩增文库滴度为2.03×106pfu/ml,重组率为98.4%,文库扩增后滴度达2.503×109pfu/ml,重组率为97.6%。插入片段长度分布于500~3 000 bp之间。结论:成功地构建了高质量的高温致畸金黄地鼠神经管cDNA文库。     

活动性肺结核患者α/β TCR基因重排及CDR3谱型分析

目的:建立多重PCR方法扩增α/β TCR全长序列,分析活动性肺结核患者病变局部T淋巴细胞α/β TCR基因重排特点及CDR3谱型.方法:分离结核患者肺泡灌洗液中的淋巴细胞,提取RNA后用SMART方法逆转录,运用根据现有文献设计的α和β TCR扩增引物,进行多重PCR扩增以获得其全长序列,构建重组质粒并测序,利用DNAstar及网上TCR资源分析序列.结果:3例患者共获得24个α链序列,13个β链序列.α链以AV1S2(54%)、AV12S3(41%)、AV12S2(5%)为主;β链以BV2(38%)、BV29S1(46%)、BV14(3%)、BV4S2(3%)为主.同一病例及不同病例之间CDR3区呈现多样性,但是标本1、标本3各有一条β链的CDR3氨基酸序列相同:SVGTGTLHQETQY;标本2和标本3的各有2条α链CDR3序列相同:AVRDWAGNMLT;标本2的一个α链和标本3的一个α链的CDR3均有:AV…DNN…RLM序列.结论:建立了TCRα和β链全长序列的多重PCR扩增方法.结核患者病变局部克隆性增殖的TCR α和β链谱型呈限制性取用,克隆增生的T淋巴细胞来自不同的亚群,但是相同的CDR3序列对于识别MTB多肽可能具有特异性.     

人、小鼠和大鼠的ADRB3比较及其生物学和药理学意义

目的：比较人、小鼠和大鼠的ADRB3并讨论结果的生物学和药理学意义。方法：由NCBI的GemBank数据库，搜索出人、小鼠和大鼠的ADRB3的基因序列，经过对准和比较。计算出其氨某酸序列的相似性和差异。结果：人、小鼠和大鼠的ADRB3的氨基酸序列长度分别为：408、404、400aa；人和小鼠、人和大鼠、小鼠和大鼠的ADRB3的氨基酸序列的排列和组成相似性分别为：79．3％、78．2％、92．6％；差异分别为：20.7％、21．8％、7．4％。最大差异在第四胞内段羧基尾部。结论：1．人与小鼠的序列长度更接近，排列和组成的差异更小。2．从序列的长度和相似性看。人与小鼠更接近，故推断进化顺序应为。3．序列最大差异在与胞内信号转导有关的第四胞内段。     

运用表位嵌合型3型腺病毒载体制备肠道病毒71型单克隆抗体

目的制备针对肠道病毒71型(EV71)的单克隆抗体(m Ab)。方法将六邻体中同时嵌入EV71 SP55与SP70两个中和表位的重组人3型腺病毒作为免疫原免疫小鼠,利用杂交瘤技术制备m Ab。用病毒微量中和实验、间接ELISA、Western blot法和直接免疫荧光染色法进行鉴定。结果获得了4株分泌EV71特异性m Ab的杂交瘤细胞,D2C9、2C4、I2G2、I12C3,其中D2C9株腹水间接ELISA实验效价为1∶8 000 000,其余3株为1∶500 000;Western blot法和ELISA结果表明4株m Ab均识别EV71病毒VP1蛋白。D2C9针对SP70表位,2C4、I12C3、I2G2针对SP55表位;直接免疫荧光实验结果显示4株m Ab均能与EV71特异性结合,而与柯萨奇病毒16型(Cox A16)不结合。结论获得了对EV71亲和力高、特异性好并且与Cox A16无交叉反应的m Ab。     

APL相关TCRVα6、Vα10和Vβ23寡克隆T细胞CDR3序列分析

目的:分析急性早幼粒细胞白血病(APL)患者外周m TCR Vα和Vβ克隆性增殖T细胞及CDR3序列特点.方法:利用RT-PCR法扩增1例APL患者外周血单个核细胞中29个TCR Vα基因和24个Vβ基因CDR3,阳性PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析确定其CDR3长度,了解其克隆性;寡克隆的PCR产物再进行CDR3区序列分析.结果:该例APL患者外周血T细胞分别在TCR Vα6、Vα10和Vβ23亚家族中出现寡克隆性增殖T细胞,经序列分析显示TCR Vα6、Vα10和Vβ23亚家族基因序列分别为Vα6NJα17、Vα10NJα35和Vβ23NDβ1NJβ2.7,其CDR3区氨基酸序列分别为CAMRENSAGNK,YLCAGDELLWECA,CASSSKWAG-GTYEQY,该3个TCR基因已被GenBank收录(登陆号:EU544946、EU544947和EU647219).结论:APL患者外周血T细胞出现的TCR Vα6、Vα10和Vβ23克隆性增殖T细胞可能是机体对抗白血病细胞所引起的抗原特异性免疫反应;这3个独特TCR重排序列将进一步作为开展APL特异性免疫治疗研究提供资料.     

识别猪SLA的特异性人T细胞系TCR BV基因取用格局和CDR3结构多样性分析

不同T细胞克隆TCR分子的序列不同 ,所识别的抗原特异性也不同。其中第三互补决定区 (CDR3)变异最大 ,是TCR主要的抗原结合部位。本文采用荧光标记半定量PCR技术 ,用DNA测序仪作程序分析 ,了解猪细胞抗原致敏前后的人T细胞群和 5个T细胞系 2 4个TCRBV基因家族取用格局 ,并以TCRα链C区的基因片断作为内参对取用情况作定量估计。发现首次抗原致敏后培养 2周的T细胞除了BV2 4、BV8和BV10未能检测出 ,其它BV基因都有不同程度的取用。然而 ,5个细胞系的TCRBV基因呈现十分有限的取用格局 ,其中两个CD4+ T细胞系都取用BV12和BV14;3个CD8+ T细胞系中都优势取用BV1,有两个还取用BV19。CD4+ T细胞系和CD8+ T细胞系之间TCRBV无交叉取用 ,提示两类细胞识别的抗原表位存在差异。进一步用变性凝胶扫描分析上述T细胞系取用TCRBV中的CDR3的多样性 ,发现未经抗原致敏的T细胞BV的CDR3结构为多峰型且呈正态分布 ,表明涉及多种结构不同的细胞克隆 ;而抗原特异性T细胞系CDR3除了一个CD8+ T细胞系BV1有两个主峰外其它无例外地都显示单峰或者仅一个主峰 ,这从另一个角度证明建系T细胞的单克隆性。     

1月龄Balb/c小鼠胸腺、脾脏、肝脏、小肠和血液TRBV-TRBJ1-1 CDR3谱型分析

目的初步分析1月龄Balb/c小鼠胸腺、脾脏、肝脏、小肠和血液中TRBV-TRBJ1-1 CDR3谱型特征。方法提取1月龄Balb/c小鼠胸腺、脾脏、肝脏、小肠和血液样本的总RNA,逆转录成cDNA,以22条TRBV基因家族为上游引物,共同的TRBJ1-1基因为下游引物(荧光标记),PCR扩增包含完整CDR3区片断,毛细管电泳激光DNA扫描技术分析CDR3谱型的长度和多态性。结果胸腺样本毛细管电泳激光扫描图呈现标准的中间高两端低的多态性分布;各家族CDR3区最长和最短比较,多数为相差8～15个氨基酸的谱型分布。脾脏、肝脏、小肠、血液样本扫描图显示多数家族呈多态性分布,但均出现数量不等的单峰、寡峰、偏峰、低峰;多数家族表现为相差3～13个氨基酸的谱型分布,部分家族在预测大小位置无对应峰型。结论 1月龄Balb/c小鼠胸腺中基本包含TCR基因随机重排的多种克隆性T细胞;脾脏、肝脏、小肠、血液表现为单、寡、多克隆形式的T细胞分布,部分家族T细胞缺失,本实验结果可为进一步研究Balb/c小鼠的T细胞发育、分布、应答及CDR3谱型与疾病关系提供方法和基础。     

抗迟缓爱德华菌独特型单克隆抗体重链可变区基因的克隆及序列分析

目的克隆并分析迟缓爱德华菌抗独特型单克隆抗体(mAb)VH基因。方法从分泌迟缓爱德华菌抗独特型mAb的杂交瘤细胞株(1E11)中提取总RNA,利用RT-PCR技术,扩增迟缓爱德华菌抗独特型抗体VH基因,并将其克隆到PBS-Tvector中进行序列分析。结果VH基因的全长序列为339bp,编码113个氨基酸。通过NCBI/BLAST/N和IMGT数据库(Lefrance,2001)分析表明,VH基因符合小鼠IgGV区基因的特征含有4个框架区(FR),3个抗原互补决定区(CDR)及两个抗体特征性的半胱氨酸。结论成功地克隆了迟缓爱德华菌抗独特型mAbVH基因,为进一步构建迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗奠定了基础。     

5'和3'末端快速扩增法克隆多发性骨髓瘤负性相关基因DAZAP2

目的 在多发性骨髓瘤患者中KIAA0058基因序列表达明显下调,从正常人骨髓单个核细胞中克隆该序列全长cDNA,以期更好地研究该序列结构,获得其功能信息。方法 采用末端快速扩增法（RACE）,进行多轮RT-PCR后,对PCR产物进行测序、拼接、证实,与NCBI核酸数据库进行比对。结果 该序列全长cDNA长度为1913bp,登陆号为AY430097,与来源于人睾丸cDNA文库的序列DAZAF2同源性高达99％以上。该序列具有较短的5’非翻译区及长的3’非翻译区,开放阅读框序列从第84位碱基至590位碱基,具有poly（A）尾。结论 利用RACE法,从骨髓单个核细胞中成功克隆了DAZAF2全长cDNA。     

5′和3′末端快速扩增法克隆多发性骨髓瘤负性相关基因DAZAP2

目的在多发性骨髓瘤患者中KIAA0058基因序列表达明显下调,从正常人骨髓单个核细胞中克隆该序列全长cDNA,以期更好地研究该序列结构,获得其功能信息。方法采用末端快速扩增法(RACE),进行多轮RT-PCR后,对PCR产物进行测序、拼接、证实,与NCBI核酸数据库进行比对。结果该序列全长cDNA长度为1913bp,登陆号为AY430097,与来源于人睾丸cDNA文库的序列DAZAP2同源性高达99%以上。该序列具有较短的5′非翻译区及长的3′非翻译区,开放阅读框序列从第84位碱基至590位碱基,具有poly(A)尾。结论利用RACE法,从骨髓单个核细胞中成功克隆了DAZAP2全长cDNA。     

人组合抗体库(HuCAL)的构建及其优化

基于抗体结构信息、通过聚类分析建立的全合成人组合抗体库(the fully gene-synthetic human combinational antibody library,HuCAL)由Peter Pack等于1997年率先提出.与其它抗体库不同,HuCAL由源于人免疫系统胚系基因分类获得的7个VH、7个VL(4个Vκ、3个Vλ)主架序列及CDR3库组成,其49个ScFv主架在大肠杆菌周质腔中,均能以分泌形式正确表达;CDR两侧特有的酶切位点,使CDR的替换非常方便;同时,由于CDR3库在构建时,采用了三联核苷酸突变技术,增加了随机化的准确性和效率,使抗体库的质量得到极大的提高.构建好的HuCAL经多种抗原筛选后,产生了一大批高亲和力结合子,且筛出的抗体表达量、热稳定性较好.由于HuCAL主架基因是人免疫系统胚系基因的通用序列,其免疫原性大大降低,可用于产生体内诊断性或治疗性的人源抗体.本文对HuCAL的构建及其优化进行综述.     

T细胞抗原受体β链互补决定区3受体库高通量测序分析及其在重要疾病中的研究应用

T细胞受体(TCRs)既是T细胞特异性识别和连接抗原的分子,也是T细胞发生免疫应答的关键分子.其中TCR高变区的CDR3变异最大,最能代表T细胞的应答特征,其在外周形成了具有多样性的T细胞CDR3受体库.因此,对T淋巴细胞β链CDR3组库的研究,以期更好地理解疾病的发病机理,并对疾病的临床诊断和治疗、监测疾病提供理论基础和新的思路.