聚合酶链式反应（PCR）及其应用

聚合酶链式反应(简称PCR),又称体外基因放大技术,是用DNA聚合酶在体外系统中诱发一对引物间的DNA双链的合成过程。经过20～30次循环后,可使目的基因片段成百万倍地扩增,使得对该基因片段的分析研究更为便利。PCR技术自1985年创立以来,经过不断改进,目前已成为分子生物学研究的重要手段。PCR技术已经应用于遗传病的基因诊断和产前诊断,病原体的鉴定,癌基因的分析研究等。最突出的是经PCR放大后的DNA片段可以直接进行顺序分析。     

套式聚合酶链式反应（Nested PCR）检测肺炎衣原体

肺炎衣原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＣＰｎ）可引起人类急性呼吸道炎症，临床表现以肺炎为主，已在世界上许多国家和地区引起流行，本文介绍通过套式ＰＣＲ检测ＣＰｎ，共检测１０９例呼吸道感染者之咽拭标本，检出１３例阳性（阳性率１２％），提示ＣＰｎ的呼吸道感染有我国并不少见。实验结果表明，套式ＰＣＲ用于ＣＰｍ检测方法的建立，在敏感、特异、简便、快速的特点，具有良好的应用前景。     

聚合酶链式反应快速检测E型肉毒神经毒素基因

目的Ｅ型肉毒中毒是人类肉毒中毒的主要型别之一，本试验旨在建立用于Ｅ型肉毒梭菌鉴定的ＰＣＲ方法。方法用人工合成的寡核苷酸引物扩增Ｅ型肉毒神经毒素基因的一段３６８ｂｐ的ＤＮＡ片段，快速检测Ｅ型肉毒神经毒素基因，对梭状芽胞杆菌属的４０株保藏菌株及３３份土壤标本进行了鉴定，用Ｅ型肉毒梭菌ＣＭＣＣ（Ｂ）６４５０１对其灵敏度进行了检查。结果从所有Ｅ型神经毒素原性菌株或标本均能扩增出目的片段，且能用特定的限制性内切酶切成相应的片段。其它菌株均未能扩增出目的片段。灵敏度试验可从３０个菌体扩增出目的片段。结论此方法用于Ｅ型神经毒素原性梭菌的鉴定具有较高的灵敏度及特异性。     

多聚酶链式反应（PCR）检测细胞因子基因表达

多聚酶链式反应（ＰＣＲ）检测细胞因子基因表达钟飞，李晓玉（中国科学院上海药物研究所，上海２０００３１）杨胜利（中国科学院上海生物工程研究中心，上海２００２３３）细胞因子由细胞分泌产生以后，作用于靶细胞受体，维持靶细胞的存活、生长或促进其增殖和分化，研...     

聚合酶链反应（PCR）新一代临床检测技术

本文综述了ＰＣＲ技术的有关方法学进展及其应用。     

肺炎支原体快速聚合酶链式反应（PCR）法检测

本文根据Ｂｅｒｎｅｉ设计的肺炎支原体ＰＣＲ引物，采用国产的耐热ＤＮＡ聚合酶，建立了双温循环肺炎支原体ＰＣＲ快速检测法。４０例儿童肺炎咽拭子标本中，８例呈阳性结果。     

应用聚合酶链反应（PCR）检测胃液中的幽门螺杆菌

幽门螺杆菌是慢性胃炎和消化性溃疡的致病因子，并认为与肿瘤的发生有关。胃炎及消化道性溃疡在我国十分常见，但目前缺乏一种敏感有效的检测方法。本文应用ＰＣＲ方法对因上消化道症状在我院应诊的患儿胃液进行检测，阳性率为３４．５％，     

聚合酶链反应（PCR）研究进展

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)或称体外基因倍增,是一种体外扩增特异性DNA的技术。这项技术是由美国Cetus公司和加利福尼亚大学于1985年联合创建的。自1985年Saiki等人首次报道PCR方法以来,仅在两年多的时间内,PCR     

A rapid and reliable species-specific identification of clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae using a three-test procedure and recA polymerase chain reaction

Purpose: Vibrio cholerae, the cause of cholera, is one of the leading causes of morbidity and mortality in many developing countries. Most laboratories initially rely on biochemical tests for a presumptive identification of these strains, followed by a polymerase chain reaction (PCR)-based method to confirm their identification. The aim of this study is to establish a rapid and reliable identification scheme for V. cholerae using a minimal, but highly specific number of biochemical tests and a PCR assay. Materials and Methods: We developed a species-specific PCR to identify V. cholerae, using a housekeeping gene recA, and used that to evaluate the sensitivity and specificity of 12 biochemical tests commonly used for screening and / or presumptive identification of V. cholerae in the clinical and environmental samples. Results: Here we introduced a combination of three biochemical tests, namely, sucrose fermentation, oxidase test, and growth in trypton broth containing 0% NaCl, as also the PCR of the recA gene, for rapid identification of V. cholerae isolates, with 100% sensitivity and specificity. The established method accurately identified a collection of 47 V. cholerae strains isolated from the clinical cases (n = 26) and surface waters (n = 21), while none of the 32 control strains belonging to different species were positive in this assay. Conclusion: The triple-test procedure introduced here is a simple and useful assay which can be adopted in cholera surveillance programs for efficient monitoring of V. cholerae in surface water and fecal samples.     

原位PCR技术检测石蜡包埋脑组织中人巨细胞病毒DNA

应用原位聚合酶链反应（ＩＳＰＣＲ）技术检测了２５例尸检畸形胎儿石蜡包埋脑组织中人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）ＤＮＡ，并与普通ＰＣＲ及原位杂交（ＩＳＨ）进行了比较。ＩＳＰＣＲ、ＰＣＲ及ＩＳＨ检测阳性率分别为４４％，３６％及２０％。与ＩＳＨ相比较，ＩＳＰＣＲ不仅检出阳性率高，而且信号强度增强。研究结果提示，ＩＳ－ＰＣＲ是诊断ＨＣＭＶ感染的快速、敏感、特异的实用方法。     

黄病毒逆转录—聚合酶链反应检测技术的建立和应用

为了早期快速诊断黄病毒感染，在其ＮＳ１基因序列设计了一对通用引物，扩增序列长度为４１３ｂｐ；在登革病毒（ＤＥＮ）１，２，３，４型和乙型脑炎病毒（ＪＥＶ）设计了各型的内引物，扩增序列长度分别是ＤＥＮ１型为２６２ｂｐ，ＤＥＮ２型为１８９ｂｐ，ＤＥＮ３型为３９２ｂｐ，ＤＥＮ４型为９７ｂｐ，ＪＥＶ为３２３ｂｐ。应用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）成功地扩增了ＤＥＮ１－４型和ＪＥＶ基因部分片段，其扩增片段的大小与设计相符合。应用套式ＰＣＲ检测临床诊断为登革热的患者血清标本７８份，证实ＤＥＮ１型阳性１８份，ＤＥＮ２型阳性４８份，其中８份同时合并感染ＤＥＮ４型。采用套式ＰＣＲ检测临床诊断为乙型脑炎患者血标本４２份，证实乙型脑炎病毒感染者３５份。结果表明，该法能直接检测发病患者早期血标本中的病毒基因，并在２天内完成对黄病毒的鉴别诊断。     

原位PCR检测霍乱弧菌ctxAB基因

目的　为监测环境中的霍乱弧菌 ,建立原位PCR(insituPCR ,ISPCR)检测方法。方法纯培养的霍乱弧菌为实验材料 ,霍乱毒素基因 (ctxAB)为靶序列。 4 %多聚甲醛固定细胞 ,1mg/ml溶菌酶消化 2 0min ,PCR反应体系中加入 2 .5 %甘油 ,以荧光素标记的引物为标示物 ,在液相环境下 ,进行靶序列的ISPCR。结果　经蓝光激发 ,荧光显微镜下有扩增产物的细菌发出明亮的绿色荧光 ,阴性对照则无荧光。结论　由于ISPCR既能检测靶序列 ,又保护了细菌形态 ,可以在检测中省去细菌培养的过程 ,因此 ,为快速而准确的检测环境中霍乱弧菌提供了一种新方法     

产毒型O1群霍乱弧菌特异性基因序列实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系的建立

目的建立针对O1群霍乱弧菌的高敏感、高特异的实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应快速检测体系。 方法根据O1群霍乱弧菌主基因组O抗原编码基因rfb-O1和霍乱肠毒素的A亚基编码基因ctxA的特异性序列设计引物及TaqMan探针,利用便携式Smartcycler Ⅱ实时荧光PCR检测平台探讨该检测体系的敏感性,用19种其他肠道致病菌及院内感染常见致病菌评价该检测体系的特异性。 结果实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应快速检测体系对O1群霍乱弧菌的检测敏感度为1．0×10^2拷贝每反应体系;对O1群霍乱弧菌基因组DNA的检测敏感度为1．0×10^1 pg每反应体系;该检测体系在检测19种其他肠道致病菌或院内感染中的常见致病菌时不存在非特异性扩增;整个反应在2h内完成。 结论本研究建立的实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应检测体系可作为产毒型O1群霍乱弧菌特异、敏感、快速的检测手段,也可同时检测O1群霍乱弧菌产生霍乱肠毒素的能力。     

聚合酶链反应标记轮状病毒地高辛素探针的初步应用

目的为探讨聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术标记的地高辛素（ＤＩＧ）探针的特异性和敏感性。方法用聚合酶链反应技术制备地高辛素标记的人类轮状病毒（ＨＲＶ）ｃＤＮＡ探针，经ｃＤＮＡ－ＲＮＡ斑点杂交。结果该探针具ＨＲＶ特异性，可检出１０ｐｇ的ＲＮＡ。应用该项技术检测了１２０份婴幼儿腹泻粪样标本，其阳性率为６５％，明显高于ＰＡＧＥ方法（４９．１％）的阳性率。结论ＰＣＲ方法直接制备地高辛素标记的ｃＤＮＡ探针方便、快速、特异性好、标记率高。     

霍乱弧菌毒力表达调控基因toxR缺失株的构建及其功能的研究

目的　通过构建霍乱弧菌toxR基因缺失株来研究toxR基因对霍乱弧菌减毒菌株IEM101和高产毒株569B毒力表达的调控作用。方法　采用自杀性质粒和接合转移技术,将2个中间含有四环素基因的toxR基因分别与霍乱弧菌减毒株IEM101和高产毒株569B染色体toxR基因重组,从而获得toxR基因缺失株IEM101-4和569B-43,并对2个toxR基因缺失株和其原出发菌株的霍乱肠毒素的产率和主要外膜蛋白图谱进行比较。结果　采用GM1-ELISA检测受测菌CT基因表达,toxR基因缺失株569B-43的P/N值为1.82,而其原出发菌株569B的P/N为4.52,而IEM101和其toxR基因缺失株的P/N值均低于2。采用SDS-PAGE对受试菌外膜蛋白进行分析,toxR基因缺失株569B和IEM101的外膜蛋白图谱相比,均多出2条相对分子质量（Mr）为40×103和43×103外膜蛋白区带。结论　toxR蛋白是霍乱肠毒素基因ctx表达的正调控因子,是霍乱弧菌主要外膜蛋白（Mr为40×103和43×103)编码基因的负调控因子。     

实时聚合酶链反应熔解曲线分析检测APC基因突变

目的建立一种准确、方便、价廉、适合临床的APC基因突变检测方法。方法采用SYBR Green I为实时聚合酶链反应（PCR）指示剂,首先从基因组DNA中扩增包含突变位点的靶基因（270bp）,并通过熔解曲线分析确定产物;再以上述片段为模板扩增特定长度的小片段（40／35bp）,以0．5℃／step的速率,获得从65℃到99℃的熔解曲线以检测APC-1309位5bp缺失突变。结果临床标本检测结果表明：18例结直肠肿瘤患者石蜡组织标本中检出APC_1309位5bp缺失突变7例,20例正常人外周血标本检测结果均为阴性。结论实时PCR熔解曲线法设计简单,操作简便,结果可靠,可望应用于临床APC基因突变检测,并可推荐用于其他基因突变的检测。