抗人TNF-α单抗基因的克隆及鉴定

目的克隆抗人ＴＮＦ－α鼠单抗得可变区基因以构建人－鼠嵌合抗体表达载体。方法采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,以前导肽序列的引物从１个分泌抗人ＴＮＦ－α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆抗体轻链、重链可变区基因（Ｖκ,ＶＨ）,在大肠杆菌中表达Ｆａｂ段核实其功能活性。结果分别得到了２个Ｖκ和２个ＶＨ基因。ＤＮＡ序列测定表明,其中１个轻链可变区基因为骨髓瘤细胞系中固有的无功能基因。１个重链可变区基因经原核系统表达测活表明无抗体活性。另一个轻链和重链可变区基因的成熟蛋白编码部分与从第一骨架区引物所克隆的、可在大肠杆菌表达出抗体活性的Ｖκ、ＶＨ序列相符。将该轻链、重链基因分别克隆到了人－鼠嵌合轻链、重链表达载体中。结论通过原核表达系统核实,获得了抗ＴＮＦ－α单抗的可变区基因     

抗癌胚抗原单克隆抗体可变区基因的克隆及鼠-人嵌合抗体基因在E.coli中的高效表达

本文采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术,从抗癌胚抗原（CEA）单克隆抗体杂交瘤细胞中克隆到了该抗体的重、轻链可变区（Ⅴ区）基因,并分别将其与人的恒定区基因 C_(3γ)、C_κ相拼接,构建鼠-人嵌合抗体基因。SDS-PAGE和Western-Blot分析结果证实嵌合重、轻链抗体基因在E.coli中得到高效表达,表达量约为菌体可溶蛋白的30％和15％。放射免疫分析法（RIA）和间接ELISA测定的结果表明嵌合重链基因表达产物具有与CEA结合的能力。     

抗胃癌鼠单抗3H11 Fab段载体的构建、表达及抗体活性检测

目的 构建和表达抗胃癌鼠单抗３Ｈ１１的Ｆａｂ段小分子抗体。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ方法,利用第一骨架区通用引物扩增重链Ｆｄ段和ｋ链的基因,克隆到Ｆａｂ表达载体中,并根据已克隆的３Ｈ１１ ＶＬ的真实序列,重建设计ｋ链５‘端引物,将骨架区引物在ｋ链５’端所造成的氨基酸残基改变纠正为原始序列,再次构建Ｆａｂ表达载体。结果 利用第一骨架区通用引物构建的Ｆａｂ在大肠杆菌中获得表达但未检测到抗原结合活性,将骨架     

人-鼠嵌合抗血小板单抗SZ-2 Fab片段基因的构建和表达研究

目的：降低鼠源性抗血小板单克隆抗体SZ-2的免疫原性。为其进一步研究，应用奠定基础。方法：用Trizol试剂从SZ-2杂交瘤细胞抽提RNA，应用RT-PCR技术，扩增出SZ-2重链，轻链可变区基因，克隆入载体pUCm-T，测序分析，应用基因重组技术，将SZ-2轻，重链可变区基因与人免疫球蛋白γ1重链CH1和к轻链恒区基因进行拼接，构建人-鼠嵌合Fab片段基因表达质粒pSW1-2Fab/Hu，并导入大肠杆菌XL1-blue诱导表达，以ELISA，Western blot和瑞斯托霉素诱导血小板聚集抑制试验。对表达产物进行检测，验证。结果：克隆的基因序列符合小鼠轻，重链可变区基因的特征；表达质粒pSW1-2Fab/Hu拼接正确；在大肠杆菌中的表达量约为180μg/L；表达产物具有与血小板GPIb结合的特性并可抑制瑞斯托霉素诱导血小板聚集。结论：成功地克隆了SZ-2可变区基因；并表达了可溶性人-鼠嵌合Fab基因工程抗体。     

抗体轻链可变区基因真核表达框架及抗CD3鼠/人嵌合轻链基因的构建

利用抗乙肝表面抗原的单抗２Ｈ１的轻链可变区基因的一部分，以核酸定点突变法引入ＭｌｕＩ限制性内切酶识别位点，构建了含有启动子、前导肽序列以及剪接供体信号等真核表达元件和“ＥｃｏＲＶ－Ｍｌｕ Ｉ”外显子克隆“匣”的通用的抗体轻链可变区基因真核表达框架ｐＧＥＭ－ＬＰＣＲ。从分泌ＣＤ３单抗的杂交瘤细胞中提取基因组ＤＮＡ，通过ＰＣＲ扩增及序列分析证实获得了ＣＤ３单抗轻链可变区基因的外显子。将其克隆到ｐＧＥＭ－ＬＰＣＲ中，切下完整的真核转录单位，与带有人Ｋａｐｐａ链恒定区基因及选择标记基因的表达载体相连接，成功地构建了抗ＣＤ３鼠／人嵌合轻链基因。此表达框架可用于多种抗体轻链可变区基因外显子的克隆及其真核转录单位的制备，大大简化了基因工程抗体的研制。     

抗癌胚抗原鼠人嵌合抗体重、轻链基因在昆虫细胞中的表达

本文采用杆状病毒表达系统在昆虫细胞(Sf_9,秋粘虫细胞)中表达了抗癌胚抗原(CEA)鼠-人嵌合抗体重、轻链基因.将鼠源性单抗杂交瘤细胞中已克隆到的重、轻链可变区(V_H、Vk)基因分别与人免疫球蛋白恒定区基因Cr_3、Ck相拼接,构建鼠人嵌合抗体基因.含嵌合抗体基因的转移载体与线性化病毒DNA共转染Sf_9细胞,并通过点杂交、PCR扩增和Southern blot分析获得重组病毒.Western blot分析表明以重组病毒感染的Sf_9细胞分别表达了嵌合重链和轻链,放射免疫分析法(RIA)和间接ELISA测定的结果表明嵌合重、轻链基因表达产物具有与CEA结合的能力.     

抗体轻链可变区基因真核表达框架及抗CD3鼠／人嵌合…

利用抗乙肝表面抗原的单抗２Ｈ１的轻链可变区基因的一部分，以核酸定点突变法引入ＭｌｕＩ限制性内切酶识别位点，构建了含有启动子、前导肽序列以及剪接共体信号等真核表达元件和“ＥｃｏＲＶ－ＭｌｕＩ”外显子克隆“匣”的通用的抗体轻链可变区基因真核表达框架ｐＧＥＭ－ＬＰＣＲ。从分泌ＣＤ８单抗的杂交瘤细胞中提取基因组ＤＮＡ，通过ＰＣＲ扩增及序列分析证实获得了ＣＤ３单抗轻链可变区基因的外显子。将其克隆到ｐＧＥＭ－     

人OX40胞外区基因的克隆、原核表达及单克隆抗体的制备

目的制备抗人OX40单克隆抗体,为进一步研究OX40/OX40L通路以及针对该通路进行疾病干预、疾病治疗和药物筛选奠定基础。方法 PCR扩增人OX40胞外区的基因序列,将其构建到原核表达载体pET-32a(+)中,利用大肠杆菌表达系统表达OX40胞外区蛋白,经Ni柱纯化后获得目的蛋白。以纯化的OX40胞外区蛋白为免疫原免疫小鼠,采用常规方法进行细胞融合,通过ELISA和多次克隆化培养,筛选出分泌特异性鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞株;通过ELISA、Western blot和免疫荧光检测抗体的效价及特异性。结果成功构建人OX40原核表达质粒pET-32a(+)-OX40,并在BL21(DE3)中诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定、Ni柱纯化、透析后获得OX40胞外区蛋白;以此纯化蛋白为免疫原,成功制备具有较强亲和力的单克隆抗体。结论克隆表达并纯化了人OX40蛋白,成功制备针对该蛋白的高亲和力单克隆抗体,为进一步研究OX40/OX40L的生物学功能奠定了实验基础。     

抗血小板膜糖蛋白单抗SZ—21嵌合Fab片段基因的构建和表达研究

目的 为降低抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体SZ－21的免疫原性,克隆了SZ－21可变区基因,构建并表达人－鼠嵌合Fab基因工程抗体。方法 利用基因克隆技术,从杂交瘤细胞系SZ－21克隆出轻、重链可变区基因,然后亚克隆到质粒pSW1中,构建成人－鼠嵌合Fab片段基因质粒pSZ-21,在大肠杆菌中表达。结果 pSZ－21基因构建正确,在大肠杆菌中表达出可溶性抗体片段,表达产物具有与血小板结合的活性。结论 成功地克隆了SZ－21可变区基因,并表达了可溶性人－鼠嵌合Fab基因工程抗体。     

抗人红细胞H抗原单链抗体基因克隆和表达

目的 克隆抗人红细胞H抗原单克隆抗体轻、重链可变区(VH、VL)基因并构建单链抗体(ScFv)基因及其表达载体,实现其在原核细胞中的表达.方法 从分泌抗人红细胞H抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株2FA中提取总RNA,采用RT-PCR法获得抗人红细胞H抗原单克隆抗体的VH、VL基因;利用重叠引物延伸法(splicing by overlap extension,SOE)将轻重链可变区基因连接,并引入连接肽(Linker)编码序列,构建VH-Linker-VL结构的单链抗体(ScFv)基因,将其克隆到原核表达载体pET-his中,转化BL21(DE3)plysS细胞,IPTG诱导表达;获得的目的蛋白经纯化后,用SDS-PAGE与Westem blotting对目的蛋白进行鉴定,间接EHISA、竞争ELISA和免疫荧光法检测目的蛋白的活性.结果 克隆的VH基因长度为351 bp,属于鼠抗体可变区重链基因家族I(B)亚群;VL基因长度为339 bp,属于鼠抗体可变区轻链基因家族I亚群;SOE法克隆的单链抗体基因为750 bp;构建的含原核表达载体的菌株经IPTG诱导后,SDS-PAGE及Western blotting法检测到Mr 32 000的目的蛋白(表达的ScFv);ScFv纯化后,经免疫荧光法、间接与竞争HLISA法检测到该ScFv蛋白具有生物结合活性.结论 成功地克隆了抗人红细胞H抗原单克隆抗体VH与VL基因和ScFv基因,构建ScFv基因的表达载体,实现了ScFv在大肠杆菌BL21(DE3)plysS细胞中的活性表达,为基于红细胞H抗原的免疫检测技术建立奠定了基础.     

Analysis of interleukin receptor gene expression in mouse fetal liver by quantitative polymerase chain reaction

We describe a simplified and sensitive polymerase chain reaction (PCR)-based method for the quantification of low-abundance RNA for mouse cytokine receptor genes. Accurate quantification is achieved in a two-step protocol which uses a synthetic RNA as an internal standard. The proper titration of the amount of mRNA molecules is followed by a kinetic analysis which ensures precise measurement. This quantitative PCR method provides a rapid and reliable way to quantify the amount of cytokine receptor mRNA in samples containing as few as 1000 molecules of RNA for a cytokine receptor target gene. We illustrate our approach by quantifying mRNA levels for two families of cytokine receptor genes in the fetal liver and bone marrow of the mouse. Our results reveal early and abundant expression of the genes encoding the signal transducing subunits interleukin-2 receptor γ and gp130. Their expression seems to precede that of the genes encoding the specific subunits of these interleukin receptor systems.     

nm23基因产物／NDPK在大肠癌中的表达及其临床意义

应用免疫组化Ｓ－Ｐ方法，研究１０３例大肠癌手术标本中ｎｍ２３基因产物／ＮＤＰＫ的表达及其意义。结果显示：大肠癌原发灶中ＮＤＰＫ表达阳性率７６．７％；其中，无区域淋巴结转移者阳性率为９０．５％，伴区域淋巴结转移者阳性率６７．２％，差异具有显著性意义（Ｐ＜０．０５）；随着大肠癌浸润肠壁深度和Ｄｕｋｅｓ＇分期的进展，原发灶中ｎｍ２３／ＮＤＰＫ表达阳性率逐渐下降，统计学均具有显著性意义（分别Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．０５）；ｎｍ２３／ＮＤＰＫ表达阳性者术后３、５年生存率分别为６５．８％和５４．４％，明显高于ＮＤＰＫ阴性患者术后３年和５年生存率（３７．５％和２０．８％），统计学具有显著性意义（分别Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．００５）。我们认为：ｎｍ２３基因在大肠癌的浸润和淋巴结转移过程中发挥负性调控作用。测定大肠癌组织中ｎｍ２３基因产物／ＮＤＰＫ的表达状况，有助于对大肠癌生物学行为的进一步了解及对患者预后的判断。     

G3BP单克隆抗体制备及G3BP在肿瘤组织中表达的检测

目的为了研究G3BP(Ras-GAP SH3-binding protein)的功能及作用机制,采用原核表达G3BP蛋白诱导免疫,制备抗G3BP单克隆抗体,并检测G3BP在临床常见肿瘤中的表达情况。方法采用原核表达载体pGEX-5X1,通过IPTG诱导,使用大肠杆菌BL21,高质量表达GST—G3BP融合蛋白。将纯化后的原核表达蛋白注射BAILB／c小鼠诱导产生免疫应答,采用经典杂交瘤技术制备单克隆抗体,并应用酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白免疫印迹和免疫组织化学染色ABC法进行抗体鉴定和肿瘤检测。结果筛选出分泌抗G3BP抗体的单克隆杂交瘤细胞,免疫球蛋白亚类鉴定为IgG1,蛋白免疫印迹及抗原竞争抑制实验表明该抗体是特异性抗G3BP抗体。石蜡切片免疫组织化学法检测临床标本,在肺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌等临床肿瘤活检标本中检出G3BP表达明显增高。在乳腺癌临床组织标本中,G3BP表达水平与c-erbB2表达正相关,与淋巴结转移正相关。结论成功制备了抗人G3BP单克隆抗体,所得到的特异性G3BP单克隆抗体能够应用于ELISA、Western蛋白免疫印迹以及免疫组织化学染色对不同样本的G3BP表达水平进行检测。G3BP在肺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤中表达明显增高。G3BP有可能作为肿瘤标志物辅助对乳腺癌预后的判断。     

带有引导序列的抗-D抗体可变区基因的扩增和序列分析

目的:从引导区扩增获得高度特异性和亲和力的抗-D抗体的可变区基因, 并进行序列分析。方法:提取1株分泌抗-D抗体的人B淋巴细胞株的总RNA, 从引导区设计引物, RT-PCR扩增抗-D抗体的可变区基因, 分别对扩增产物进行分子克隆和测序。结果:用重链引物和轻链引物分别扩增出440bp和410bp的特异带。序列分析表明, 其核苷酸及其所推导的氨基酸(AA)序列符合人Ig可变区基因的序列特征。结论:获得了抗-D抗体可变区基因, 为基因工程抗-D的研制及Rh新生儿溶血病的预防提供物质基础。     

Activation of human complement by mouse and mouse/human chimeric monoclonal antibodies

The complement (C)-activating capabilities in human serum of 32 mouse and 10 mouse/human chimeric MoAbs of different isotypes, and their fragments, were tested in vitro. Activation of C via the classical pathway (CP) was performed in 1% factor D-deficient serum in gelatin containing Veronal buffer in the presence of calcium and magnesium (GVB⁺⁺), while activation of the alternative pathway of C (AP) was assessed in 10% Clq-depleted serum in the presence of 5 mm MgCl₂ in GVB⁺⁺. The C-activating ability of MoAbs was expressed relative to the degree of activation of complement by aggregated IgG for the CP and relative to mouse IgG 1 for the AP. All of seven mouse IgG2a MoAbs were potent activators of the CP. The results of CP activation by IgG1, IgG2b and IgG3 isotypes were different for individual MoAbs. Only three (two IgG 1 and one IgG3) of 32 mouse MoAbs were potent activators of the AP. IgG2a and IgG2b were relatively poor AP activators. There were a few MoAbs which activated both the AP and CP. Of 10 chimeric MoAbs, two IgG1, one IgG2 and one IgG4 were poor or non-activators of the CP. On the other hand, IgG2 and IgG4 were good AP activators. IgG3 was the most potent AP activator. Most of the F(ab')₂ fragments were activators of the AP and displayed no activation of the CP. Fc fragments only activated the CP. whereas Fab'did not activate the CP or the AP. These studies suggest that the route of complement activation by class and subclass MoAbs can not always be predicted in advance and based only on their subclass identity.