太子参玉米黄质环氧化酶基因的克隆与表达分析

玉米黄质环氧化酶(zeaxanthin epoxidase,ZEP)在植物脱落酸(abscisic acid,ABA)生物合成间接途径中发挥着重要调节作用。该研究根据太子参转录组数据,克隆获得太子参的Pseudostellaria heterophylla玉米黄质环氧化酶基因,命名Ph ZEP。对其序列进行生物信息学分析,结果表明Ph ZEP的开放阅读框(open reading frame,ORF)为1 263 bp,编码420个氨基酸,预测其蛋白的相对分子质量为47.34 k Da,等电点(theoretical p I)为6.64;具有脂质蛋白附着点和黄素蛋白单加氧酶的特征性结构域,且在N端含有分泌信号肽。实时荧光PCR分析发现,Ph ZEP在叶片中表达量最高,其次是茎和须根;Ph ZEP在盛花期后10,40 d块根中的表达量较高;ABA处理后Ph ZEP表达量与对照组相当,经氟啶酮处理后Ph ZEP的表达量显著高于对照组。该研究从太子参中分离鉴定了ZEP基因,对后续研究其基因的功能特点和解析ABA在太子参生长发育过程的遗传调控提供研究基础。     

太子参2个赤霉素2-氧化酶基因的克隆与序列分析

目的克隆太子参Pseudostellariae Radix赤霉素2-氧化酶(gibberellin2-oxidase,GA2ox)基因,并进行生物信息学和表达分析。方法通过对太子参转录组数据库的分析,得到2个太子参GA2ox基因PhGA2ox1和PhGA2ox8。。采用反转录PCR(RT-PCR)和特异PCR技术获得2个基因的蛋白编码区(coding sequence,CDS),并对其编码的蛋白进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测基因的表达模式。结果生物信息学分析表明,PhGA2ox1和PhGA2ox8的CDS区分别长981和1 056 bp,编码326和351个氨基酸残基,蛋白相对分子质量分别为36 871.3和40 169.9,理论等电点为8.66和6.91,具有GA2ox的保守结构域DIOX_N和20G-Fell_Oxy,但均无明显疏水区,无跨膜结构域,无信号肽,为稳定蛋白。序列系统进化分析显示植物GA2ox蛋白可被分为3个亚类,PhGA2ox1和PhGA2ox8分别归入Class I和Class III亚类。qPCR分析显示,PhGA2ox1在不同组织器官中的表达基本恒定,而PhGA2ox8在块根木质部的表达量却显著高于在其他组织器官中的表达量(P0.05)。结论首次获得PhGA2ox1和PhGA2ox8基因的编码区序列,为进一步分析2个基因在太子参生长发育过程中的作用奠定了基础。     

太子参分解代谢关键酶8'羟化酶基因的克隆及生物信息学分析

ABA 8'羟化酶是脱落酸(abscisic acid,ABA)分解代谢中的关键酶基因之一。采用同源检索的方法从太子参转录组数据库中获得7个ABA 8'羟化酶(abscisic acid 8'-hydroxylase)基因家族成员,对各家族成员进行转录分析组数据以及ABA 8'羟化酶关键基因ABA8ox1编码区(coding sequence,CDS)的克隆与生物信息学分析。ABA8ox1基因CDS全长1 401 bp,编码480个氨基酸残基,等电点为8.55,相对分子质量为53 k Da,跨膜分析显示其为膜蛋白,1~21个氨基酸残基位于胞内,22~466个氨基酸残基位于胞外。转录组数据分析及定量PCR技术共同证明ABA8ox1在块根的韧皮部及须根中有较高的表达。多序列比对及聚类分析显示与其他植物CYP707A蛋白具有较高的同源性,且与模式植物拟南芥中ABA分解关键基因At CYP707A1和At CYP707A3聚为一类。该研究为太子参块根膨大及对逆境胁迫响应的分子机制奠定基础。     

太子参类胡萝卜素双加氧裂解酶家族4成员的克隆及表达特性分析

为探讨太子参环肽成分与品质形成的分子机制,利用生物信息学方法从太子参转录组数据库中筛选出太子参类胡萝卜素双加氧裂解酶(carotenoid cleavage dioxygenases,CCDs)新基因,并设计引物对其进行全长扩增及克隆、生物信息学分析和基因表达分析。克隆得到的4条CCDs序列全长分别为1 617,1 461,1 746,1 875 bp,并根据其功能依次命名为Ph CCD1,Ph NCED2,Ph NCED3,Ph CCD4。序列分析结果表明,4个基因均含有REP65结构域,且均含有与亚铁离子结合的位点。系统进化分析表明,Ph NCED2,Ph NCED3聚为NCEDs一支,Ph CCD1,Ph CCD4聚为CCDs一支,且与拟南芥Arabidopsis thaliana的At CCDs家族相比,Ph CCD1与At CDD1同源性最高,Ph CCD4与At CCD4同源性最高,Ph NCED2,Ph NCED3与At NCED3同源性最高。实时荧光定量分析显示Ph CCD1和Ph CCD4 2个基因的表达主要在地上部分,其中Ph CCD1在叶中的表达量最高,Ph CCD4在茎叶具有高表达,可能参与太子参类胡萝卜素的生物合成;Ph NCED2和Ph NCED3 2个基因的表达主要在地下部分,其中Ph NCED2在须根中表达量最高,Ph NCED3在块根木部和皮部表达量较高,可能是脱落酸生物合成的关键酶基因。研究首次得到太子参CCDs基因,为进一步阐明太子参植株对于外界胁迫的应答机制,进而探讨太子参品质形成的生物途径奠定基础。     

太子参危情分析

通过对太子参的价格走势分析,揭示太子参种植情况和2011年产量对市场行情的影响,提示业界关注太子参的发展。     

太子参危情分析

通过对太子参的价格走势分析,揭示太子参种植情况和2011年产量对市场行情的影响,提示业界关注太子参的发展。     

太子参鲨烯环氧酶基因的克隆及其表达分析

目的对太子参三萜类皂苷生物合成关键调控酶鲨烯环氧酶1(SQE1)基因进行全长c DNA克隆和功能分析。方法基于其他植物SQE基因的同源序列设计简并引物,以太子参块根总RNA为模板,RT-PCR结合RACE技术克隆太子参SQE1基因的全长c DNA,并进行生物信息学分析。利用农杆菌叶盘转化法将SQE1基因转化烟草,研究其对烟草总三萜量的影响。结果获得太子参SQE1基因全长c DNA序列2 038 bp,该序列包含1 554 bp的开放阅读框,编码517个氨基酸,相对分子质量为5.67×104,等电点为8.8,与其他药用植物的SQE蛋白具有较高的同源性,含有FAD结合结构域和4个跨膜区域,转太子参SQE1基因的烟草的总三萜量明显高于非转基因植株。结论首次克隆获得太子参SQE1基因的全长c DNA,该基因的异源表达可一定程度提高转基因植物的总三萜量,为阐明与应用太子参三萜类成分生物合成途径提供科学依据。     

桑黄HMGS基因克隆、分子特性及差异表达分析

目的对参与桑黄三萜合成途径的关键酶羟甲基戊二酰辅酶A合酶(3-hydroxy-3-methylglutaryCoAsynthase,HMGS)进行基因全长克隆、分子特性及差异表达分析研究。方法采用RACE技术克隆HMGS基因全长,并对其序列进行生物信息学分析;构建桑黄HMGS基因到表达载体pET-32a (+)上,转化大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导表达后SDS-PAGE检测;用荧光定量PCR的方法分析其不同发育阶段表达特性。结果 HMGS基因cDNA全长为1 930 bp,包含1个1 458 bp的完整开放阅读框,编码485个氨基酸。该基因编码蛋白的相对分子质量约为52 750,理论等电点是5.60,为亲水性蛋白,不具有跨膜结构,不含信号肽序列;系统发育分析表明,桑黄HMGS与地中海拟层孔菌Fomitiporia mediterranea中的HMGS同源性最高,属于一个分支。SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小与预测的蛋白相对分子质量基本一致。HMGS基因的转录水平在桑黄不同发育阶段呈动态变化,该基因在菌丝体阶段的转录水平要高于原基及子实体阶段的转录水平。HMGS基因的最高转录水平出现在第14天,为对照第5天的2.33倍。结论 HMGS基因的分子鉴定为进一步解析该基因在桑黄三萜类物质合成代谢途径中的分子调控作用奠定基础。     

太子参道地产区生态环境分析

目的 对太子参道地产区生态环境进行分析,为苏产太子参GAP实施和发展道地药材生产提供科学依据.方法 搜集、整理道地产区气象资料,用性状观察和理化测试分析土壤的理化性质.结果 太子参道地产区气候温暖湿润;土壤砂质,养分充足,重金属和农残量均达<土壤环境质量标准>(GB15618-19952001)二级标准.结论 太子参道地产区生态环境良好,符合无公害标准要求.     

太子参多糖含量分析及其动态研究

目的 分析不同采收期、贮藏期、生长条件及取材部位的太子参中多糖的含量,探讨太子参多糖的动态积累及其变化规律.方法 用HPLC-ELSD法测定多糖的含量.以葡萄糖为对照品,测定太子参多糖中葡萄糖含量,求出多糖换算因子,将样品液中测得的葡萄糖量换算出多糖含量.结果 不同生长期太子参中多糖的动态积累具有一定规律;贮藏时间对太子参中多糖含量具有一定影响;太子参野生品与栽培品、主根与参尾中多糖含量具有一定差异.结论 为太子参药材的采收、加工与贮藏及其质量评价提供了依据.     

野生太子参生物学特性的观察

目的:探讨野生太子参的生长发育状况及规律。方法:在生长期对野生太子参进行连续观察与研究。结果:其生长发育可分为无性生殖、无性生殖与有性生殖并存、有性生殖3个阶段,种子萌发第1、2年只有形成替代块根和茎生块根的无性生殖,此后块根发育的植株在继续无性生殖的同时,又出现开花结果的有性生殖,最后一年的太子参植株只有有性生殖而后生命终结。太子参地上植株的生长是从早春直至深秋,以块根越冬。无性生殖有春季的块根替代和秋季的匍匐茎上不定根膨大形成茎生块根两种方式。太子参的块根均来自不定根,块根的存在最长只有1年,2～3月是块根快速膨大期。结论:为栽培太子参的品种优育提供参考。     

太子参脱病毒苗的核糖体ITS序列研究

目的研究太子参脱病毒苗与外界苗rDNAITS区碱基序列的异同。方法运用PCR直接测序法对9种太子参脱病毒苗和4种外界苗的rDNAITS区（包括ITS1、5．8S、ITS2）碱基序列进行了序列测定。结果太子参脱病毒苗与外界苗的5．8S碱基序列完全一致，变异位点基本上位于ITS1的起始端与ITS2的终止端，其中江苏溧阳和安徽宣城的脱病毒苗变异位点较多。使用UPGMA法构建了系统发生树，从分子生物学角度说明了它们之间的内在联系。结论rDNAITS碱基序列的比较分析从分子水平上进一步阐明了脱病毒苗的遗传稳定性。     

基于化感效应筛选太子参的“相生”作物

目的:以期筛选出太子参的"相生"作物,建立合理的轮作模式。方法:采用土培方法培育2年生太子参,并系统研究紫苏茎叶、薏苡根、金银花、水稻茎叶的水提物对太子参存苗率、幼苗生长及相关生理指标的化感效应。结果:在未种植土和连作土的基质下,紫苏茎叶和水稻茎叶的水提物对太子参幼苗的存苗率、苗高、根长、根鲜重及叶绿素含量都具有化感促进作用,而对太子参幼苗的可溶性糖、丙二醛(MDA)、游离脯氨酸(Pro)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性都具有化感抑制作用,即紫苏和水稻均是太子参的"相生"作物;薏苡根和金银花的水提物对太子参幼苗的存苗率、苗高、根长、根鲜重及叶绿素含量都具有化感抑制作用,而对太子参幼苗的可溶性糖、MDA、游离Pro含量及SOD活性都具有化感促进作用,即薏苡和金银花均是太子参的"相克"作物;就综合化感效应而言,紫苏和水稻对太子参幼苗生长的化感作用强度为紫苏>水稻。结论:在实际生产中可采用紫苏-太子参轮作模式,从而减轻太子参的连作障碍现象和解决稻参轮作产生的大面积太子参种植地荒废搁置问题。     

Comparative chemical characters of Pseudostellaria heterophylla from geographical origins of China

Objective: Pseudostellaria heterophylla has been paid more attention in recent years, mainly as a medicine food homology plant. The content determination of P. heterophylla is not specified in the Chinese Pharmacopoeia (version 2020). The environmental conditions in different production areas could exert an influence on the quality of P. heterophylla. The purpose of this study is to discriminate P. heterophylla collected from different geographical origins of China. Methods: In this study, the content of polysaccharide in 28 batches of P. heterophylla was determined using phenol-sulfuric acid. HPLC fingerprints were established under optimised HPLC-PDA methods. Subsequently, the similarity analysis (SA) and the quantification of heterophyllin B were analyzed. The metabolites of P. heterophylla were identified and evaluated using UHPLC-Q Exactive HF orbitrap MS system. Principal component analysis (PCA), partial least squares discriminant analysis (PLS-DA), hierarchical cluster analysis (HCA) and orthogonal PLS-DA (OPLS-DA) were performed based on all peak areas. Results: The polysaccharide content in Guizhou and Jiangsu was higher than that of other production areas, which varied significant from different origins. While the content of heterophyllin B in Anhui and Jiangsu was high. The correlation coefficients of HPLC fingerprints for 28 batches samples ranged from 0.877 to 0.990, and the characteristic map can be used to identify and evaluate the quality of P. heterophylla. The samples from Fujian, Guizhou, Jiangsu provinces can be relatively separated using multivariate statistical analysis including PCA, PLS-DA, HCA, OPLS-DA, indicating that their metabolic compositions were significantly different. Ultimately, a total of 15 metabolites which were filtrated by a VIP-value > 1 and a P-value ＜ 0.05 associated with the separation of different origins were identified. Conclusion: HPLC fingerprint was established to evaluate the quality and authenticity of P. heterophylla. The present work showed that the difference of geographic distributions had an influence on the internal chemical compositions. A sensitive and rapid untargeted metabolomics approach by UHPLC-Q Exactive HF orbitrap MS was utilized to evaluate P. heterophylla from different origins in China for the first time. Overall, this study provides insights to metabolomics of P. heterophylla and supplies important reference values for the development of functional foods.     

不同品种不同采收期太子参中太子参环肽Pseudostellarin B含量的比较

目的分析比较不同品种不同采收期太子参环肽Pseudostellarin B的含量,为合理开发利用太子参的植物资源提供参考。方法不同品种不同采收期太子参经提取制备后,采用高效液相色谱测定太子参环肽Pseudostellarin B的含量。结果一号品种不同采收期太子参中Pseudostellarin B的平均含量为198.1μg/g,二号品种不同采收期太子参中Pseudostella-rin B的平均含量为105.8μg/g。结论不同品种不同采收期太子参中Pseudostellarin B的含量有差异。     

不同种质来源孩儿参的rDNA ITS区序列分析及鉴别

目的 通过分析不同种质来源孩儿参ITS序列,为孩儿参种内鉴别提供DNA分子标记.方法 利用特异性引物进行PCR扩增、克隆和测序,对孩儿参的rDNA ITS区间碱基序列进行测定,比较其差异.结果 参试的9个不同种质来源孩儿参的整个ITS长度变异为623～624 bp;其中ITS1为224 bp,G+C量为52.91％～54.26％;5.8 SrDNA为155 bp,G+C量为54.49％～55.13％;ITS2为244～245 bp,G+C量为55.55％～56.41％.整个ITS区共有17个变异位点(2.72％),ITS1、ITS2和5.8S的变异位点分别为7、7和3个,不同种质来源孩儿参均有若干个特异性的单核苷酸变异位点;各样品的序列同源性均在99.9％以上;序列间的遗传距离为0.003～0.013.显示了不同产地、不同种质孩儿参的变异是不超过1个种的范围内的变异.结论 可利用ITS区序列差异,鉴别不同种质来源的孩儿参.     

雷公藤单加氧酶基因全长克隆及表达分析

目的:单加氧酶(Monooxygenase,MO)是一类通过在底物上加一个氧原子的加氧酶,在动植物体内参与多种代谢途径。本实验致力于从雷公藤转录组数据中克隆得到单加氧酶基因c DNA全长,并对克隆得到的MO基因进行初步的功能分析。方法:通过对雷公藤转录组数据中筛选得到MO基因片段设计特异性引物,克隆MO基因c DNA全长,通过生物信息学方法对得到的MO基因进行分析,主要包括多重序列比对,蛋白结构预测和构建进化树分析等。结果:根据分析结果Tw MO基因全长为2 193 bp,共编码507个氨基酸,等电点为8.84,相对分子质量为55.20 k Da,多重序列比对显示它与其他植物的MO基因具有较高的同源性。雷公藤悬浮细胞经外源茉莉酸甲酯(Me JA)诱导后,实时荧光定量结果显示,TwMO的表达量明显增加,并在48 h达到最高,提示Tw MO基因与雷公藤的次生代谢产物的生成有关。结论:本研究首次从雷公藤悬浮细胞中克隆得到MO基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

珊瑚菜抗盐相关基因GlERF11克隆与盐胁迫表达分析＊

目的 鉴定珊瑚菜抗盐基因GlERF11并分析其在盐处理下的表达量变化。方法 对GlERF11基因进行全长克隆以及生物信息学分析，使用荧光定量PCR方法对GlERF11基因进行定量表达分析。结果 GlERF11基因cDNA全长1019 bp，开放阅读框全长537 bp，编码178个氨基酸。生物信息学分析显示，GlERF11蛋白为亲水性蛋白，无跨膜结构域，相对分子质量为19710.95 Da，包含AP2超家族保守结构域。系统进化树分析显示，GlERF11蛋白与伞形科植物胡萝卜ERF11蛋白亲缘关系较近。荧光定量分析显示，珊瑚菜幼苗的GlERF11基因受盐胁迫影响后表达量均有所提高，处理后12 h变化最为显著。结论 本研究针对珊瑚菜抗盐相关基因GlERF11开展生物信息学分析，研究为珊瑚菜品种改良以及育种提供了重要的理论基础与思路。     

北柴胡转录因子BcbZIP179的基因克隆及原核表达＊

目的 克隆北柴胡转录因子基因BcbZIP179的全长编码序列，原核表达融合蛋白。为进一步研究该基因在北柴胡转录调控中的功能提供理论依据。方法 以北柴胡转录组数据为基础，设计特异性引物，PCR扩增BcbZIP179基因的全长编码序列，利用生物信息学分析软件分析序列特征。利用qPCR方法分析BcbZIP179基因在不同组织器官中的表达及MeJA处理条件下的表达情况。构建原核表达载体，在不同温度和IPTG浓度下，采用2种菌株诱导表达目的蛋白。结果 BcbZIP179编码序列全长432 bp，编码144个氨基酸，BcbZIP179受MeJA诱导，在MeJA处理的北柴胡不定根中，处理前24 h内，表达量逐渐升高，随后表达量降低；BcbZIP179在北柴胡的根、茎、叶、花及果实中均有表达，在果实中的表达量最高；利用大肠杆菌原核表达系统，在16℃和37℃不同温度条件下均获得了带有6×His标签的BcbZIP179融合蛋白。结论 克隆到了北柴胡中的1个bZIP家族的转录因子基因BcbZIP179，在16℃、IPTG 0.05 mmol·L^-1条件下，可获得体外表达的蛋白，为制备抗体、分离互作蛋白和调控靶基因进而研究其功能奠定基础。     

基于多成分含量测定和化学计量学的不同基原白芷药材质量评价研究

目的 采用指纹图谱、多成分含量测定结合化学计量学方法分析和比较不同基原白芷药材（白芷Angelica dahurica和杭白芷Angelica dahurica var. formosana）的化学成分,为白芷药材的质量控制提供技术方法及数据支撑。方法 采用高效液相色谱法对白芷和杭白芷药材化学成分进行分析,建立不同基原白芷药材化学指纹图谱;在此基础上,对白芷和杭白芷药材中的花椒毒酚、水合氧化前胡内酯、白当归素、花椒毒素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素、珊瑚菜素和异欧前胡素9种香豆素类成分进行含量测定;进一步应用聚类分析、主成分分析及偏最小二乘判别分析等化学计量学方法对白芷与杭白芷进行区分与比较,寻找差异化合物。结果 建立了不同基原白芷药材的化学指纹图谱,共标定了11个共有峰,所建立的化学指纹图谱专属性良好,可用于白芷药材的质量评价;多成分含量测定和化学计量学结果表明,白芷和杭白芷药材中所含香豆素类成分种类无差异,但香豆素类成分含量有明显差异;佛手柑内酯、珊瑚菜素、异欧前胡素、氧化前胡素和花椒毒素为白芷和杭白芷药材间的差异性化合物,可以作为区分和鉴别二者的质量标志物。结论 基于指纹图谱...