大鼠BMSCs自发钙化过程中成骨相关基因表达谱的分析

目的分析大鼠BMSCs自发钙化过程中成骨相关基因表达谱的改变。方法取健康3日龄SD大鼠骨髓分离培养BMSCs并扩增至第4代,体外构建自发钙化模型。于培养7、14 d,倒置相差显微镜观察细胞生长状况及自发钙化进程,并行茜素红染色观察。分别于培养0、7、14 d时收集细胞进行基因芯片分析,并对差异表达基因进行生物信息学分析。实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)验证芯片分析结果。结果大鼠BMSCs在体外发生了自发钙化,并于培养7 d后细胞开始堆集,茜素红染色为弱阳性;培养14 d后细胞堆积明显并形成典型的茜素红染色阳性钙结节样结构。自发钙化过程中共检测到576个差异表达的基因探针,对应378个大鼠基因。其中0 d和7 d相比有359个差异表达的基因探针,而7 d和14 d相比只有13个差异表达的基因探针。差异表达基因依据表达模式不同可分为6类;依据生物学功能亲和关系,与骨细胞生物学密切关联的差异表达基因又可分为7大类,即血管生成、细胞凋亡、骨相关基因、细胞周期、发育、细胞通讯和成骨信号通路。基因功能关联性分析显示有12个在功能上联系密切的细胞周期类基因在自发钙化过程中发生了下调;此外,基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,Mmp13)、分泌型磷酸蛋白1(secreted phosphoprotein 1,Spp1)、Cxcl12、Mmp2、Mmp3、Apoe和Itga7与较多的差异表达基因存在功能上的联系。Spp1、Mgp、Mmp13、Wnt抑制因子1、Cxcl12和细胞周期素A2的RT-qPCR验证结果与基因芯片结果一致。结论细胞接种后的前7 d是决定大鼠BMSCs自发钙化的关键期。BMSCs自发钙化过程受细胞通讯类基因、骨相关基因、细胞周期类基因、TGF-β信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路和Wnt信号通路等多方面的共同调控。     

体外培养过程中去分化的人软骨细胞基因表达谱的变化

目的研究体外单层培养对人软骨细胞去分化的基因谱的影响,从而筛选出与人软骨细胞去分化的相关基因。方法取体外培养的第一代（P1）功能良好的人肋软骨细胞为对照组,而体外培养至第四代（P4）去分化的软骨细胞为实验组,取mRNA分别用Cy3,Cy5荧光标记,制作cDNA探针,采用BiostarH-80s含8300点的基因芯片表达谱分析P1及P4软骨细胞表达差异的基因,采用GenePixPro3.0软件分析,P1及P4人肋软骨细胞基因表达水平差异≥2倍时,被认为差异有统计学意义,重复3次。结果在8300点的相关基因中,P1及P4间存在差异的基因共140个,占总数的1.6%,其中在P4去分化软骨细胞中上升的基因56个,其中9条为与胞外基质降解及代谢相关基因,8条与应激、炎性反应相关基因,10条为生长抑制和细胞凋亡相关基因。而在P4中下调的基因84个,其中12条为蛋白质合成和能量代谢相关基因,16条为细胞周期和有丝分裂相关基因,12条为细胞骨架蛋白和信号传导相关基因。结论P4去分化细胞中基因表达特征为细胞外基质代谢失调,表现为基质合成相关基因表达下降,而降解酶类基因表达上升,应激与炎性反应亢进,凋亡蛋白合成增加,细胞分裂能力下降及离子转运能力下降,与软骨细胞去分化的病理生理特征相符。     

DNA微阵矩分析人软骨细胞体外老化过程中基因表达水平的变化

目的 研究成人软骨细胞体外单层培养老化过程中基因表达水平的变化，初步探索人软骨细胞老化发生的可能机制。方法 取体外培养的第1代(P)至第4代(P4)人肋软骨细胞，观察细胞增殖率，阿利新兰(Alcian blue)法定量检测硫酸软骨素蛋白聚糖聚集体(aggrecan)中糖胺多糖(GAGs)含量，RT-PCR分析Ⅰ、Ⅱ型胶原及aggreean基因表达量，以观察人软骨细胞体外老化过程。并采用DNA微阵矩技术对P1及P4软骨细胞表达差异的基因进行比较分析，P1及P4人肋软骨细胞基因表达水平差异≥2倍时，被认为差异具有显著性。结果 P4软骨细胞从细胞增殖率，细胞中GAGs含量，Ⅱ型胶原及aggrecan基因表达量分析均明显低于P1软骨细胞(P＜0．01)。在1000点的含有原癌基因、抑癌基因、细胞凋亡、应激反应蛋白基因和免疫相关基因的芯片分析中，P1及P4间存在差异的基因共36个，其中在P4中下调的基因11个，主要为细胞外基质、生长因子转录因子等，而在P4中上升的基因共25个主要为蛋白酶类、炎症因子及凋亡相关基因等。结论 P4软骨细胞呈现老化特征，通过DNA微阵矩技术发现P4老化细胞中基质合成相关基因表达下降，而降解酶类基因表达上升，致细胞外基质减少。且细胞增殖有关基因表达的减少及凋亡因子的增加，老化细胞增殖率下降；     

胃癌基因表达谱和蛋白质表达谱的分析研究

目的从转录组水平和蛋白质组水平寻找胃癌组织与正常胃组织间的差异表达基因和蛋白。方法应用含有14592个已知基因及表达序列标签的cDNA表达谱芯片获取基因表达谱信息．50％以上样本中Cy3／Cy5荧光强度比大于或等于2和小于或等于0．5的基因分别为在胃癌中表达上调或下调的基因。采用双向凝胶电泳（2-DE）分离32例经手术切除的胃癌患者的胃癌组织和正常胃组织总蛋白．对差异表达蛋白质点利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI—TOF—MS）进行分析．获取肽质量指纹图谱（PMF）。同时搜索SWISS-PROT数据库鉴定蛋白质。结果与正常组织相比．胃癌组织中差异表达基因共有387个,其中表达上调的有149个基因．上调超过3倍的有29个基因：表达下调的有238个基因．其中下调超过5倍的有21个基因。在蛋白质水平鉴定了15个差异表达蛋白．在肿瘤组织中高表达的有10个．其余5个在肿瘤组织中低表达。胃癌中过表达的基凶与蛋白产物主要与细胞骨架运动、细胞增殖及信号传导有关．表达下调的则主要与细胞免疫防御、毒理代谢有关。结论从转录组水平和蛋白质组水平对胃癌基因表达谱进行分析．不仅有助于从分子水平全方位理解胃癌的发病机制及生物学特性．同时也有助于进一步发现新的胃癌相关标志物和基因治疗的靶点。     

肌腱愈合过程中转化生长因子β1基因表达的变化

目的研究兔屈趾肌腱Ⅱ区伤口愈合过程中转化生长因子β1（transforming growth factorpβ1，TGF-β1）基因表达的变化。方法取成年新西兰大白兔60只，体重4．0～4．5kg，将左前中趾屈趾深肌腱切断并采用标准Kessler缝合法修复作为实验组，分别于术后1、7、14、21、28及56d获取肌腱及腱鞘进行观察，每个时间点取10只；同一动物的右前肢正常肌腱及腱鞘作为对照组。采用原位杂交和免疫组织化学染色分析TGF—β1的表达情况。结果原位杂交结果示：实验组TGF—β1mRNA在术后1d开始上调，14～21d达高峰，56d保持较高水平；对照组存在TGF—β1mRNA的表达，但表达水平较低；实验组各时间点TGF—β1mRNA表达与对照组比较，差异均有统计学意义（P〈O．05）。免疫组织化学染色：实验组术后1d，TGF—β1蛋白信号的表达增加，14～21d达高峰，56d仍保持一定水平；对照组术后各时间点存在TGF—β1蛋白信号表达，但表达水平较低。结论正常无损伤的肌腱和腱鞘能产生TGF—β1，当肌腱损伤后，细胞因子被激活，增加的细胞因子主要由肌腱细胞与腱鞘细胞产生，与肌腱的内、外源性愈合机制是一致的。     

腰椎间盘中转化生长因子β1的合成和基因表达

目的　观察腰椎间盘中内源性转化生长因子 β1(TFG - β1)表达分布规律及其细胞来源。 方法　采用免疫组化及原位杂交技术检测 16例胎儿期、8例生长期、12例成熟退变期和 2 7例突出椎间盘中TGF - β1蛋白合成和基因表达。结果胎儿椎间盘脊索细胞和类软骨细胞出现阳性免疫染色 ,并对TGF - β1mRNA呈强表达 ,阳性率为94 .3% (15 / 16 ) ;生长期椎间盘中软骨样细胞和成纤维细胞呈阳性表达 ,阳性率为 87.5 % (7/ 8) ,与胎儿期相比差别不显著 (P >0 .0 5 ) ,表达量低于胎儿期 (P <0 .0 5 ) ;成熟退变期阳性细胞明显减少 ;破裂型椎间盘突出组织中软骨样细胞、巨噬细胞呈阳性表达 ,阳性率为 37.4 % (10 / 2 7) ,低于胎儿期阳性率 (P <0 .0 5 )。结论　胎儿期、生长期和破裂型突出椎间盘组织可产生内源性TGF - β1,提示TGF - β1可能是腰椎间盘发育、生长和退变过程中重要调节因子。     

骨形态发生蛋白对体外培养胎儿关节软骨细胞胶原基因表达的影响及意义

为了解骨形态发生蛋白对关节软骨细胞的作用特点及意义，本研究用部分纯化的牛骨形态发生蛋白（ｂＢＭＰ）对胎儿关节软骨细胞进行诱导，并用人Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原的前胶原ｃＤＮＡ探针对被诱导关节软骨细胞进行原位杂交。结果发现，ｂＢＭＰ可明显增加被诱导软骨细胞中Ⅰ型胶原的表达，中断Ⅱ型胶原的表达，并轻度增加软骨细胞中Ⅲ型胶原的表达，但对Ⅳ型胶原的表达影响不大。本研究认为，ｂＢＭＰ诱导的软骨细胞胶原基因表达的这种改变是软骨细胞在向成骨细胞样细胞方向分化的标志。     

转化生长因子及其受体在体外培养软骨细胞中表达的改变

目的:探讨软骨细胞中转化生长因子β(transforming growth factor,TGF-β)及其受体TGF-β receptors(Tβ Rs)的表达在体外传代培养过程中的变化趋势,以及它对软骨细胞特有表型的影响.方法:采用猪耳软骨细胞在体外进行扩增传代,并收集第1～9代的细胞样品,作RT-PCR和Western杂交检测,从mRNA和蛋白水平来反映TGF-β1和T β Rs的表达.另取软骨细胞作爬片培养,用免疫组织化学法检测TGF-β1表达.结果:TGF-β1、TβRI和T β RII在第1～3代软骨细胞中表达减少的趋势较为平缓;第5～7代时,有大幅的向下跃迁;在第9代时仅微量表达或消失.与此同时,体外爬片培养软骨细胞仅在原代至第2代可见TGF-β 1表达,第3代以后则未见表达.结论:TGF-β 1和T β Rs表达的减弱与软骨细胞在体外培养过程中的老化进展可能有密切关系.     

转化生长因子β对人肾小管上皮细胞全基因表达谱的影响及其生物信息学分析

目的本研究探讨转化生长因子-β(TGF-β)对人肾小管上皮细胞(HK-2)基因表达谱的影响及相关生物信息学分析,为深入探讨和研究TGF-β对肾功能的影响及作用机制提供理论依据和实验基础。方法将体外培养的HK-2细胞随机分为正常对照组和TGF-β诱导组,培养48 h后取出,运用Illumina测序平台检测TGF-β对HK-2细胞基因表达谱的影响,并采用DAVID数据库对差异表达的基因(mRNA)进行其富集的GO功能和基于KEGG数据库的生物通路富集分析。实时定量RT-PCR用于验证基因表达谱结果。结果 TGF-β处理HK-2细胞48 h后,基因测序分析筛选出表达差异1.5倍的基因共279个,其中上调121个,下调158个,包括钙离子结合、脂质代谢、细胞黏附、血管钙化、炎症反应等相关的基因。RT-PCR验证结果基因测序分析结果一致。结论 TGF-β可能通过多条通路调控肾小管上皮的功能。     

三维体外血管新生模型中内皮细胞基因表达变化的芯片分析

目的 利用Affymetrix基因芯片分析体外血管新生过程中内皮细胞的基因表达变化。方法 将人微血管内皮细胞包被于微载体,进行三维培养,以构建体外血管新生模型,然后在模型不同时间点提取内皮细胞总RNA,采用Affymetrix芯片进行基因表达分析。结果 约1500个基因表达上调或下调2倍以上,其表达呈现不同变化方式。结论 本研究从全基因组水平动态观察了体外血管新生过程中内皮细胞的基因表达变化,并与特定的血管新生形态学过程相联系。研究结果提供了丰富的血管新生分子信息,为进一步研究特定基因在血管新生中的作用提示了方向。     

缺血再灌注小肠中DNA甲基化对细胞凋亡和增殖的调控

目的探讨缺血再灌注小肠中DNA甲基化对小肠细胞凋亡和增殖是否具有调控作用。方法将35只健康雄性Wistar大鼠随机分为正常组n=5）、假手术组n=5）及缺血再灌注（0、3、6、12、24h,n=5）组。利用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记测定法、透射电镜和免疫组织化学方法分别检测细胞凋亡和细胞增殖的变化,最后通过DNA甲基化位点组织末端酶链接检测法检测DNA甲基化。结果①与正常组和假手术组比较,缺血再灌注组缺血再灌注后3、6及12h时在小肠绒毛上皮、黏膜固有层及隐窝上皮中凋亡细胞均明显增加（P〈0．01）,且透射电镜检测证实,黏膜固有层的凋亡细胞主要是淋巴细胞和少量吞噬细胞。②与正常组和假手术组比较,缺血再灌注后3、6、12及24h时在小肠绒毛上皮中细胞增殖明显（P〈0．01）,缺血再灌注后6h和12h时在小肠黏膜固有层和隐窝上皮中细胞增殖明显（P〈0．01）。③正常组和假手术组DNA甲基化在小肠绒毛上皮和隐窝上皮部分有弱表达;在缺血再灌注组中,小肠隐窝上皮部分DNA甲基化在近小肠干细胞部位表达最强,从隐窝上皮到绒毛上皮是以从强到弱的趋势发生变化的。结论本研究的初步研究结果提示,缺血再灌注小肠中DNA甲基化可能对小肠细胞凋亡和增殖具有调控作用。     

增生性瘢痕形成和成熟过程中转化生长因子-β1及下游信号分子的基因表达变化

目的探讨转化生长因子(TGF)-β1及其下游信号分子smad2、smad3和smad4在伤后不同时期的增生性瘢痕中的基因表达变化规律及其可能的生物学意义。方法用病理学技术检测增生性瘢痕和正常皮肤的结构特征后,提取16例不同发生时期的增生性瘢痕(4月～11年)和8例正常皮肤的总RNA后,分离mRNA,用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法检测这4种基因在不同组织中的表达变化。结果TGF-β1、smad2、smad3和smad4基因在正常皮肤和增生性瘢痕中都有表达。TGF-β1在不同组织中表达水平相近似。与正常皮肤相比,smad2、smad3和smad4基因的转录产物含量在增殖期的瘢痕中明显升高,在成熟期的瘢痕中smad2基因表达量恢复到正常皮肤水平,而smad3和smad4基因表达虽有所减弱,但两种基因的mRNA含量仍明显高于正常皮肤(P<0.05)。结论信号分子smad2、smad3和smad4基因表达增强可能是增生性瘢痕形成的机制之一,而smad2表达降低,其介导的信号通路减弱可能与增生性瘢痕达到相对稳定的成熟状态有关。     

17β-雌二醇对体外培养人成骨细胞CTGF和PAIP-1基因表达的作用

目的　观察结缔组织生长因子 (CTGF)和多聚腺苷酸结合蛋白相互作用蛋白 1(PAIP 1)mRNA在体外培养的人成骨细胞增殖分化不同阶段的表达 ,研究 17β- 雌二醇 (E2 )对成骨细胞CTGF和PAIP 1mRNA表达的作用 ,探讨雌激素对骨组织保护作用的新机制。方法　用改良的钙 钴法ALP染色 ,vanGieson法 1型胶原染色 ,0. 1%茜素红矿化结节染色 ,半定量RT- PCR检测成骨细胞碱性磷酸酶 (ALP)、骨钙素 (OC)和 1型胶原mRNA的表达 ,半定量RT- PCR和Northernblot方法检测成骨细胞CTGF和PAIP- 1mRNA表达。结果　半定量RT -PCR和组织化学染色的结果均表明 ,成骨细胞接种培养后 0～11d为细胞增殖阶段 ,7～ 15d为骨基质成熟阶段 ,15d后为骨基质矿化阶段 ;在成骨细胞培养的不同阶段 ,均检测到CTGF和PAIP- 1mRNA的表达 ,E2 可显著下调成骨细胞CTGFmRNA的表达 ,呈时间剂量依赖关系 (P <0 . 0 1) ,但对PAIP 1mRNA表达无明显作用。结论　E2 时间剂量依赖性下调成骨细胞CTGFmRNA的表达 ,但对PAIP 1mRNA表达无明显影响。     

体外冲击波治疗兔缺血性股骨头坏死过程中骨形态发生蛋白的表达

我们通过观察骨形态发生蛋白(BMP)-2在体外冲击波治疗股骨头缺血坏死过程中的表达特点,探讨其治疗机制. 一、材料与方法 1.实验模型及分组:成年新西兰大白兔30只,体质量3.0～4.0kg,由武汉大学医学院实验动物中心提供.参照Yamamoto等[1]的方法,30只家兔接受10 μg/kg的脂多糖静脉注射,24 h后重复1次,然后每隔24 h注射40 mg/kg甲基泼尼松龙1次,共3次.     

大鼠中枢和外周神经损伤后胞体分布区神经组织基因表达谱的分析

目的分析中枢和外周神经损伤后胞体分布区神经组织多基因表达谱的差异,探讨中枢和外周神经轴突损伤后再生差异的分子机制.方法12只Wistar雄性大鼠随机分为右侧坐骨神经夹伤和胸段脊髓半横断两组.手术后7d,用cDNA Microarray技术检测1176个已知基因在与受损神经相应胞体分布区神经组织表达的变化,并分析其在中枢和外周神经损伤后表达的差异.结果cDNA Microarray分析的数据显示,有74个基因在外周和中枢神经损伤后同时变化,其中29个基因变化趋势一致,12个基因表达上调,17个基因表达下调.呈反向变化的基因有45个.结论中枢和外周神经轴突损伤后,多种结构、功能基因表达发生变化;外周和中枢神经损伤后多种结构、功能基因表达存在明显的差异.     

藻酸盐和单层培养中椎间盘细胞基因表达的差异性

椎间盘的不同部位有不同种类的细胞群,虽然培养基条件对这些细胞的基因表现型的影响作用还知之甚少,但这些细胞可以在体外培养的条件下表现出显著的     

癃必消胶囊对体外培养的人前列腺增生间质细胞Fibronectin和Collagen IV基因表达的影响

目的 研究中药癃必消胶囊对体外培养的人前列腺增生间质细胞Fibronectin和Collagen IV基因表达的影响.方法 把含癃必消胶囊的药物血清加入到体外培养的人前列腺增生间质细胞中、采用实时定量RT-PCR等相关技术,检测Fibronectin和Collagen IV在体外培养的人前列腺增生间质细胞中的表达.结果 癃必消胶囊能降低体外培养的前列腺增生间质细胞Collagen IV基因的表达,对Fibronectin基因的表达无明显规律.结论 癃必消胶囊通过抑制前列腺间质细胞Collagen IV基因的表达达到治疗前列腺增生的目的.     

骨形态发生蛋白诱骨发生过程中TGF-β1和bFGF的表达

目的 :研究转化生长因子 -β1(TGF β1)和碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)在骨形态发生蛋白 (BMP)诱骨发生过程中的表达情况。方法 :应用免疫组化方法检测TGF β1、bFGF和增殖细胞核抗原 (PCNA)在BMP植入小鼠股部肌肉后不同天数的表达情况。结果 :术后早期聚集的大量间充质细胞只表达PCNA ,而不表达TGF β1和bFGF ,但随着间充质细胞分化为前软骨细胞并不断成熟 ,两因子的表达水平迅速提高。TGF β1在成熟软骨细胞中的表达最活跃 ,之后开始下降 ,而bFGF在成熟软骨细胞进入钙化期后仍为高表达。成骨细胞中TGF β1和bFGF的表达均不活跃。结论 :TGF β1和bFGF在BMP诱骨发生的软骨细胞阶段有强烈表达 ,在间充质细胞和成骨细胞中不表达或低表达     

癃必消胶囊对体外培养的人前列腺增生间质细胞Fibronectin和Collagen Ⅳ基因表达的影响

目的研究中药癃必消胶囊对体外培养的人前列腺增生间质细胞Fibronectin和Collagen Ⅳ基因表达的影响。方法把含癃必消胶囊的药物血清加入到体外培养的人前列腺增生间质细胞中、采用实时定量RT-PCR等相关技术，检测Fibronectin和CollagenⅣ在体外培养的人前列腺增生间质细胞中的表达。结果癃必消胶囊能降低体外培养的前列腺增生间质细胞CollagenⅣ基因的表达，对Fibronectin基因的表达无明显规律。结论癃必消胶囊通过抑制前列腺间质细胞CollagenⅣ基因的表达达到治疗前列腺增生的目的。